國立臺灣大學公共衛生學院 職業醫學與工業衛生研究所
碩士論文
Graduate Institute of Occupational Medicine and Industrial Hygiene College of Public Health
National Taiwan University Master Thesis
金黃色葡萄球菌空氣採樣方法效能評估-暴露艙研究
A Chamber Study on Assessment of Sampling Techniques for Airborne Staphylococcus aureus
王儷瑾 Wang, Li-Jin
指導教授：張靜文、黃耀輝 博士
Advisor: Chang, Ching-Wen, Ph.D.、Hwang, Yaw-Huei, Ph.D.
中華民國 102 年 7 月
July, 2013
致謝
兩年前，當我選擇從醫技跨領域至公衛領域學習的那一刻，這一條瞭解自我 與提升自信的路便已展開，而研究生涯中體識最深的，是時間管理與如何運用邏 輯思考與限有資源解決問題。這本論文即是在面臨大大小小的荊棘中仰賴許多老 師、學長姐與同學們的支持與幫助才得以完成的，它是甜美的、並且對我而言深 具意義的成果。
首先，感謝我的指導老師張靜文老師，我一直對您在我進入碩班時說過的一 句話印象深刻，您說，只要你想解決問題，你會找到一個方法，而一旦你想逃避 問題，你會找到一個藉口。兩年來，在幾次面臨研究瓶頸而感到沮喪時，我就會 用這句話來提醒我自己，最讓我感動的是，老師一直都很用心看待我所面臨的困 難，教我如何透過有邏輯的思考分析問題，並設計實驗找到可能的解答。在老師 身上始終如一的認真與嚴謹，是我在往後的日子裡，期許自己能夠學習並堅持的。
感謝口試委員黃耀輝老師、余國賓老師與吳佩芝老師，謝謝你們給予本研究 許多精闢的建議，使我的論文可以更完整的呈現，也謝謝你們對於研究的鼓勵與 肯定。此外，當我面臨氣膠系統與採樣實驗等問題時，感謝黃盛修老師的建議與 幫忙，並協助我完成實驗。也謝謝曾俊傑老師與趙馨老師提供生物氣膠採樣器讓 我進行採樣，因此能順利完成研究。
感謝氣膠實驗室的學長與同學們，在系統出現問題時，即時提供幫助與寶貴 建議。感謝芳禎學姐不厭其煩的教我如何進行採樣效能評估實驗，也謝謝星儀學 姊告訴我關於金黃色葡萄球菌之培養方法。感謝念慈學姊、忠龍學長與雅婷學姊 在我最徬徨的碩一時，給與我很多的鼓勵與建議。感謝實驗室好夥伴佳蓉與楚雲，
總是能互相加油打氣，實驗室所幸有妳們兩位的把關，使我在做實驗時無後顧之 憂。感謝學弟妹們與同屆的好朋友們，讓我的碩士生活增添許多美好的回憶。
最後，感謝我的家人，因為你們一直以來的鼓勵與包容，才有如今的我，無 論面對多少挫折，你們都是我最大的後盾，希望我的努力能讓你們感到欣慰與驕 傲！
王儷瑾 謹致於 國立台灣大學職業醫學與工業衛生研究所 中華民國102 年 7 月
II
中文摘要
研究指出金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可透過直接接觸或空氣傳 播造成人員感染，為醫院院內感染常見之病原菌；此外，在畜養家禽場所、紡織、
麵粉與食品相關工作環境中亦發現 Staphylococcus spp.為空氣中主要菌種之一。抗 藥性金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）之出現，亦導致 在治療此細菌感染時變得更為棘手。
有效監測此致病菌在職業場所空氣中是否存在及其濃度值，將有助於釐清勞 工暴露風險；然何種採樣策略最能有效捕集空氣中的 S. aureus，目前仍不清楚。
有鑑於此，本研究透過建置生物氣膠產生系統，評估不同採樣介質與生物氣膠採 樣器針對 S. aureus 之採樣效能。在評估 S. aureus 培養基部分，係以 Andersen 1-STG 搭配TSA、MSA、BPA、CSA 與 CSM 進行 6 分鐘之空氣採樣，而後以培養法分 析並計算不同培養基之效能指標（R）。結果顯示，非選擇性培養基 TSA 之 R 值 顯著高於四類選擇性培養基之R 值（Kruskal Wallis test, p = 0.0092, Scheffé test, p <
0.05）；而選擇性培養基中，以 MSA 採樣效能最高，然與其他三種選擇性培養基 並未達統計上顯著差異。而後以Andersen 1-STG 搭配具較佳空氣採樣效能之 TSA 與MSA 評估時間因子對採樣效能之影響，結果顯示兩種培養基均於採樣 3 分鐘時 具有最佳之採樣效能（Kruskal Wallis test, TSA：p = 0.008, MSA：p = 0.0447, Scheffé test, p < 0.05），而 6 至 60 分鐘採樣所得之 R 值彼此間則未達統計顯著差異。
評估 S. aureus 收集液部分，係以 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture、PBS 與 DW 進行3 分鐘之採樣。結果顯示，Tween 80 mixture 之 R 值皆顯著高於其他兩種收集 液之R 值，而PBS 之 R 值顯著高於 DW 之 R 值（Kruskal Wallis test, p = 0.0002, Scheffé test 事後檢定, p < 0.05）；接著以AGI-30 與 BioSampler 搭配三種收集液進 行3、6 與 15 分鐘空氣採樣以評估流失率。結果顯示，採樣時間自 3 分鐘延長至 15 分鐘時，流失率顯著上升（Kruskal Wallis test, p < 0.0001, Scheffé test, p < 0.05）。 而後評估AGI-30 與 BioSampler搭配具較佳空氣採樣效能之Tween 80 mixture 與 PBS，於不同採樣時間下之採樣效能，結果顯示採樣器搭配 Tween 80 mixture採樣 6 分鐘時之採樣效能顯著高於 3 分鐘之 R 值（Kruskal Wallis test, AGI-30：p = 0.0013, BioSampler：p = 0.0018, Scheffé test 事後檢定, p < 0.05），大於15 分鐘之 R 值即隨 採樣時間延長而下降；採樣器搭配PBS 採樣時，其採樣效能於不同採樣時間下彼
此間皆具顯著差異（Kruskal Wallis test, AGI-30：p = 0.0014, BioSampler：p = 0.0011, Scheffé test 事後檢定, p < 0.05），且隨採樣時間增加而下降。
將所有採樣方法之Ｒ值進行統計檢定，結果顯示，BioSampler 搭配 Tween 80 mixture 之採樣效能最佳，顯著高於其他五種採樣方法；BioSampler 搭配 PBS 以及 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 次之，而 AGI-30 搭配 PBS 之採樣效能最差（Kruskal Wallis test, p < 0.0001, Scheffé test 事後檢定, p < 0.05）。
本研究進一步根據文獻與本實驗結果，對 S. aureus 實場空氣採樣策略之建議，
依採樣目的分為兩項：
1. 若欲進行環境空氣中 S. aureus 濃度監測，本研究建議使用BioSampler 搭配 PBS 進行前測。於經消毒控制之環境，建議前測時間為 30 與 60 分鐘，後續將收集液 濃縮至0.2mL 進行培養法分析。於無特定 S. aureus污染源或未經消毒控制之環境，
建議前測時間為6-60 分鐘，其中採樣時間為 6-15 分鐘時，可將收集液濃縮至 0.2 mL
；若採樣時間延長為30-60 分鐘時，可將收集液濃縮至0.2 mL、0.5mL 或 1mL 後 再進行培養法分析。此外，於空氣中 S. aureus濃度較高之環境採樣時，則建議前 測時間為3-60 分鐘，收集液可濃縮至 1mL 或直接經適當稀釋以培養法分析。
2. 若欲進行空氣中可培養性 S. aureus 之定性分析，此時建議可以BioSampler搭配 Tween 80 mixture 進行 30-60 分鐘之空氣採樣，採樣中並定時補充收集液。
本研究成果預期未來可應用於實際職場環境中，用以有效監測空氣中致病菌，
協助決策者採取適當的控制策略，減少院內感染並保護勞工健康。
關鍵字：生物氣膠、金黃色葡萄球菌、採樣效能、生物氣膠採樣器
IV
Abstract
Previous studies have indicated that Staphylococcus aureus may be spread via respirable-sized aerosols and transmitted by direct contact and airborne route.
Staphylococcus spp. are revealed as the dominant bacteria in poultry houses and textile, flourmill and food-related factories. In particular, the emergence of methicillin- resistant S. aureus results in difficult-to-treat infections. However, limited research has been conducted to investigate the sampling methods for airborne S. aureus. To deal with this issue, a bioaerosol generation system was developed to evaluate the performance of various sampling methods for collecting airborne S. aureus.
Sampling performance (R) of five agar plates for recovering airborne S. aureus was determined by 6-min sampling using Andersen 1-STG followed by the culture assay. Results showed that the non-selective agar TSA performed significantly better than the other four selective agar types (Kruskal Wallis test, p = 0.0092, Scheffé test, p
< 0.05). For the four selective agar media, the MSA performed best but at no statistical significance compared with the other three. The effects of sampling time on the performance of Andersen 1-STG for collecting airborne S. aureus onto TSA and MSA showed that the R with 3 min-sampling was significantly greater than those of the other sampling times regardless of agar type (Kruskal Wallis test, TSA：p = 0.008, MSA：p = 0.0447, Scheffé test, p < 0.05), while there was no statistical difference in sampling performance among the sampling times between 6 and 60 min.
In addition, the sampling performance of three collection liquid types for recovering airborne S. aureus was determined by 3-min sampling using AGI-30 followed by the same assay. It shows that no matter what kind of agar arranged, Tween 80 mixture performed significantly better than the other two liquid types (Kruskal Wallis test, p = 0.0002, Scheffé test, p < 0.05), PBS the second. As for the loss rate of three collection liquid types for sampling airborne S. aureus was determined by 3, 6 and 15-min sampling using AGI-30 and BioSampler. Results indicated that there was no statistical difference in loss rate among the three liquid types. Also, liquid-based samplers showed no statistical significance compared with each other. When sampling time was extended from 3min to 15 min, however, there was a statistical increasing in loss rate (Kruskal Wallis test, p < 0.0001, Scheffé test, p < 0.05). Moreover, the effects of sampling time on the performance of AGI-30 and BioSampler for recovering
airborne S. aureus with Tween 80 mixture showed that the R with 6 min-sampling was significantly greater than those of the other sampling times, including 3 min-sampling (Kruskal Wallis test, AGI-30：p = 0.0013, BioSampler：p = 0.0018, Scheffé test, p <
0.05). The aforementioned results may be attributable to the proliferation of S. aureus collected in Tween 80 mixture. For the effects of sampling time on the performance of AGI-30 and BioSampler arranged with PBS, results showed that the performance of them decreased significantly with prolonged sampling time (Kruskal Wallis test, AGI-30：p = 0.0014, BioSampler：p = 0.0011, Scheffé test, p < 0.05).
In summary, the performance of BioSampler arranged with Tween 80 mixture was the best. BioSampler and AGI-30 arranged with PBS and Tween 80 mixture, respectively, the second. Further, AGI-30 arranged with PBS gave the worst performance (Kruskal Wallis test, p < 0.0001, Scheffé test, p < 0.05).
The advisable sampling strategy depends on the purpose of sampling. To monitor the concentration of airborne S. aureus in environment, the sampling carried out for 15 min with BioSampler equipped with PBS is recommended. Furthermore, to performe the qualitative analysis of airborne S. aureus, the sampling conducted for 30-60 min with BioSampler equipped with Tween 80 mixture is applicable. It is expected that this study will be able to be applied in occupational and residential environment to effectively identify and monitor concentration of airborne S. aureus.
Keywords: airborne, Staphylococcus aureus, sampling performance, bioaerosol samplers
VI
目錄
致謝 ... I 中文摘要 ... II Abstract ... IV 目錄 ... VI 圖目錄 ... X 表目錄 ... XI
第一章 前言 ... 1
1.1 研究背景 ... 1
第二章 文獻回顧 ... 3
2.1 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ... 3
2.1.1 生物特性 ... 3
2.1.2 健康影響 ... 3
2.1.3 空氣傳播 ... 4
2.1.4 空氣採樣研究 ... 5
2.2 金黃色葡萄球菌之固體培養基 ... 10
2.2.1 非選擇性培養基 ... 10
2.2.2 選擇性培養基 ... 10
2.2.3 金黃色葡萄球菌鑑定 ... 14
2.2.3.1 鑑定準確度 ... 14
2.2.3.2 選擇性培養基相關鑑定研究 ... 15
2.3 生物氣膠收集液 ... 18
2.4 生物氣膠採樣器 ... 19
2.4.1 以固體培養基為採樣介質之採樣器（Agar-based samplers） ... 19
2.4.1.1 安德森單階式生物氣膠採樣器（Andersen one stage sampler， Andersen 1-STG） ... 19
2.4.1.2 時間因子對採樣效能之影響 ... 19
2.4.2 以液體為採樣介質之採樣器（Liquid-based samplers） ... 20 2.4.2.1 液體衝擊瓶（All glass impinger，AGI-30）與離心式採樣器
（BioSampler） ... 20
2.4.2.2 時間因子對採樣效能之影響 ... 20
第三章 研究目的 ... 21
第四章 研究架構 ... 23
第五章 材料與方法 ... 25
5.1 實驗菌株 ... 25
5.2 實驗用培養基、培養液與採樣收集液 ... 25
5.2.1 Tryptic Soy Agar（TSA） ... 25
5.2.2 Mannitol Salt Agar（MSA） ... 25
5.2.3 Baird-Parker Agar（BPA） ... 26
5.2.4 CHROMagar Staph aureus Agar（CSA） ... 26
5.2.5 Chapman Stone Medium（CSM） ... 26
5.2.6 Luria-Bertani（LB）broth ... 26
5.2.7 Phosphate buffer saline（PBS） ... 27
5.2.8 Tween 80 混合液 ... 27
5.3 置備與建立金黃色葡萄球菌檢量線 ... 27
5.4 金黃色葡萄球菌菌液濃度之調整 ... 28
5.5 S. aureus 氣膠產生系統 ... 28
5.6 S. aureus 氣膠產生系統之穩定性測試 ... 31
5.6.1 濕空氣、乾空氣與生物氣膠產生器之流量 ... 31
5.6.2 暴露艙相對濕度 ... 31
5.6.3 生物氣膠產生器（Nebulizer）中 S. aureus 菌液濃度 ... 31
5.6.4 暴露艙生物氣膠濃度 ... 32
5.6.5 採樣效能指標（R） ... 32
5.6.6 S. aureus 粒徑分佈 ... 33
5.7 空白試驗 ... 33
5.8 S. aureus 空氣採樣方法之效能評估 ... 34
5.8.1 以固體培養基為採樣介質之採樣器（Agar-based samplers）效能評 估 ... 34
5.8.1.1 選擇 S. aureus 最佳空氣採樣培養基 ... 34
VIII
5.8.1.2 採樣時間對 Andersen 1-STG 採樣效能之影響 ... 37
5.8.2 以收集液為採樣介質之採樣器（Liquid-based samplers）效能評估 ... 38
5.8.2.1 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之採樣效能 ... 38
5.8.2.2 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之流失率 ... 41
5.8.2.3 時間因子對 AGI-30 與 Biosampler 採樣效能之影響 ... 42
5.9 資料分析 ... 43
第六章 結果 ... 45
6.1 S. aureus 氣膠產生系統之穩定性測試 ... 45
6.1.1 濕空氣、乾空氣與生物氣膠產生器流量 ... 45
6.1.2 暴露艙相對濕度 ... 47
6.1.3 生物氣膠產生器中 S. aureus 菌液濃度 ... 49
6.1.4 暴露艙空氣中 S. aureus 濃度 ... 50
6.1.5 採樣效能指標（R） ... 51
6.1.6 S. aureus 粒徑分佈 ... 54
6.2 以固體培養基為採樣介質之採樣器效能評估 ... 56
6.2.1 選定最佳空氣採樣培養基 ... 56
6.2.2 時間因子對 Andersen 1-STG 採樣效能之影響 ... 58
6.3 以收集液為採樣介質之採樣器（Liquid-based samplers）效能評估 ... 64
6.3.1 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之採樣效能 ... 64
6.3.2 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之流失率 ... 66
6.3.3 時間因子對 AGI-30 採樣效能之影響 ... 69
6.3.4 時間因子對 BioSampler 採樣效能之影響 ... 75
6.3.5 以收集液為採樣介質之生物氣膠採樣方法比較 ... 79
6.3.5.1 BioSampler 與 AGI-30 之採樣效能 ... 79
6.3.5.2 Tween 80 mixture 與 PBS 之採樣效能 ... 79
6.3.5.3 BioSampler 與 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 與 PBS 之採樣 效能 ... 79
6.4 Andersen 1-STG、AGI-30 與 BioSampler 之採樣效能比較 ... 81
第七章 討論 ... 83
7.1 S. aureus 氣膠產生系統 ... 83
7.2 以固體培養基為採樣介質之採樣方法效能評估 ... 84
7.2.1 選定 S. aureus 最佳空氣採樣培養基 ... 84
7.2.1.1 非選擇性與選擇性培養基 ... 84
7.2.1.2 選擇性培養基 ... 85
7.2.1.3 鑑定流程 ... 88
7.2.2 時間因子對 Andersen 1-STG 採樣效能之影響 ... 93
7.3 以收集液為採樣介質之採樣方法效能評估 ... 97
7.3.1 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之採樣效能 ... 97
7.3.1.1 Tween 80 mixture ... 97
7.3.1.2 PBS 與 DW ... 101
7.3.2 時間因子對 AGI-30 與 BioSampler 採樣效能之影響 ... 102
7.3.2.1 採樣時間 ... 102
7.3.2.2 AGI-30 與 BioSampler 之採樣效能差異 ... 105
7.3.2.3 菌種之採樣效能差異 ... 106
7.4 Andersen 1-STG、AGI-30 與 BioSampler ... 108
7.5 採樣策略 ... 110
7.6 研究限制 ... 115
7.7 結論與建議 ... 116
附錄 ... 119
參考文獻 ... 137
X
圖目錄
圖 1 研究流程 ... 24
圖 2 S. aureus 生物氣膠產生系統 ... 30
圖 3 選擇 S. aureus 最佳空氣採樣培養基之實驗流程 ... 35
圖 4 探討時間因子對 Andersen 1-STG 採樣效能的影響之實驗流程 ... 38
圖 5 S. aureus 採樣收集液與採樣時間之效能評估 ... 40
圖 6 S. aureus 空氣採樣收集液之流失率測試 ... 42
圖 7 濕空氣、乾空氣與生物氣膠產生器（Nebulizer）之流量值 ... 46
圖 8 暴露艙中相對濕度測試值 ... 48
圖 9 Nebulizer 中 S. aureus 菌液濃度 ... 49
圖 10 暴露艙空氣中 S. aureus 濃度 ... 50
圖 11 Nebulizer 中 S. aureus 菌液濃度與暴露艙空氣中 S. aureus 濃度隨系統運作下 降趨勢圖 ... 52
圖 12 採樣效能指標（R） ... 53
圖 13 以氣動粒徑分析儀（Aerodynamic particle sizer）所得暴露艙中高濃度 S. aureus 之粒徑分佈 ... 54
圖 14 以氣動粒徑分析儀（Aerodynamic particle sizer）所得暴露艙中中濃度 S. aureus 之粒徑分佈 ... 55
圖 15 以 Andersen 1-STG 搭配 MSA 採樣 60 分鐘後，將培養基置於 37℃下培養 18 至 48 小時之 S. aureus 菌落圖片 ... 63
圖 16 以 AGI-30 搭配 PBS 進行不同時間之空氣採樣時 Nebulizer（Csusp）與暴露 艙空氣中細菌濃度（Cair） ... 69
圖 17 以 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 進行不同時間之空氣採樣時 Nebulizer（Csusp） 與暴露艙空氣中細菌濃度（Cair） ... 70
表目錄
表 1 Staphylococcus aureus 與 MRSA 之空氣採樣研究 ... 8
表 2 Staphylococcus aureus 之空氣採樣培養基 ... 12
表 3 Staphylococcus aureus 鑑定相關名詞 ... 14
表 4 Staphylococcus aureus 之生化測試 ... 17
表 5 生物氣膠收集液 ... 18
表 6 五種 S. aureus 培養基之空氣採樣效能（R）與統計檢定結果 ... 57
表 7 TSA 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 60
表 8 MSA 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 61
表 9 TSA 與 MSA 之採樣效能（R）統計檢定 ... 62
表 10 三種收集液之空氣採樣效能（R）與統計檢定結果 ... 65
表 11 BioSampler 與 AGI-30 搭配三種收集液於採樣時間 3、6 與 15 分鐘下之液體 流失率 ... 67
表 12 不同收集液與採樣時間之液體流失率統計檢定 ... 68
表 13 BioSampler 與 AGI-30 之液體流失率統計檢定 ... 68
表 14 AGI-30 搭配 PBS 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 72
表 15 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 74
表 16 BioSampler 搭配 PBS 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 76
表 17 BioSampler 搭配 Tween 80 mixture 於不同採樣時間下之採樣效能（R） ... 78
表 18 BioSampler 與 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 與 PBS 之採樣效能（R）統計 檢定 ... 80
表 19 Andersen 1-STG、BioSampler 與 AGI-30 之採樣效能（R）統計檢定 ... 82
表 20 選擇性培養基之比較 ... 88
表 21 S. aureus 鑑定流程比較 ... 92
表 22 MRSA 鑑定流程比較 ... 92
表 23 採樣效能評估指標 ... 96
表 24 細菌活性與可培養性評估指標 ... 103
表 25 採樣效能評估指標 ... 107 表 26 AGI-30 搭配 Tween 80 mixture 於 15-60 分鐘採樣時間下之不同菌種採樣效能
XII
... 108 表 27 S. aureus 或 MRSA 於不同環境空氣中之濃度 ... 113 表 28 BioSampler 於不同採樣時間下所得菌落數之推估 ... 114
第一章 前言 1.1 研究背景
Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）為院內感染常見之病原菌，可由帶 原者的手部、痰液或鼻腔分泌物等散佈至環境中，污染醫護人員手部、醫療照護 儀器或病房設備等，再透過直接接觸或空氣傳播造成院內感染（Beggs 2003）。此 外，愈來愈多研究指出 S. aureus 於空氣傳播的可能性，在醫院病房或手術室等環 境空氣中存在之 S. aureus，人體吸入後可能造成肺囊性纖維化（Cystic fibrosis，
CF）（Ferroni et al. 2008）。
根據疾管局 2009 年台灣院內感染監視系統（Taiwan Nosocomial Infections Surveillance System，TNIS）資料顯示（李聰明 et al. 2011），醫學中心加護病房醫 療照護相關感染常見菌株中，不同感染部位的合計菌株數（單一感染部位分離相 同菌株以1 次計算，分離不同種類菌株則分次計算）以 S. aureus 為第 7 名。而針 對區域醫院加護病房，不同感染部位的合計菌株數（單一感染部位分離相同菌株 以1 次計算，分離不同種類菌株則分次計算）以 S. aureus 為第 6 名。而長期以來 由於醫療院所抗生素的大量使用，也導致細菌產生抗藥性，抗藥性金黃色葡萄球 菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）可對 Methicillin 產生抗藥 性，美國於2005 年統計有 40-70% S. aureus 之院內感染病例是由 MRSA 造成（Zetola et al. 2005），細菌抗藥性日趨嚴重之問題造成S. aureus 與相關感染治療上日益困 難。
有鑑於 S. aureus 院內感染的比率相當高、且其抗藥性問題及空氣傳播可能性 亦被證實，如何進行感染風險評估，有效監測這些致病菌在環境空氣中是否存在 及其濃度值，以協助釐清感染源，進一步採取適當的隔離措施與醫療處置，將有 助於減少院內感染的發生、降低醫療資源的浪費、維護空氣品質及人類健康。
有效監控空氣中病原菌濃度的具體作法之一，即是進行空氣採樣，再透過適 當的分析定量生物氣膠濃度。過去針對 S. aureus 進行空氣採樣的研究，使用過的 生物氣膠採樣器包括Andersen one-stage viable sampler 與 AGI-30（Schulz et al. 2011）
等，然這些研究大多未針對採樣方法進行效能評估。此外，BioSampler 亦是常見 的生物氣膠採樣器（Kim et al. 2007），但目前尚未有針對 S. aureus 的空氣採樣文獻 或採樣方法效能進行詳細的評估研究。不同生物氣膠採樣器的設計差異使其需搭 配不同類型的採樣介質，隨著採樣環境及欲捕集的生物性質的不同，會以不同的
2
採樣時間進行空氣採樣，而何種採樣策略最能有效捕集空氣中的 S. aureus，使其 能確實呈現空氣中的細菌濃度，目前仍不清楚。因此本研究在實驗室建置生物氣 膠產生系統，評估不同採樣器在不同設定條件下對 S. aureus 之採樣效能，期能找 出最佳採樣策略於所研究之病原菌。
第二章 文獻回顧 2.1 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
2.1.1 生物特性
金黃色葡萄球菌（S. aureus）為一種兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，在顯微鏡下 排列成葡萄串狀，因此命名為葡萄球菌屬（Staphylococci），且此菌於 1884 年被成 功分離並培養在固態培養基上時，發現會產生金黃色色素，所以被稱為金黃色葡 萄球菌。其直徑為0.5-1 μm，不產芽孢，無鞭毛，大多數無莢膜，且對熱（45℃）、
乾燥有耐受性。S. aureus 在濃度達 10%的食鹽肉湯中也能生存，因此可以使用具 高鹽分之選擇培養基將該菌分離出來。S. aureus 常見於皮膚表面、上呼吸道黏膜 及腸道，一般情形下是附著在人的皮膚及黏膜的正常菌群。當宿主免疫力低落時，
細菌容易經由傷口黏膜或侵入性醫療裝置（如呼吸器或導尿管）進入身體內部造 成伺機性感染。1961 年，英國首先發現抗藥性金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），MRSA 會對 penicillins 與 cephalosporins 有抗藥 性，易造成後續治療相關感染上的困難，至今已是最常見的院內感染病原菌之一
（Enright et al. 2002）。
2.1.2 健康影響
金黃色葡萄球菌一般最常聚集於鼻腔黏膜，在皮膚有傷口、免疫力低下、環 境衛生條件較差或個人衛生習慣不佳時，皆可能透過手部接觸或空氣傳播造成感 染，例如醫護人員照護帶原S. aureus 之病患或操作S. aureus 汙染之醫療器械後未 清潔雙手，即去照護其他病患，便可能導致病患感染 S. aureus，其為院內感染常 見致病菌之一。暴露於S. aureus 主要的感染症狀為肺囊性纖維化（Cystic fibrosis，
CF），使呼吸道及肺部長期反覆的感染，導致肺功能異常，呼吸困難，為主要致死 原因，其併發症為汗腺、消化道、內分泌腺等黏液分泌功能異常及性器官發育問 題(Ferroni et al. 2008)。除導致呼吸系統疾病外，不同菌型之S. aureus，還會引起 皮膚感染、傷口發炎、骨髓炎、肺炎及菌血症等，此菌亦為最常見引起食物中毒 的病原菌之一，人類食入受S. aureus汙染之食物，可引發腹痛、腹瀉或嘔吐等腸 胃症狀（Le Loir et al. 2003）。
S. aureus 除存在於醫療院所外，於環境衛生條件較差之農業相關工作環境也 可發現 Staphylococcus spp.，2010 年 Awad 等人以 AGI-30 於麵粉廠、食品工業、
4
禽舍與紡織工業進行空氣採樣，發現分別有11.72%、9.52%、13.56%與 8.00%之空 氣樣本檢出，研究顯示 Staphylococcus spp.為這些工作環境中主要存在菌種之一，
且這些作業場所之員工會持續暴露於約104 CFU/m3之細菌濃度之下，可能導致呼 吸系統相關疾病（Awad et al. 2010）。另外，2008 年 Moodley 等人以鼻腔拭子與問
卷調查時常接觸動物皮膚之獸醫鼻腔中帶原MRSA 之情形，結果發現獸醫相較於
不常實際接觸動物皮膚之實習學生，有較高比例帶原 MRSA（獸醫：3.9%，實習
學生：0.7%），顯示獸醫具有較高風險帶原 MRSA（Moodley et al. 2008）。
2.1.3 空氣傳播
金黃色葡萄球菌是皮膚正常菌群，人體最常帶原S. aureus 的部位為鼻腔黏膜，
且諸多文獻指出此細菌可經由直接接觸或空氣傳播（Beggs 2003, Noble 1975, Rutala et al. 1983, Shiomori et al. 2002）。1975年Noble以狹縫式採樣器（Slit sampler）
進行空氣採樣，樣本經過培養與鑑定後，發現所採集到帶有S. aureus之微粒大小約 4至25μm，這與人類皮膚鱗狀上皮之大小十分接近，作者由此推測大多數空氣中之 S. aureus存在於皮膚鱗狀上皮中，透過人類每日釋放約3 × 108個皮膚碎屑散布於空 氣中。此外，當帶原者換穿衣物或醫護人員整理床單時，更易將帶有S. aureus之皮 膚鱗狀上皮細胞散佈至空氣中；因此該研究推論，當帶有S. aureus之皮膚鱗狀上皮 碎屑散佈至空氣中時，若S. aureus經人類呼吸停留於鼻腔黏膜中，S. aureus易於潮 濕溫暖之環境繁殖增生，而當帶原者手部接觸過鼻腔黏膜後，停留於皮膚上之S.
aureus會再次隨著皮膚碎屑散佈至空氣中（Noble 1975）。
1983年Rutala等人在爆發MRSA院內感染之燒燙傷病房，以Andersen two-stage air sampler與Rodac plates進行為期十週之院內感染調查，收集了2700個環境空氣及 表面樣本採樣，結果在16%之空氣樣本、31%之病房距地面較高處物體（例如病房 書櫥頂部）表面採樣樣本與40%病房地面採樣樣本中檢出MRSA，作者研判由於病 房中較高處物體為醫護人或病患較少接觸到之區域，因此在這些區域之MRSA陽性 檢出結果較可能與MRSA經空氣傳播有關，而非經由手部接觸造成該區域之汙染
（Rutala et al. 1983）。2002年Shiomori等人以Andersen six-stage air sampler於醫院
病房進行空氣採樣，發現空氣中帶有MRSA之微粒能以小於4μm之大小散佈於空氣
中，由於此種微粒可進入下呼吸道，並進而引發肺部感染之可能（Shiomori et al.
2002）。2003年Beggs指出任何接觸傳播引起的感染，都可能因為空氣中的病原菌
落在物體表面，再經由手部接觸引起感染，因此不能忽視S. aureus空氣傳播的可能 性（Beggs 2003）。
2.1.4 空氣採樣研究
過去針對S. aureus之空氣採樣研究（表 1），曾使用Andersen sampler搭配不同 培養基，於一般住家（Perez et al. 2011, Gandara et al. 2006）、醫療院所（Hsiao et al.
2011, Shiomori et al. 2002, Huang et al. 2013, Mirzaii et al. 2012）、家禽舍（Zhong et al.
2009）或實驗室（Hsiao et al. 2011）進行不同時間之空氣採樣。於一般住家環境中 進行S. aureus空氣採樣之研究，包括了2011年Perez等人以Andersen one stage sampler（Andersen 1-STG）搭配Nutrient Agar（NA）進行3分鐘之空氣採樣（Perez et al. 2011），以及2006年Gandara等人以Andersen 2-STG搭配Tryptic Soy Agar（TSA），
於一般住家環境進行10與15分鐘之空氣採樣（Gandara et al. 2006）。上述兩者之研 究目的皆欲了解一般住家環境空氣中非抗藥性與具抗藥性之S. aureus的分佈情 形。
至於在醫療院所進行之S. aureus空氣採樣研究，則包含了2012年Hsiao等人以 Andersen 1-STG搭配CHROMagar staph aureus（CSA）於醫學中心候診區、小兒病 房與呼吸照護病房等處進行之7分鐘空氣採樣，以了解於實際環境中使用CSA時，
其鑑定空氣中S. aureus之敏感性與特異性（Hsiao et al. 2011）；此外，2002年Shiomori 等人於MRSA帶原病患病房中，以Andersen 6-STG搭配MSO agar進行10分鐘之空氣
採樣，以探討醫護人員整理病床前、整理病床時與整理病床後，MRSA於病房空氣
中的濃度與其氣膠粒徑之大小（Shiomori et al. 2002）。2013年Huang等人研究指出 空氣中S. aureus在訪客進入加護病房（ICU）後，濃度和檢出率有上升現象（Huang et al. 2013）。另，2012年Mirzaii等人以抹拭與空氣樣本確認ICU地面與空氣中細菌 分布情形，結果顯示空氣中S. aureus平均濃度為12.1±8.11CFU/m3，且S. aureus汙染 濃度較高處為呼吸儀器與床架（Mirzaii et al. 2012）。於醫療院所進行空氣採樣研 究，除了使用Andersen sampler外，尚包括MAS-100 sampler。2009年Gehanno等人 使用MAS-100 sampler搭配Chromogenic medium，於醫院病房進行10分鐘之空氣採 樣，以評估MRSA帶原病患所住病房空氣中之MRSA濃度（Gehanno et al. 2009）。
於 家 禽 舍 進 行 S. aureus 空 氣 採 樣 之 研 究 ， 則 包 括 了 2009 年 Zhong 等 人 以 Andersen 6-STG搭配Baird-Park agarose（BPA），於雞舍進行1至5分鐘之空氣採樣，
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目的係以S. aureus為該環境空氣中微生物分佈之指標細菌，以觀察雞舍室內外空氣 中微生物之分佈（Zhong et al. 2009）。2011年Schulz等人則使用AGI-30搭配磷酸緩 衝液（glycerol-phosphate buffer），於家禽養殖場進行30與90分鐘之空氣採樣，此研 究目的為以葡萄球菌為指標細菌，探討通風之養殖場其空氣中微生物分佈與擴散 情形（Schulz et al. 2011）。2012年Schulz等人亦以AGI-30搭配PBS於豬舍中採樣，
調查豬舍中MRSA分布之情形。其分別自每季挑選一天於豬舍鼻腔採樣，並距豬舍 遠近不同之迎風處或順風處地面採集抹拭與空氣樣本，結果顯示在夏季所有來源 之樣本檢出率皆高，且豬舍內外樣本之MRSA菌種相同，亦即MRSA確實存在豬舍 內且會藉由空氣傳播至豬舍外，此現象於夏季時更為明顯（Schulz et al. 2012）。此 外，2012年Friese等人以AGI-30與IOM（Institute of Occupational Medicine personal inhalable air sampler）於豬舍進行30與150分鐘之空氣採樣，並取豬隻皮膚樣本、鼻 腔抹拭樣本與豬舍地面抹拭樣本，以確認豬舍中MRSA之分布情形，結果顯示 AGI-30較IOM採樣結果有更高的檢出率，且MRSA菌種大多為t011與t034（Friese et al. 2012）。2013年Friese等人亦以相同空氣採樣方式於雞舍進行空氣採樣，以調查 雞舍中MRSA分布之情形，分別採取雞隻鼻腔抹拭樣本、雞舍地面抹拭樣本與雞舍 內外之空氣樣本，結果顯示在雞隻身上、雞舍內地面與雞舍內外空氣中皆存在同 菌種之MRSA，亦即MRSA不只在雞舍內傳播，亦會散佈至雞舍外（Friese et al.
2013）。
除探究工作場所空氣中 S. aureus 之暴露情形外，也曾出現有限之 S. aureus空 氣採樣方法效能評估研究。2012 年 Hsiao 等人發表的研究中，曾使用濾匣式採樣 器(Cassette)於實驗室和醫院分別進行 60 分鐘之空氣採樣，並與 Andersen 1-STG 進行採樣效能比較，結果顯示Andersen 1-STG 有較佳的採樣效能（Hsiao et al. 2011）。
除進行現場採樣瞭解 S. aureus 暴露現況或採樣效能外，2012 年 Hsiao 等人的研究 也曾於實驗室內建置生物氣膠產生系統，透過產生空氣懸浮之 S. aureus 以評估 Andersen 1-STG 搭配不同採樣介質時之 S. aureus 回收率，並與 Cassette 之採樣效 能進行比較。結果發現，Andersen 1-STG 搭配Luria-Bertani（LB）broth 之採樣回 收率高於CSA；且相較於 Cassette，其對 S. aureus 有較佳的回收率。後者現象推 測可能與 Cassette 於採樣過程中使微生物受到之衝擊力及乾燥有關（Hsiao et al.
2011）。
綜觀上述研究可發現，在調查作業現場空氣中 S. aureus 暴露時，各研究常各
自選用不同的採樣器搭配選擇性或非選擇性之培養基，並以不同的採樣時間進行 各自的空氣採樣。然若要確實呈現環境空氣中 S. aureus 濃度，必須有適當的採樣 策略以有效捕集空氣中之 S. aureus，避免或降低 S. aureus 在採樣過程中因不當的 採樣方法所造成的損失，導致研究者低估環境中 S. aureus 濃度；而上述各研究中 所使用之不同採樣器、採樣介質與採樣時間等即是影響微生物捕集效率之重要因 子。因此，若能針對這三項因子進行審慎評估，藉以釐清捕集空氣中 S. aureus 之 最佳採樣條件，可藉此擬定適當採樣策略以有效捕集該病原菌。然目前的研究中，
除了2012 年 Hsiao 等人研究曾針對 Andersen 1-STG 與 Cassette 兩種採樣器之採樣 效能進行比較外（Hsiao et al. 2011），其他文獻則鮮少對 S. aureus 空氣採樣方法進 行詳細的效能評估。此外，雖然於過去 S. aureus 空氣採樣文獻中，並未使用改善 了氣膠化現象之BioSampler（Willeke et al.1998）與可攜式個人採樣器（Institute of Occupational Medicine personal inhalable air sampler, IOM）（Wang et al. 2001），然此 二種採樣器亦為常見之生物氣膠採樣設備，其是否更有利於捕集 S. aureus，亦需 要進一步評估加以釐清。
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表 1 Staphylococcus aureus 與 MRSA 之空氣採樣研究
採樣器 採樣時間 採樣介質 偵測上下限（CFU/m3） 採樣地點 Ref.
Andersen 1-STG 3 min Nutrient Agar 430 / 29
5 / 1（MRSA）
一般住家 Perez et al.
2011
Andersen 1-STG 7 min CHROMagar staph aureus
8 / 2.5 醫學中心候診區、小兒病房 與呼吸照護病房
Hsiao et al.
2011 CMRSA（For MRSA） 7.4 / 1.7
Andersen 1-STG 2 min TSA 4.42±11.84 / 0.88±3.9 加護病房 Huang et al. 2013
Andersen 1-STG 10 min TSA 13.47±9.42 / 5.86±4.09 加護病房 Mirzaii et al.2012 Andersen 2-STG 10 min、15 min Tryptic Soy Agar 74.79 / 0.59 一般住家 Gandara et
al. 2006 Andersen 6-STG 1-5 min Baird-Park agarose 137 / 3 雞舍 Zhong et
al. 2009 Andersen 6-STG 10 min MSO agar（For MRSA） 116.0±43.7 / 0.7 醫院 Shiomori et
al. 2002
表 1 Staphylococcus aureus 與 MRSA 之空氣採樣研究（續）
採樣器 採樣時間 採樣介質 偵測上下限（CFU/m3） 採樣地點 Ref.
MAS-100 10min Chromogenic medium 40 / 0.5 老人照護、小兒病房與呼吸 照護病房
Gehanno et al. 2009 AGI-30 30min、90min Glycerol– phosphate
buffer
ND（Not detected） 雞舍 Schulz et al. 2011 AGI-30 30 min PBS 2.3×104/19（MRSA） 家禽舍 Friese et al.
2013 IOM 150 min Polycarbonate filter 7.4×103/89（MRSA）
AGI-30 - PBS 3619 / 2 豬舍 Schulz et
al. 2012
AGI-30 30 min PBS 257（MRSA） 豬舍 Friese et al.
2012 IOM 150 min Polycarbonate filter 802（MRSA）
Nuclepore filter 60 min Polycarbonate
membrane 4.6 / 2.2
2.8 / 0.6（MRSA）
醫學中心中候診區、小兒病 房與呼吸照護病房
Hsiao et al.
2011
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2.2 金黃色葡萄球菌之固體培養基 2.2.1 非選擇性培養基
非選擇性培養基（non-selective medium），為一種對微生物沒有選擇性抑制之 培養基，營養成分齊全。2006 年 Gandara 等人曾以 Andersen 2-STG 搭配 Tryptic Soy Agar（TSA），於一般住家進行 10 與 15 分鐘之空氣中 S. aureus 採樣（其後續鑑定 流程如表 2所示），目的在於了解 S. aureus 與 MRSA 在一般住家室內外空氣中的 細菌量（Gandara et al. 2006）。2012 年Mirzaii等人以Andersen 1-STG 搭配 TSA 於 ICU行10 分鐘之空氣採樣（其後續鑑定流程如表 2所示），以偵測ICU空氣中 S.
aureus 之濃度與分布狀況（Mirzaii et al. 2012）。此外，2013 年 Huang 等人亦以 Andersen 1-STG 搭配 TSA 於ICU進行2 分鐘之空氣採樣（其後續鑑定流程如表 2 所示），以了解訪客進入ICU 前後，空氣中 S. aureus 之濃度變化情形（Huang et al.
2013）。由於TSA 含有可提供胺基酸或氮源之豐富有機物質，加上不含任何抑菌物 質，因此可培養大多數挑剔性（fastidious）或非挑剔性（non-fastidious）微生物，
長久以來被廣泛使用於各種微生物培養實驗。然其不含抑菌物質之特點，同時亦 會造成TSA 於環境採樣時，出現過多雜菌干擾之現象。TSA 本身呈淡黃半透明，
於35 ± 2°C 下培養 S. aureus 18 小時以上，培養基上即會出現黃色菌落。
2.2.2 選擇性培養基
選擇性培養基（selective medium）為一種於培養基內加入特定抑菌物質，使 某些微生物生長受抑制，而特定微生物穩定生長之培養基，因而有利於特定微生 物之分離。其抑菌因子包含：特殊營養成份、培養條件（如培養溫度與pH值等）、
化學藥劑（如高濃度鹽份）或抗生素。過去S. aureus之空氣採樣研究，曾使用之選 擇性培養基包括：Mannitol Salt Agar（MSA）（Schulz et al. 2011）、Baird-Parker agar
（BPA）（Zhong et al. 2009）、CHROMagar staph aureus（CSA）（Hsiao et al. 2011）
與Chapman Stone Medium（CSM）（Gandara et al. 2006, Perez et al. 2011）。
2011年Schulz等人以AGI-30搭配glycerol-phosphate buffer於雞舍進行30與90分 鐘之採樣，後續培養時即以MSA作為初步分離S. aureus之選擇性培養基(Schulz et al. 2011)。MSA含有7.5%之高濃度鹽類，可抑制Staphylococci以外之其他細菌的生 長。且其含有醣類甘露醇（mannitol），S. aureus醱酵甘露醇後之代謝物，其酸性會 使培養基中之pH指示劑-酚紅（phenol red）轉變成黃色，於其菌落周圍形成黃色環，
而大多數非致病性葡萄球菌無法發酵甘露醇，於MSA上菌落較小，外觀呈粉色或 與MSA相同顏色（紅色）。由於MSA含有酚紅，因此未培養S. aureus前培養基呈現 紅色，若於35 ± 2°C下培養S. aureus 18小時以上，培養基上即會出現金黃色菌落。
BPA曾於2009年為Zhong等人用於Andersen 6-STG內，在雞舍進行1至5分鐘之 S. aureus空氣採樣，目的為以S. aureus作為該環境空氣中微生物分佈之指標細菌，
以觀察雞舍室內外空氣中微生物之分佈（Zhong et al. 2009）。BPA成分中之鋰鹽
（Lithium）與亞碲酸鹽（Tellurite），可抑制Staphylococcus spp.以外之雜菌生長，
且因葡萄球菌可將Tellurite還原成Telluride，其反應產物會使菌落呈現黑色。BPA 所添加之蛋黃液（Egg yolk），使培養基外觀呈現不透明之淡黃色，若於35 ± 2°C下 培養S. aureus於BPA 18小時以上，可觀察到菌落周圍出現不透明之暈環，此為S.
aureus之lecithinase分解蛋黃液中lecithin所造成。
2012年Hsiao等人曾以Andersen 1-STG搭配CSA於醫學中心候診區、小兒病房 與呼吸照護病房等處，進行7分鐘之S. aureus空氣採樣，以了解使用CSA於實際環 境中進行空氣採樣後，對於空氣中S. aureus之鑑定敏感性與特異性（Hsiao et al.
2011）。CSA為一產色性培養基，其特殊產色原（Chromogen）被S. aureus之特定酵 素代謝後，會使S. aureus形成淡紫色菌落。此外，CSA中添加之抑菌物質可抑制革 蘭氏陰性、真菌以及其他非S. aureus之革蘭氏陽性球菌，因此非S. aureus之細菌除 無法代謝Chromogen外，亦可能被CSA中所含抑菌物質所抑制，而達到篩選出S.
aureus之目的。CSA於37°C下培養S. aureus 18小時以上，即可觀察到淡紫色菌落。
CSM則是透過高鹽分（5.5%）篩選出S. aureus之培養基。2006年Gandara等人 以Andersen 2-STG搭配TSA，於一般住家環境進行10與15分鐘之S. aureus空氣採樣，
接著將TSA於35°C下培養24至48小時後，再將培養出來之菌落接種至CSM，進行 後續生化測試以鑑定出S. aureus（Gandara et al. 2006）。另外，2011年Perez等人亦 以Andersen 1-STG搭配Nutrient agar（NA）進行3分鐘之S. aureus空氣採樣，接著將 NA置於36°C下培養48小時，再將培養出來之菌落接種至CSM，其培養出來之菌落 再進行後續生化鑑定（Perez et al. 2011）（後續鑑定流程如表 2所示），以上兩次研 究目的皆為了解一般住家環境空氣中非抗藥性與具抗藥性之S. aureus的分佈情形。
CSM培養基本身呈半透明之琥珀色，成份中含有甘露醇（mannitol），S. aureus可發 酵mannitol後產酸。CSM於30°C下培養S. aureus 18至48小時後，可觀察到黃色菌落。
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表 2 Staphylococcus aureus之空氣採樣培養基
採樣器 培養介質 鑑定流程 觀察上下限值或檢出率 Ref.
Andersen 1-STG
Nutrient Agar 48hr at 36℃→Chapman Stone Medium→48hr at 36℃→NA→48hr at 36℃→Coagulase
plasma test→Antibiotic Susceptibility Test→48 hr at 36℃
S. aureus/Total Bacteria = 98%
MRSA/Total Bacteria = 56%
Perez et al.
2011
CHROMagar staph aureus
20-24hr at 37℃→Gram stain→Hemolysis test→24hr 37℃→Catalase test→Slide coagulase test→real time PCR
（nuc）→Antibiotic Susceptibility Test
SA：8（CFU/m3） Hsiao et al. 2011
Andersen 2-STG
Tryptic Soy Agar 24-48hr at 35℃→Chapman Stone Medium →
48hr at 35℃→Coagulase test→Antibiotic Susceptibility Test→48 hr at 35℃
S. aureus/Heterotrophic organisms（%）=37.33
Gandara et al. 2006
Andersen 6-STG
Baird-Parker agarose
24hr at 37℃→KOH reaction→24hr at 37℃ in BPA→
API 20 Steph
SA：137（CFU/m3） Zhong et al. 2009 AGI-30 Glycerol-phosphate
buffer
MSA→24–48hr at 36℃→blood agar basis plates 24-36hr at 36℃→Gram stain→ Morphology →Motility→Catalase test→Oxidase test→ Lysostaphin susceptibility→Clumping factor test→16S–23S rDNA intergenic spacer PCR
- Schulz et
al. 2011
表 2 Staphylococcus aureus之空氣採樣培養基（續）
採樣器 培養介質 鑑定流程 觀察上下限值或檢出率 Ref.
Andersen 1-STG
TSA Gram stain→catalase test→tube coagulase test→Dnase test→
fermentation of mannitol→PCR（femA） 3.1-14.2% Mirzaii et al.2012
Andersen 1-STG
TSA GEN III Biolog method 5-15% Huang et
al. 2013
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2.2.3 金黃色葡萄球菌鑑定 2.2.3.1 鑑定準確度
前述流程係針對空氣樣本中之S. aureus 進行菌種鑑定。對於檢測流程之鑑定 能力之評估，結果常以兩種方式呈現，亦即鑑定方法之準確度（敏感性與特異性）
與其方法於某一群體之預測值（陽性預測值與陰性預測值）（表 3）
表 3 Staphylococcus aureus 鑑定相關名詞 S. aureus or MRSA
Non-S. aureus
or non-MRSA Total
Positive result（＋） a c a＋c
Negative result（－） b d b＋d
Total a＋b c＋d a＋b＋c＋d
（1）S. aureus or MRSA：由鑑定方法確認為 S. aureus 或 MRSA 菌種之菌落數目
（2）Non-S. aureus or non-MRSA：由鑑定方法確認為非 S. aureus 或 MRSA 菌種之 菌落數目
（3）Positive result（＋）：測試結果呈陽性反應之菌落數目
（4）Negative result（－）：測試結果呈陰性反應之菌落數目
（5）敏感性（Sensitivity）= a / a＋b
（6）特異性（Specificity）= d / c＋d
（7）陽性預測值（Positive Predictive Value, PPV）= a / a＋c
（8）陰性預測值（Negative Predictive Value, NPV）= d / b＋d
敏感性（Sensitivity）係指該檢驗或培養基偵測 S. aureus 或 MRSA 之能力，換 言之，Sensitivity高之檢驗或培養基較不會遺漏實際上係 S. aureus 或 MRSA 之菌 落；特異性（Specificity）係指該檢驗或培養基能辨識非 S. aureus 或 MRSA 之能力，
換言之，Specificity高之檢驗或培養基較不會誤判實際上非 S. aureus 或 MRSA 之 菌落為陽性。陽性預測值（Positive Predictive Value, PPV）係指該檢驗或培養基於 陽性菌落之預測值，亦即試驗結果或培養基上為陽性反應時，其確實為 S. aureus 或MRSA 之比例；陰性預測值（Negative Predictive Value, NPV）係指該檢驗或培
養基於陰性菌落之預測值，亦即試驗結果或培養基上為陰性反應時，其確實非 S.
aureus 或 MRSA 之比例（Hsiao et al. 2011）。
S. aureus 之空氣採樣文獻中，關於其鑑定方法之Sensitivity 與 Specificity 研究 相當有限，唯2011 年 Hsiao 等人之研究曾以 Andersen 1-STG 搭配 CSA 於醫療院 所進行7 分鐘之空氣採樣，其樣本經多項生化測試搭配聚合酶連鎖反應（PCR）進 行 S. aureus 與 MRSA 之菌種確認，結果顯示其 Sensitivity、Specificity、 PPV 與 NPV 分別為 24.1%、91.2%、15%與 94.9%。Hsiao 等人推論，其 Sensitivity 偏低之 原因係可能與S. aureus 之生物活性受環境空氣其中其他菌種之干擾所致。該研究 亦指出選擇性培養基之PPV 係與 S. aureus 於空氣中之濃度高低成比例，因此若於 S. aureus 濃度較高之環境進行空氣採樣，該培養基之 PPV 應能提升（Hsiao et al.
2011）。
2.2.3.2 選擇性培養基相關鑑定研究
本研究針對曾用於進行S. aureus 空氣採樣之四種選擇性培養基（MSA、BPA、
CSA 與 CSM）進行效能評估，其各自搭配不同鑑定流程，分析不同樣本來源中之 S. aureus 時所呈現之鑑定能力如表 4所示。
1992 年 Van Enk 與 Thompson 首先評估於 MSA 中添加 6mg/L 之 oxacillin
（OMSA）時，其用於分離呼吸道檢體中 MRSA 之效果，該研究係將相同之臨床 樣本分別培養於非選擇性培養基與 OMSA，結果顯示 29 株可於 OMSA 分離出之 MRSA，有 9 株無法於非選擇性培養基中被分離出來，研究指出若臨床樣本中所含 MRSA 濃度較低，則將樣本培養於非選擇性培養基時，易因雜菌生長過多而導致 計數MRSA 菌落之困難，而 OMSA 可有效抑制雜菌且不傷害 MRSA 生長（Van Enk and Thompson 1992）。相較於 BPA、CSA 與 CSM 而言，直接添加抗生素於 MSA 中，以作為MRSA 初步分離之培養基之做法常見於 MSA，亦為其特色（Sadaka et al. 2009, Safdar et al. 2003, Merlino, Gill and Robertson 1996）。於 MSA 鑑定相關文 獻中，其所搭配之生化鑑定流程之 Sensitivity、Specificity、 PPV 與 NPV 較高者 列於表 4。
另，BPA 係台灣行政院衛生署疾病管制局所公布之傳染病標準檢驗方法中，
用於分離食品中毒案件之人體檢體中的 S. aureus。其鑑定流程係將糞便檢體或嘔 吐物少許檢體接種於BPA，於 37℃培養 24-48 小時後，取黑色陽性菌落進行革蘭 氏染色（Gram stain），其陽性反應者再接種於 TSA，於37℃培養 24-48 小時後，
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進行Staphylase test、凝固酶試驗（Tube coagulase test, TCT）與觸酶試驗（Catalase test），以上測試皆呈陽性結果之菌落再以API ID 32 STAPH 生化鑑定套組進行菌種 確認。BPA 亦為國際標準組織（International Organization for Standardization, ISO）
（ISO 1999）與美國食品藥物管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）建 議使用於分離食品中 S. aureus 之選擇性培養基（Saito et al. 2011）。
在 CSA 部分，2007 年 Han 等人以表 4所列之鑑定流程分析臨床上呼吸道抹 拭樣本中S. aureus，並評估CSA 與 MSA 之鑑定能力，結果顯示搭配 CSA 之鑑定 方法，其Sensitivity 與 Specificity 可達 98%與 99.6%，然搭配 MSA 進行鑑定時，
其Sensitivity 與 Specificity 為 84.3%與 100%，研究指出 CSA 相較於 MSA 對於上 呼吸道抹拭樣本中S. aureus有較高鑑定敏感性（Han et al. 2007）。另，Carricajo 等 人以CSA 搭配表 4所列測試鑑定775 件臨床血液與尿液檢體中S. aureus，結果顯 示，單以CSA 與 Gram stain 進行鑑定而未加做其他生化測試時，其 Sensitivity 與 Specificity 為 98.5%與 97%，然輔以 Staphychrom coagulase test 時，其 Specificity 可增至100%，亦即進行適當之生化測試，可有效改善選擇性培養基鑑定能力不足 之問題。雖然CSA 相較於其他傳統選擇性培養基而言，所需成本較高，然其高鑑 定準確度亦可減少後續鑑定項目與鑑定時間（Carricajo et al. 2001）。
表 4 Staphylococcus aureus 之生化測試
生化測試 Sensitivity /Specificity
NPV
/PPV Reference MSA
Gram stain→Catalase test→
Blood agar→37℃, 24hrs→TSA→37℃, 24hrs→MSA→37℃, 24hrs→DNase test→
Tube coagulase test→PCR（nuc）
75%
/100%
100%
/94%
Kateete et al. 2010
MSA→37℃, 24hrs→Gram stain→Catalase test→Mannitol fermentation test→Gelatin hydrolysis→Mixed sugar fermentation test
→Voges-Proskauer test→Coagulase test→
β-haemolysis test→37℃, 24hrs →PCR：
16S rRNA（rrs）
100%
/100%
100%
/100%
Bautista- Trujillo et al. 2013
BPA
BPA→PCR→Vitek compact 100%
/100%
- Kim and
Oh 2010 CSA
CSA→PCR→Vitek compact 100%
/100%
- Kim and
Oh 2010 CSA→37℃, 18-24hrs→Blood agar→
Catalase test→Staphaurex slide test→
Tube coagulase test
98%
/99.6%
- Han et al.
2007
CSA→Gram stain→Staphychrom coagulase test
98%
/100%
- Carricajo et al. 2001
18
2.3 生物氣膠收集液
過去生物氣膠文獻中常使用之收集液，包括經過濾之無菌水（Filtered deionized water，DW）（Han and Mainelis 2012, Chang and Chou 2011, Chang and Hung 2012）、
磷酸緩衝液（Phosphate buffer saline，PBS）（Awad et al. 2010, Reanprayoon and Yoonaiwong 2012, Chapin et al. 2005）與 Tween 80 mixture（Deionized water with 1%
peptone, 0.01% Tween 80, 0.005% antifoam A, TM）（Li and Lin 2001, Thorne et al.
1992）。
表 5 生物氣膠收集液 收集液
種類 測試菌種 研究類型 Reference
無菌水 Bacillus subtilis and Cladosporium cladosporioides fungal spores
Laboratory chamber Han and Mainelis 2012
Legionella pneumophila and Escherichia coli
Laboratory chamber Chang and Chou 2011
Legionella pneumophila Field sampling Chang and Hung 2012
磷酸緩 衝液
Staphylococcus spp., Gram（＋）and Gram（－）bacteria
Field sampling Awad et al. 2010
Field sampling Reanprayoon and Yoonaiwong 2012 Staphylococcus
spp. and Enterococcus spp.
Field sampling Chapin et al. 2005
Tween 80 mixture
Bacillus subtilis spores and Escherichia coli
Laboratory chamber Li and Lin 2001
Bacteria and fungal spores
Field sampling Thorne et al. 1992
2.4 生物氣膠採樣器
本 研 究 所 評 估 之 生 物 氣 膠 採 樣 器 包 含 以 培 養 皿 為 採 樣 介 質 之 採 樣 器
（Agar-based sampler）與以液體為採樣介質之採樣器（Liquid-based sampler）
2.4.1 以固體培養基為採樣介質之採樣器（Agar-based samplers）
2.4.1.1 安德森單階式生物氣膠採樣器（Andersen one stage sampler，Andersen
1-STG）
Agar-based samplers 係將生物氣膠引入多孔縫隙並衝擊至培養皿中之衝擊式 採樣器，例如Andersen one stage sampler（Andersen 1-STG）。由於生物氣膠可直接 收集於培養皿上並直接培養，無需採樣後之後續處理，因此被廣泛使用。
2.4.1.2 時間因子對採樣效能之影響
1995 Stewart 等人指出微生物可能於 Andersen impactor 採樣過程中之衝擊作 用導致細胞膜損傷，進而影響受捕集微生物之可培養性（Stewart et al. 1995）。1999 年Li 與 Lin 進一步以 Andersen 1-STG 搭配 TSA 對 Escherichia coli 與 Bacillus subtilis spores 進行 0.5、1、2、3、5、7、10、20、40 與 60 分鐘之空氣採樣，並以與本實 驗相同之採樣效能指標評估不同採樣時間對採樣效能之影響。結果顯示，E. coli 於採樣時間60 分鐘時之採樣效能，相對於採樣 0.5 分鐘時，其採樣效能顯著下降 至10 倍，另，B. subtilis spores 之採樣效能亦於採樣時間 60 分鐘時出現下降之現 象（Li and Lin 1999b）。2010 年 Mainelis 與 Tabayoyong 進一步提出，隨著採樣時 間增加，細菌與真菌被收集至Andersen impactor並且被培養出來的量會下降，此 結果係與微生物被收集至培養基後，於後續之採樣過程中，採樣氣流會持續進入 採樣器並導致培養基之乾燥與硬化，此現象除可能使已收集至培養基上之細菌與 真菌可培養性下降，亦會造成後續欲捕集之微生物自培養基表面彈開（bounce），
而使回收率下降，故以衝擊式採樣器進行採樣時，採樣時間不宜過長，以避免影 響微生物之採樣效能（Mainelis and Tabayoyong 2010）。
時間因子對Andersen impactor 捕集空氣中S. aureus 之採樣效能影響目前尚未 清楚，故本研究除評估 S. aureus 培養基之空氣採樣效能外，亦針對時間因子進行 實驗測試與探討。
20
2.4.2 以液體為採樣介質之採樣器（Liquid-based samplers）
2.4.2.1 液體衝擊瓶（All glass impinger，AGI-30）與離心式採樣器（BioSampler）
Liquid-based samplers 係引入生物氣膠並使其衝擊至或以離心路徑進入液體收 集介質中。種類包括All-glass impinger-30（AGI-30）、MAS-100 sampler 之衝擊式 採樣器以及 BioSampler 等。此類採樣器之優點為採樣之液體樣本可經培養法或其 他分子生物技術（例如：qPCR）（Sirigul et al. 2006）進行分析，以得到定性或定 量數據。其中AGI-30 係以衝擊方式將生物氣膠收集至液體中，而 BioSampler 為結 合氣流切線方向之離心力將生物氣膠衝擊至收集液中的離心式採樣器，由於結合 離心力將生物氣膠衝擊至收集液，改善了生物氣膠彈開（bounce）與再氣膠化
（re-aerosolization）之現象（Willeke et al. 1998）。
2.4.2.2 時間因子對採樣效能之影響
1997 年 Grinshpun 等人指出，以收集液為介質之採樣器（例如 AGI-30）其採 樣效能於採樣時間增加時下降，此現象係可能與採樣氣體於採樣過程中導致收集 液反覆強烈的攪動，造成已被捕集於收集液中之微生物再氣膠化有關（Grinshpun et al. 1997）。此外，微生物於採樣過程中反覆撞擊收集液面與瓶壁亦會導致細菌活 性下降（Terzieva et al. 1996）。2007 年 Rule 等人置入已知濃度之 Pantoea agglomerans 之DW 於 AGI-30 與 BioSampler 中，並於暴露艙進行30 與 60 分鐘之 空氣採樣（暴露艙通入經HEPA 過濾之空氣）。其收集液以Syto 62 進行總菌之染 色，以TOPRO-3 進行非活性細菌之染色，最後以其差值計算活性細菌濃度；結果 顯示，當採樣時間自30 分鐘延長至 60 分鐘，AGI-30 中具活性與可培養性細菌濃 度分別下降0.09 與 0.4 倍；而BioSampler 中具活性與可培養性細菌濃度則分別下 降0.88 與 0.77 倍。由上述可知，存在於AGI-30 與 BioSampler 收集液中之細菌，
其活性與可培養性皆隨採樣時間延長而下降（Rule et al. 2007）。
然時間因子對以收集液為介質之採樣器採集空氣中S. aureus 之影響情形目前 亦未明朗，故本研究除測試 S. aureus 空氣採樣收集液之採樣效能外，亦針對採樣 時間進行評估。
第三章 研究目的
從上述文獻回顧顯示，S. aureus 可造成相當高比率的院內感染，並可強勢存 在於醫療院所、家禽養殖地點、紡織、食品、麵粉等工作環境，且其導致治療困 難的抗藥性問題以及空氣傳播特性亦已被證實。因此，有效監測此致病菌於作業 場所環境空氣中是否存在及正確定量其濃度，有助於釐清污染來源，及早且適時 採行必要的控制措施，是相當重要的。而有效監控空氣中病原菌濃度的具體作法 之一，即是進行空氣採樣，再透過適當的分析定量其病原菌之濃度。然目前針對 S. aureus 之空氣採樣效能研究相當有限，因此本研究將在實驗室建置一 S. aureus 氣膠產生系統，藉此評估不同採樣器在不同採樣條件下對 S. aureus 之採樣效能，
期能找出最佳採樣策略用於所研究之病原菌。
本研究主要目的如下：
1. 建置實驗室 S. aureus 氣膠產生及採效能評估系統。
2. 評估一種非選擇性培養基（Tryptic Soy Agar）與四種選擇性培養基（Mannitol Salt Agar、Baird-Park agarose、CHROMagar staph aureus 與 Chapman Stone Medium）
對於空氣中 S. aureus 之採樣效能，決定最佳空氣採樣培養基。
3. 以培養基為採樣介質之採樣器（Andersen one stage sampler），搭配先前實驗決 定具最佳採樣效能之培養基，透過培養法評估不同採樣時間對其採樣效能之 影響。
4. 評估三種採樣液體（Filtered deionized water、Phosphate buffer saline、Tween 80 mixture）對於空氣中 S. aureus 之採樣效能與採樣流失率，決定最佳空氣採樣效 能收集液。
5. 以液體為採樣介質之採樣器（AGI-30 與 BioSampler），搭配先前實驗決定具最 佳採樣效能之收集液，透過培養法評估採樣器種類與採樣時間對採樣效能之影 響。
6. 透過統計檢定結果提出適當的採樣策略。
22
第四章 研究架構
本研究架構流程如圖 1 所示。空氣採樣實驗將於 S. aureus氣膠產生系統內進 行，此系統設置於生物安全等級第二級實驗室之第二級生物安全櫃中，並進行其 流量、濕度、生物氣膠粒徑與濃度之穩定性測試與評估。空氣採樣實驗的細菌來 源係於實驗室內培養之病原性細菌S. aureus（ATCC 29213），調整其至適當濃度後，
置入生物氣膠產生器（Collision three-jet nebulizer）中，使其於系統中產生生物氣 膠。
採樣效能評估實驗之第一部份為評估以培養基為採樣介質之生物氣膠採樣方 法，實驗設計以Andersen one stage sampler 搭配五種不同培養基，進行採樣時間皆 為6 分鐘之 S. aureus 空氣採樣，藉此評估不同培養基採集空氣中 S. aureus 之效能。
決定最佳採樣效能之培養基後，將評估不同採樣時間對以相同培養基為採樣介質 之採樣器的效能影響，方法係以Andersen one stage sampler 搭配本研究測試具較佳 採樣效能之培養基，進行採樣時間為 3、6、15、30 與 60 分鐘之實驗。第二部分 為評估以液體為採樣介質之生物氣膠採樣方法，首先以AGI-30 搭配三種不同收集 液，於相同採樣時間3 分鐘下比較不同收集液對空氣中 S. aureus 之採樣效能，並 於採樣時間 3、6 與 15 分鐘下比較三種收集液之流失率；而後以 AGI-30 與 BioSampler 搭配本研究測試具較佳採樣效能之收集液，進行採樣時間為 3、6、15、
30 與 60 分鐘之實驗，以觀察不同生物氣膠採樣器與不同採樣時間對 S. aureus 採 樣效能的影響。
S. aureus（ATCC 29213）於 50mL LB broth 在 37℃下培養 14 小時（2.36 ×g），建立檢量線以利後續實驗調整細菌濃度之用
經採樣測試，調整菌液至適當濃度後，將40 mL S. aureus 懸浮 菌液置入生物氣膠產生器，使系統中產生穩定濃度之生物氣膠
生物氣膠產生系統之穩定性測試與評估
濕空氣、乾空氣與生 物氣膠產生器之流量
暴露艙相 對溼度
生物氣膠產生 器中菌液濃度
暴露艙生物 氣膠濃度
採樣效能 指標(R)
S. aureus粒 徑分佈
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圖 1 研究流程
培養法分析：培養基於37℃下培養 24 小時後，計數菌落數
第五章 材料與方法 5.1 實驗菌株
本研究所採用菌種為 S. aureus（ATCC 29213）。S. aureus 為兼性厭氧之革蘭氏 陽性球菌，不產芽孢（spore），無鞭毛（flagella），菌直徑為0.5-1 μm（Lai et al. 2003），
可於37°C 下生長良好，其氣動粒徑（aerodynamic diameter）為 0.65-0.7µm（Chang et al. 2013）。
5.2 實驗用培養基、培養液與採樣收集液 5.2.1 Tryptic Soy Agar（TSA）
配方 / 公升
Tryptic soy agar（Difco, Detroit MI, USA） 40 g
將 40g TSA 粉末（Difco, Detroit MI, USA）置入 1000 mL 經過濾之去離子水（其 過濾方式係將經紫外光與純化管柱去除離子與有機物之純化水，進一步以幫浦加 壓方式使其通過超濾膜與0.22μ之濾膜，以去除水中微生物與大於 0.22μ之微粒，
Milli-Q Academic, Millipore, Bedford, MA, USA），慢慢加熱至沸騰，使TSA 粉末完 全溶解於水中，再以121°C高壓滅菌消毒15 分鐘，滅菌過後將 TSA 置於水溫 50°C 的水浴槽使之降溫，最後輕輕混合倒入無菌培養皿（20 mL/plate）。
5.2.2 Mannitol Salt Agar（MSA）
配方 / 公升
Mannitol Salt Agar（Difco, Detroit MI, USA） 111 g
取111g MSA 粉末（Difco）懸浮於 1000 mL 經過濾之去離子水（Millipore），
接著慢慢加熱至沸騰，使 MSA 粉末完全溶解於水中，再以 121°C 高壓滅菌消毒 15 分鐘，滅菌過後將 MSA 置於水溫 50°C 的水浴槽使之降溫，最後輕輕混合倒入 無菌培養皿（20 mL/plate）。
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5.2.3 Baird-Parker Agar（BPA）
配方 / 公升
Baird-Parker Agar Base（Difco, Detroit MI, USA） 63 g
取63g BPA 粉末（Difco）懸浮於 950 mL 經過濾之去離子水（Millipore），加 熱至沸騰使BPA 粉末完全溶解於水中，再以 121°C 高壓滅菌消毒 15 分鐘，滅菌過 後將BPA 冷卻至 45-50°C，其後加入50 mL EY Tellurite Enrichment（Difco），以體
積 95:5 之比例混合均勻。培養基注入培養皿前，應搖動混合使絮狀沈澱物分散均
勻，搖動時應避免產生氣泡，最後輕輕混合倒入無菌培養皿（20 mL/plate）。
5.2.4 CHROMagar Staph aureus Agar（CSA）
CHROMagar Staph aureus（CHROMagar Microbiology, Paris, France）為用於分 離與鑑定臨床或食品樣本中 S. aureus 之成品培養基。
5.2.5 Chapman Stone Medium（CSM）
配方 / 公升
Chapman Stone Medium（Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO） 202.5 g
取 202.5g CSM 粉末（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）懸浮於 1000 mL 經 過濾之去離子水（Millipore），接著慢慢加熱至沸騰，使CSM 粉末完全溶解於水中，
再以121°C高壓滅菌消毒15 分鐘，滅菌過後將 CSM 置於水溫 50°C 的水浴槽使之 降溫，最後輕輕混合倒入無菌培養皿（20 mL/plate）。
5.2.6 Luria-Bertani（LB）broth 配方 / 公升
LB Broth, Miller（Luria-Bertani）（Difco, Detroit MI,
USA） 25 g
取 25g LB Broth粉末（Difco）懸浮於 1000 mL 經過濾之去離子水（Millipore），
加熱至沸騰，使粉末完全溶解於水中，再以121°C高壓滅菌消毒15 分鐘，滅菌過 後將LB Broth置於水溫50°C 的水浴槽使之降溫，保存於 4°C 下備用。
5.2.7 Phosphate buffer saline（PBS）
配方 / 公升
NaCl 8.2 g
KCl 0.2 g
KH2PO4 0.2 g
Na2HPO4 1.15 g
將上述成分之粉末懸浮於1000 mL 經過濾之去離子水（Millipore），加熱至沸 騰使粉末完全溶解於水中，再以121°C高壓滅菌消毒15 分鐘，保存於室溫環境。
5.2.8 Tween 80 混合液 配方 / 公升
Peptone（Oxoid, Thermo Fisher Scientific Inc, UK） 10 g Tween 80（J.T Backer®, USA） 100 μl Antifoam Y-30 emulsion（Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO） 50 μl
將上述成分置入 1000 mL 經過濾之去離子水（Millipore），配製成含有 1%
Peptone（Oxoid, Thermo Fisher Scientific Inc, UK）、0.01% Tween 80（J.T Backer®, USA）與 0.005% Antifoam Y-30 emulsion（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）之 混和溶液，以121°C高壓滅菌消毒15 分鐘後冷卻至室溫，保存於 4°C 環境備用。
其中Tween 80 為一介面活性劑，用於促進微生物於空氣採樣過程中均勻分散於收 集液中；而Antifoam Y-30（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）用於減緩收集液 之起泡程度。
5.3 置備與建立金黃色葡萄球菌檢量線
在置備 S. aureus 菌液時，先將儲存於-20°C之 S. aureus（ATCC 29213）進行
