第五章 材料與方法
5.8 S. aureus 空氣採樣方法之效能評估
5.8.2 以收集液為採樣介質之採樣器（Liquid-based samplers）效能評估
本研究評估之 Liquid-based samplers 包括 All glass impinger-30（AGI-30）與 BioSampler（SKC Inc., Eighty Four, PA, USA），AGI-30 與 BioSampler 之 50%截取 氣動粒徑（d50）分別為0.31μm（Macher and Burge 2001）與 0.3μm （Deloge-Abarkan et al. 2007），兩者抽氣流量均為12.5 L/min。AGI-30 與 BioSampler 之流量校正皆 於每次進行採樣評估實驗前完成，並於採樣實驗結束再進行流量後測。
5.8.2.1 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之採樣效能
本研究以生物氣膠文獻中常使用之收集液作為效能評估對象，包括經過濾之 無菌水（Filtered deionized water，DW）、磷酸緩衝液（Phosphate buffer saline，PBS）
與Tween 80 mixture（1% peptone, 0.01% Tween 80 and 0.005% antifoam Y-30 in Deionized water, TM）。評估方法如圖 5 之 A 流程所示，在製備與調整 S. aureus 菌 液濃度後，開啟生物氣膠產生系統之壓縮空氣，並將通過乾、溼空氣管線與內裝 40 mL 無菌水之Nebulizer 的氣體流量分別校正為前述之預設流量。20 分鐘後，將
培養基置於37℃培養箱中培養 24 小時後計數菌落，並計算 R 值以評估 五種採樣時間之採樣效能
關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，進行空氣採樣後 Nebulizer 中菌液濃度 測試
暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，進行空氣採樣前 Nebulizer 中菌液 濃度測試後，重新開啟壓縮空氣
10 分鐘
Andersen 1-STG 搭配先前實驗評估具較佳採樣效能之培養基，於暴露艙 進行3、6、15、30 與 60 分鐘空氣採樣
3、6、15、30 與 60 分鐘 30 分鐘
連接Nebulizer 之壓縮空氣暫時關閉，並以 40 mL 且濃度為108 CFU/mL 之 S. aureus 懸浮菌液取代無菌水後，重新開啟連接Nebulizer 之壓縮空氣，使 S. aureus 菌液氣
懸，並受到壓縮空氣推送而進入暴露艙中，共運作 30 分鐘。此時暫時關閉連接
Nebulizer 之壓縮空氣，並自Nebulizer 中取出 0.1 mL S. aureus 菌液，經適當稀釋後 利用推盤法塗抹至先前實驗（5.8.1.1）評估具最佳採樣效能之培養基上，定量空氣 採樣前 Nebulizer 中菌液濃度。其後重新開啟壓縮空氣，等待 10 分鐘後至暴露艙 中生物氣膠分佈均勻，再將內裝有20 mL 隨機選取之三種收集液的 AGI-30 置於暴 露艙下方採樣口，進行3 分鐘採樣；採樣結束後亦自 Nebulizer 中取 0.1mL 菌液進 行推盤，以與採樣前相同實驗方式定量採樣後Nebulizer 中菌液濃度。
採樣結束後即進行量測 AGI-30 內之收集液總體積，且收集液不經過儲放，
即取出其中0.1mL S. aureus 菌液，經適當稀釋後推盤至先前實驗（5.8.1.1）評估具 最佳採樣效能之培養基上。
1000 ×g 於 4℃下離心 5 分鐘
S. aureus（ATCC 29213）於 50mL LB broth 在 37℃下培養 14 小時（2.36 ×g）
開啟系統壓縮空氣，將乾、溼空氣與Nebulizer 管線校正為預設流量 移除上清液後加入適量無菌水，再將此細菌懸浮液進行A600測定，調製
為40 mL且濃度為108 CFU/mL 之 S. aureus菌液
20 分鐘
暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，將 40mL 具適當濃度之 S. aureus 菌 液置入Nebulizer 後，重新開啟壓縮空氣
30 分鐘
暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，進行空氣採樣前 Nebulizer 中菌液 濃度測試後，重新開啟壓縮空氣
10 分鐘
40
圖 5 S. aureus 採樣收集液與採樣時間之效能評估
上述培養基皆置於 37℃培養箱中培養 24 小時並計數菌落。AGI-30 搭配三種 收集液採樣所得之菌落數，經收集液體積、採樣時間與採樣流量的校正，可得到 其空氣中 S. aureus 採樣濃度（Cair_AGI-30）。將此濃度除以其相對應採樣前後Nebulizer 中菌液濃度（Csusp）之平均值，此比值即作為該收集液空氣採樣之效能指標（R, R
= Cair_ AGI-30/Csusp），每種收集液進行四重複測試。有關上述各濃度與R 值之計算公
式如下：
AGI-30 採樣所得之暴露艙空氣中S. aureus 細菌濃度（Cair_ AGI-30）計算公式如 下：
Cair_ AGI-30(CFU/m3) =（（N / 0.1）× D × V）/（L × T × 0.001）
N（CFU）：培養基於37°C培養箱中培養24 小時後之菌落數 0.1（mL）：因自收集液中取出0.1 mL 菌液推盤，需換算為 1 mL D：將收集液推盤時之稀釋倍數
V（mL）：收集液採樣後之總體積
L（L/min）：AGI-30採樣流量（12.5 L/min）
T（min）：空氣採樣時間
0.001：將空氣採樣之單位體積由 1 L 換算為 1 m3
量測液體採樣器內收集液總體積，並以推盤法測試採樣所得之細菌濃 度，培養基置於37℃培養箱中培養 24 小時後計數菌落，並計算 R 值以
進行效能評估
關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，進行空氣採樣後 Nebulizer 中菌液濃度 測試
A. AGI-30 搭配 20mL 之 DW、PBS 或Tween 80 mixture，於暴露艙進行
3 分鐘空氣採樣
3 分鐘
B. AGI-30 與 BioSampler 搭配先前實 驗評估具最佳空氣採樣效能之收集 液，於暴露艙進行3、6、15、30 與
60 分鐘之空氣採樣 3、6、15、30 與 60 分鐘
Nebulizer 中 S. aureus 菌液濃度(Csusp)計算公式如下：
Csusp（CFU/mL）=（N / 0.1）× D
N（CFU）：培養基於37°C培養箱中培養24 小時後之菌落數
0.1（mL）：因自Nebulizer 中取出 0.1 mL 菌液推盤，需換算為 1 mL D：推盤時之稀釋倍數
採樣效能指標(R)計算公式如下：
R = Cair_ AGI-30/Csusp
Cair_ AGI-30（CFU/m3）：以AGI-30 於暴露艙採樣所得之空氣中 S. aureus 濃度 Csusp（CFU/mL）：該次空氣採樣前後Nebulizer 中菌液濃度之平均值
5.8.2.2 評估 S. aureus 空氣採樣收集液之流失率
以液體為介質之採樣器在引入生物氣膠於收集液的過程中，收集液之再氣膠 化可能造成液體與細菌流失（Lin et al. 2000）。因此本研究評估收集液之採樣效能 外，亦測試DW、PBS 與 Tween 80 mixture 於不同採樣時間下之液體流失率。本實 驗流程如圖 6 所示。完成 S. aureus 菌液之製備與濃度調整後，即進行 AGI-30 與 BioSampler 重量之量測（Wempty, mg），而後進行內裝有 20 mL 收集液之液體採樣 器總重之量測（Wbefore, mg），其重量差值與收集液體積相除即為該收集液之密度（D, mg/mL），密度值將用於計算液體流失率。
接著以與前述相同操作方式進行系統流量與濕度調控，並將40 mL 且濃度為 108 CFU/mL 之 S. aureus 懸浮菌液置入Nebulizer，俟其穩定後再將內裝有20 mL 收集液之AGI-30 或 BioSampler，置於暴露艙下方採樣口進行 3、6 與 15 分鐘採樣；
完成採樣後亦將液體採樣器進行秤重（Wafter, mg），其採樣前後之重量差值，與該 收集液之密度相除後即可得流失液體之體積，此數值以採樣時間進行校正後，可 計算收集液之流失率（%）。流失率計算公式如下：
流失率（%）=（（Wafter－Wbefore）/ D）/ 20 D（mg/mL）=（Wbefore－Wempty）/ 20
Wbefore（mg）：採樣前內裝收集液之採樣器重量 Wempty（mg）：採樣前未裝收集液之採樣器重量
Wafter（mg）：採樣後內裝收集液之採樣器重量
42
20（mL）：收集液體積
圖 6 S. aureus 空氣採樣收集液之流失率測試
5.8.2.3 時間因子對 AGI-30 與 Biosampler 採樣效能之影響
本實驗流程如圖 5 之 B 流程所示。於系統開啟壓縮空氣後進行流量校正。俟 20 分鐘後，以與前述相同操作方式以 40 mL 且濃度為108 CFU/mL 之 S. aureus 懸 浮菌液取代無菌水。30 分鐘後暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，以測試空氣採 樣前 Nebulizer 中菌液濃度。其後重新開啟壓縮空氣，等待 10 分鐘後再將內裝有
S. aureus（ATCC 29213）於 50mL LB broth 在 37℃下培養 14 小時（2.36 ×g）
1000 ×g 於 4℃下離心 5 分鐘
暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，將 40mL 具適當濃度之 S. aureus 菌液置入Nebulizer 後，重新開啟壓縮空氣
內裝20mL DW、PBS 或 Tween 80 mixture 之液體採樣器於暴露艙進行 3、
6 與 15 分鐘空氣採樣
關閉壓縮空氣後，量測內裝收集液之液體採樣器總重，以計算流失率 3、6 與 15 分鐘
暫時關閉連接Nebulizer 之壓縮空氣，其後重新開啟壓縮空氣 10 分鐘
30 分鐘
移除上清液後加入適量無菌水，再將此細菌懸浮液進行A600測定，調製 為40 mL且濃度為108 CFU/mL 之 S. aureus菌液
量測AGI-30 與 BioSampler 之淨重與內裝有 20 mL 收集液之總重，記錄 重量差值以計算收集液之密度
20 分鐘
開啟系統壓縮空氣，將乾、溼空氣與Nebulizer 管線校正為預設流量
20 mL 先前測試（5.7.2.1）評估具最佳空氣採樣效能之收集液的 AGI-30 或 Biosampler 置於暴露艙下方採樣口，進行 3、6、15、30 與 60 分鐘採樣；採樣結束 後亦自Nebulizer 中取 0.1 mL 菌液進行推盤，以與採樣前相同實驗方式測試採樣後 Nebulizer 中菌液濃度。
液體採樣器內之收集液總體積將於採樣結束後進行量測，且收集液不經過儲放 步驟，即取出其中0.1mL S. aureus 菌液，經適當稀釋後推盤至先前實驗（5.8.1.1）
評估具最佳採樣效能之培養基上。
上述培養基皆將置於 37℃培養箱培養 24 小時候計數菌落。AGI-30 與 Biosampler 於不同採樣時間之效能指標值（R）如前述（5.8.2.1）之方式進行計算，
每種採樣時間進行四重複測試。