國立宜蘭大學園藝學系研究所 碩士論文

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國立宜蘭大學園藝學系研究所 碩士論文

Department of Horticulture National Ilan University

Master Thesis

低壓基因槍之首次植物轉殖及利用 27 個鹼基對序列作為 妖精蘭與軛瓣蘭品種之分子標誌

Low Pressure Gene Gun First-ever Transformation in Plant and Its Application of 27bp Sequence as Molecular Marker in

Mormodes lawrence and Zygopetalum mackayi

指導教授:高建元博士 Chien-Yuan Kao, Ph. D.

研究生:黃馨慧 Shin-Hui Huang

中華民國九十七年七月

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致 謝

首先我要感謝高建元老師在這幾年來的諄諄指導,給我許多的研究方 向讓我獲益良多,不論是在組識培養還是分子生物方面都學到很多專業知 識與技術;再來要謝謝我的實驗夥伴瑋玲同學,當初要不是她找我加入高 老師的實驗室,我也不會發現我對實驗的興趣進而攻讀研究所,在實驗室 的這幾年裡我們互相鼓勵互相幫助,讓我在學習的路上不會太孤單;我也 要感謝鄭萬興老師讓我到研究室跟學長姐學習基因選殖的入門技術,可以 說我的轉殖技術啟蒙就是由此開始的;更不可不謝的就是一路上總是讓我 問許多問題的儀倩學姐與她所熟識的詹明才老師研究室的大學姐們,也間 接被我麻煩到。而我的朋友們,在我遇到挫折、心情低落時,與你們聚會 或出遊,總會讓我豁然開朗轉換心境重拾信心克服難關。還有就是可愛的 學弟妹們,在指導你們實驗的過程中,不但幫了我不少忙也讓我有機會可 以將所學傳承下去。最後,就是要感謝生我育我劬勞的父母與努力到現在 的我,謝謝。

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摘 要

蘭花是台灣少數具有競爭力的高價值觀賞花卉,而其成功的主要利基 為育種實力。隨著國內外貿易行為的開放與生物技術的發達,使得這些多 年來選育出的優良蘭花品系種源權完全暴露在無償盜用的威脅中。所以植 物品種認證制度,對於植物貿易與品種權保護,皆有其實際而重要的角色。

本研究的目的為利用核苷酸(Nucleotide)排列組合之多樣性,設計一段 27 個

鹼基對序列來代表品種所有者註冊資料,經由國人自行研發之生物鎵 (BioWare)低壓基因槍,利用 50psi 的氦氣壓力,將設計好 DNA 序列標誌轉 殖至妖精蘭與軛瓣蘭品種,使其實生或分生之子代,皆會具有此註冊片段,

品種權所有者可以具體以 PCR 或定序分析確認 DNA 序列標誌,作為保障 種源權之認證系統。由

gus 基因玉米糊粉層與胚的暫時性表現,證實低壓基

因槍應用在植物組織之可行性。而在蘭花轉殖穩定表達方面,結果顯示妖 精蘭與軛瓣蘭轉殖株的基因組中有插入外源的

hpt 基因與質體序列;進一步

的利用定序分析,發現在妖精蘭的轉殖株中共有二株確實轉入設計好的分 子標誌。本研究不僅成功地將分子標誌轉殖至妖精蘭,更是首次成功地將 低壓基因槍應用在植物轉殖試驗上。

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Abstract

Orchid is one of the important economic flowers in Taiwan. Among factors contributing towards prosperous orchid industry, novel cultivar breeding is one of the major foundations for the industry. However with the liberation of international trade and biotechnology, the orchid novel cultivar is actually under copycat duplicate behavior from unauthorized breeders and growers. Henceforth it should pay much attention on protection of novel cultivars to safeguard our orchid industry. To protect the identity of orchid cultivar and the right of the breeders, we successfully develop a novel method by the introduction of foreign DNA sequence (27bp) as molecular marker via BioWare low pressure gene gun into Mormodes lawrence and Zygopetalum mackayi. Histochemical GUS transient expression was obtained from aleurone layer and embryo of Zea mays using BioWare low pressure gene gun with acceleration pressure of 50psi. This is the first report on successful transfer into plant tissue using BioWare low pressure gene gun. Stable integration of the 27bp DNA sequence as molecular marker into Mormodes Lawrence and Zygopetalum mackayi were confirmed by PCR and Southern hybridization. Again our data showed the first successful stable integration of foreign DNA sequence into plant tissue by BioWare low pressure gene gun. This study also demonstrated that transgenic plants could be produced using BioWare low pressure gene gun. Accordingly, molecular markers utilized as variety (cultivar) identification were considered possible.

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目 錄

中文摘要··· I 英文摘要···II

目 錄···III 表目錄··· VI

圖目錄··· VII

第一章、前言···1

第二章、文獻探討···3

2.1 妖精蘭簡介 ···3

2.2 軛瓣蘭簡介 ···4

2.3 植物品種之鑑定方法···4

2.4 植物基因轉殖之研究···7

2.5 基因槍基因轉殖法 ···10

2.6 低壓基因槍簡介 ···12

第三章、材料與方法···14

3.1 植物材料 ···14

3.2 低壓基因槍轉殖條件試驗···14

3.3 抗生素篩選系統之建立···15

(6)

3.4DNA序列標誌之設計 ···15

3.5 質體製備 ···15

3.6 大量質體DNA抽取···21

3.7 基因槍轉殖流程 ···23

3.8GUS活性組織化學分析···24

3.9 擬轉殖株基因組DNA之抽取 ···25

3.10 聚合酶鏈鎖反應及定序···26

第四章、結果···30

4.1 重組質體之限制酵素分析···30

4.2 抗生素篩選系統之建立···30

4.3 低壓基因槍轉殖條件···31

4.4GUS的暫時性表達 ···31

4.5 聚合酶鏈鎖反應分析及定序···31

4.6 低壓基因槍之轉殖率···33

第五章、討論···34

5.1 抗生素篩選系統 ···34

5.2 低壓基因槍轉殖條件···35

5.3 重組質體酵素切割確認···36

5.4GUS的暫時性表達 ···36

(7)

5.5 低壓基因槍轉殖 ···37

5.6 轉殖效率 ···38

5.7 植物品種鑑定系統 ···39

5.8 結論···40

第六章、參考文獻···42

附錄···68

附錄一、DNA序列標誌轉殖流程 ···68

附錄二、基因認証代碼示意圖···69

附錄三、縮寫對照表···70

附錄四、引子序列表···71

附錄五、實驗溶液配製···72

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表目錄

表一、高黴素(hygromycin)濃度對未轉殖原球體存活率之影響 ... 49 表二、高黴素濃度對金粉槍擊後妖精蘭與軛瓣蘭原球體存活率之影響.... 49 表三、BioWare低壓基因槍與Bio-Rad基因槍之比較... 50

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圖目錄

圖1.Biolistic PDS-1000/He粒子撞擊基因傳送系統 ···51

圖2.BioWare低壓基因槍簡介···52

圖3.DNA序列標誌A與B之設計···53

圖4.pCAMBIA1301 之圖譜 ···54

圖5.pGEM®-T Easy Vector circle之圖譜···55

6.構築質體利用KpnⅠ/NheⅠ酵素切割確認之電泳分析圖 ···56

圖7.低壓基因槍在不同條件下槍擊濾紙之情形 ···57

圖8.低壓基因槍槍擊玉米糊粉層GUS暫時性表達 ···58

圖9.妖精蘭利用HPT引子進行聚合酶鏈鎖反應之電泳分析圖 ···59

圖10.軛瓣蘭利用HPT引子進行聚合酶鏈鎖反應之電泳分析圖 ···60

圖11.pCAMBIA-1301 上引子序列的位置 ···61

圖12.妖精蘭利用pUC300 引子進行聚合酶鏈鎖反應之電泳分析圖 ···62

圖13.妖精蘭利用pUC300 引子進行聚合酶鏈鎖反應之電泳分析圖 ···63

圖14.妖精蘭再生葉片進行聚合酶鏈鎖反應之電泳分析圖···64

圖15.轉殖株 4 號(妖精蘭)定序分析 ···65

圖16.轉殖株 38 號(妖精蘭)定序分析···66

圖17.低壓基因槍轉殖的轉殖株在組培瓶中之形態 ···67

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第一章、前言

植物品種認證制度,對於植物貿易與品種權保護,皆有其實際而重要 的角色。蘭花是台灣加入世界貿易組織(WTO)後,少數具有競爭力的高價 值觀賞花卉,而其成功的主要基礎為,台灣業餘玩家們的趣味育種及業者 的專業育種,使得台灣的蘭花品種育種實力讓各國望之卻步。但隨著國內 外貿易行為的開放與生物技術的發達,使得這些多年來經驗累積選育出的 優良蘭花品系,其種源權完全暴露在無償盜用的威脅中(高,2003)。

尤其台灣為海島國家土地資源有限,農業成本高無法用生產量與勞力 低廉國家競爭,因此必需重視種源權之保護,使本身站穩在蘭花產業上游 的地位,以育種質量保持在國際市場中的競爭力。但目前在植物品種認證 工作上,往往還是停留在以外在表現型為主的判斷,此法雖行之有年,但 讓人詬病的地方還是很多。所以建立一套客觀且具有公信力之植物品種認 證系統是刻不容緩的。

本研究的目的為利用核苷酸(Nucleotide)排列組合之多樣性,設計一段 具有代表品種所有者註冊資料之DNA 序列標誌,經由基因轉殖至植物後其 實生或分生之子代,皆會具有此註冊片段,品種權所有者可以具體以聚合 酶鏈鎖反應(PCR)或定序等方式確認 DNA 序列標誌,作為保障種源權之認 證系統。

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本實驗室已成功利用農桿菌轉殖法,將阿拉伯芥第一條染色體上長度 約550bp 的 DNA 片段放入文心蘭 Oncidium‘Gower Ramsey’中作為分子標誌 (唐,2007)。在前人的研究中顯示以 Bio-Rad 公司的 Biolistic (PDS1000/He) Particle Delivery System 型基因槍轉殖蘭花時,在氦氣壓力 650psi(許,

1997)、650 及 900psi (謝和黃,1995)、1100psi (林,1999)和 1550psi (Chi et al., 1998)的高氦氣壓力條件下 GUS 的暫時性表現最好;而利用氦氣壓力 1100psi 轉殖石斛蘭原球體(Yu et al., 1999)與文心蘭類原球體(李,2000)皆可獲得具

有抗性之擬轉殖株;石斛蘭利用1350psi 的氦氣壓力有較高的轉殖率( Davina

et al., 2007)。

本研究將進一步利用國人自行研發之生物鎵( BioWare )低壓基因槍,利 用50psi 的氦氣壓力,將設計好 27 個鹼基對的 DNA 序列標誌轉殖進入蘭花 植物體中,不僅成功的將BioWare 低壓基因槍應用在植物體上,也使得 DNA 序列標誌更為具體,具有品種認證功能。

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第二章、文獻探討

2.1 妖精蘭簡介

妖 精 蘭(Mormodes lawrence) 在 分 類 學 上 的 地 位 是 被 子 植 物 門 (Angiospermae) 、 單 子 葉 植 物 綱 (Monocotyledoneae) 、 雌 雄 合 蕊 植 物 目 (Gynandrae) 、 蘭 科 (Orchidaceae) 、 樹 蘭 亞 科 (Epidendroideae) 、 蕙 蘭 族 (Cymbidieae)、Catasetinae 亞族、妖精蘭屬(Mormodes)。屬名 Mormodes 是 由拉丁文mormo「妖怪」與 eides「相似」二字合成,直譯為妖精蘭或妖怪 蘭,這是因其花形奇妙怪異而來,唇瓣並非正常地開,而是像扮鬼臉似地 斜臉歪嘴扭曲著,英文名為Goblin Orchid(魔鬼蘭),也因其一梗數花,花姿 如群燕飛翔,而被稱為飛鳥蘭或飛燕蘭(陳,2004)。

妖精蘭約有20 種,分佈於墨西哥、巴西等地區而著生於樹上。根部呈 為粗紡錐形,葉有5~10 枚,披針形而薄,根部完成後即脫落,高約 30~60 分分,花莖由根部中節長出(江,2002)。

妖精蘭的假球莖多肉肥厚,葉片可由假莖底部抽出,外鞘會將假莖層 層包覆,花期較晚,一般在落葉後的冬天至隔年的春天由假莖的中間部份 至頂端間開出3~6 支的花梗,花有濃郁香味,其最大的特色為無葉也會開 花,花朵數特別多,可遺傳給與其雜交的其他蘭屬之後代 (陳,2004)。

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2.2 軛瓣蘭簡介

軛 瓣 蘭 (Zygopetalum mackayi) 在 分 類 學 上 的 地 位 是 被 子 植 物 門 (Angiospermae) 、 單 子 葉 植 物 綱 (Monocotyledoneae) 、 雌 雄 合 蕊 植 物 目 (Gynandrae)、蘭科(Orchidaceae)、樹蘭亞科(Epidendroideae)、Maxillarieae 族、Zygopetalinae 亞族、對瓣蘭屬(Zygopetalum)。

Zygopetalum 屬原產於巴西,大約有 20 個種類,特性是具有香氣且花

期持久,而

Zygopetalum mackayi 是 Zygopetalum 屬中常見的栽培種(Tatsuka et al., 1988) 。 在 Orchid Biology : Reviews and Perspectives 書 中 提 到 Zygopetalum mackayi 的有種子含有 2-4 個胚(Kull and Arditti, 2002)是典型的

多胚現象(Polyembryony)。

1991 年森源等人也進行關於 Zygopetalum mackayi 單偽生殖的種子形成 之研究(森源等人,1991)。近年來由於國際市場之需求,分生苗之產量逐年 提升。利用擬原球體(PLB)進行種苗增殖是目前多數業者採行之繁殖方式,

但植株容易產生變異是最大的隱憂(陳等,2004) 。而利用多胚現象之特性,

不僅有與優良母本相同之性狀亦兼具實生苗播種量產之能力,可做為蘭花 產業新興量產方法研究之基礎。

2.3 植物品種之鑑定方法

現行的植物品種鑑定方法,依發展的時序可分為1.傳統鑑定法,利用 植株外表形態特徵區別;2.生化鑑定法,利用植株特定發育時期或器官蛋白

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質上的差異(如同功異構酶),由電泳圖譜顯示特殊條帶區別;3.分子鑑定

法,利用核內染色體基因組DNA 序列上的差異,篩選內切脢(endon- uclease)

或引子(primer),經切段、複製放大後以電泳距離顯示 DNA 序列上差異(如 AFLP、RFLP)。這些技術都受限於環境影響、耗費時間、無法精確快速、

可用變異性少、非絕對證據、無法登記及衍生子代無法鑑定等因素,也因 此國內外植物專利種苗法都只能延用最傳統的植株外表形態特徵區別方法 (高,2003)。

2.3.1 傳統鑑定法

傳統的形態鑑定法因為不需要特殊技術與儀器設備,是一般常用的品 種鑑定方式(莊,2003b)。早期種源鑑定大多是利用,如葉序、葉形、花序、

花瓣數、花朵大小、果實形狀、種子形狀等外表形態作為品種鑑定之依據,

但生物的表現型容易受到環境因子之影響而改變(楊,1998)。

2.3.2 生化鑑定法

生化鑑定是利用同功異構酶酵素結免疫分析(ELISA)、高壓液態色層分 析(HPLC)等生物化學反應作為物種鑑定方式。不過由於可做為遺傳標誌的 同功異構酶有限,而自然界中生物的種類繁多,所以應用在物種分類上不 敷使用,只能鑑別品種間的差異,生化標誌通常無法辨識比較接近的品系 或營養系(劉,2000)。

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2.3.3 分子鑑定法

分子鑑定是利用分子生物技術進行DNA 層次的測試,將所測得之特徵 作為品種鑑定或品系親緣關係建立的指標(莊,2003a)。近年來已有多種 DNA 層次的分子鑑定系統,包括限制片段長度多型性(RFLP)、逢機擴增多

型DNA(RAPD)、簡單序列重複(SSR)、擴增片段長度多型性(AFLP)等(曾,

2000)。

2.3.4 蘭科植物品種鑑定方法

蘭科植物之族群種類眾多,使得蘭花品種分類較其他植物更為困難。

蘭科植物最常利用花器型態進行品種鑑定純化,主要是利用唇瓣形狀、唇 瓣中裂片及唇瓣上之瘤狀物、花粉塊的數量、花粉質地、粉柄(caudicle)、

黏盤(viscidium)、距(spur)及蕊柱(colum)等,作為鑑定指標 (Arditti, 1992)。

蘭科植物之分類法相當多,現代常以實用分類法及植物學分類法進行分 類。實用分類法可依生長習性分為附生蘭及地生蘭;依形態可分為單莖及 複莖;依原生地氣候環境則可分為熱帶性或溫帶性蘭等(黃,1996)。

分子標誌可多方面應用於種源鑑定上,包括品種所有權的保護、植物 品種身分認定等,且於幼苗階段即可進行分析比傳統鑑定方式更為即時 (徐,2004)。近年來分子標誌應用於蘭科植物的研究有,蝴蝶蘭(傅等人,

1997;羅,2003;林,2003;林,2006)、文心蘭(賴,1998;Williams and Whitten, 2001;黃等人,2002;姜,2004)、石斛蘭(李,2002;曾,2002)、

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萬代蘭(Chen et al., 1999;Lim et al., 1999)、拖鞋蘭(Benner et al., 1995)、

蕙蘭(邱等人,1998)、金線蓮(傅,1997;Cheng and Chou, 1997;楊,2002)、 斑葉穗花蘭(Wong and Sun, 1999)、台灣脈葉蘭(陳,2006)等。

2.4 植物基因轉殖之研究

傳統的植物育種是藉由育種家以人工的方式進行品種的雜交組合,利 用複雜的育種公式在田間進行大規模的雜交試驗,憑藉著多年的經驗在田 間逐一篩選,反複試驗以達到品種改良的目的。傳統的育種方式由於異種 間的雜交不親合性(sexual incompatibility),所以大多限於品種(cultivar)或種 (species)間的基因交換,限制了育種工作的範疇。近十年來,由於遺傳工程

技術的發展,藉由基因轉殖的方法打破了不同物種間的藩籬,使特殊功能 的基因可經由人為操作而送入不同生物體中表現並可穩定的遺傳至後代(吳 和連,1991),不僅精準地加速育種工作,也豐富物種間的多樣性。

基因轉殖(genetic transformation)是指將一個外來的基因穩定地整合插 入(stable integration)受體植物細胞核內,進而使細胞再生出全新植物的過程 (王等,2004)。植物基因轉殖的方法一般可以分為直接基因轉殖法(direct gene transformation)與間接基因轉殖法(indirect gene transformation)兩種。直 接轉殖法是將DNA片段直接導入標的細胞的細胞質或細胞核中,包括電穿 孔法(electroportion)、微注射法(microinjection)、巨量注射法(macroinjection)

、基因槍法(particle bombardment)、電射光束法(laser beam)、花粉管法(pollen

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tube)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol , PEG)等。而間接轉殖法是利用質體 (plasmid)當作攜帶外來基因的載體(vector)藉由媒介將外來基因導入標的細 胞內,包括農桿菌轉殖法(Agrobacterium-mediated transformation)、病毒載體 (virus vector)、脂球體(liposome)等方法(Walden and Wingender,1995),而其 中最常用的就是基因槍法與農桿菌轉殖法。

2.4.1 蘭科植物之基因轉殖

蘭花是蘭科觀賞植物之總稱,也是開花植物中最大類群,約有九百多 屬(genus),三萬五千多種(Arditti, 1992)。蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)、嘉德麗 亞蘭(Cattleya spp.)、東亞蘭(Cymbidium spp.)、石斛蘭(Dendrobium spp.)、仙 履蘭(Paphiopedilum spp.)、文心蘭(Oncidiums spp.)等都是常見的蘭花。蘭花 的育種一般是以雜交育種為主,選擇具有所需性狀的父母親本進行雜交,

再於雜交後代選擇性狀良好的植株。目前,商業所需的性狀包括花色、花 型、香味及抗病性等。利用傳統育種不僅耗費大量的勞力與空間且需時甚 久,甚至會有雜交不親合的問題。因此,應用遺傳工程將所需的特定性狀 送到蘭花基因組(genome)中是較合適的方式(鄭,2003)。

前人研究中以基因槍轉殖的蘭科植物有蝴蝶蘭(Anzai et al., 1996)、東亞 蘭(Yang et al., 1999)、石斛蘭(Kuehnle and Sugii, 1992;Men et al., 2003;Tee and Maziah, 2005;Davina et al., 2007)、文心蘭(李,2000);而用農桿菌轉殖 的蘭科植物有蝴蝶蘭(Belarmino and Mii, 2000;陳,2003;Mishiba et al.,

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2005)、文心蘭(Liau et al., 2003;唐,2006)、石斛蘭(Yu et al., 2001)。

2.4.2 基因轉殖抗生素篩選系統之建立

植物基因轉殖後為減少後續繁複且大量的培養與繼代工作,而在早期 有效率的去除未轉殖成功的植株,所以建立高效率的篩選系統是有其必要 性。篩選系統包括抗生素篩選(Antibiotic selection)、除草劑篩選(Herbicide selection)、記號基因媒介篩選(Scorable gene-mediated selection)和正向篩選 (Positive selection),其中又以抗生素篩選最常被利用。抗生素篩選系統之建 立是在植物進行轉殖前,先利用不同濃度的抗生素進行未轉殖株的存活試 驗,找出能抑制未轉殖株生長的最低抗生素濃度作為篩選濃度。而抗抗生 素基因是在構築轉殖標的基因之初,將帶有抗抗生素的基因構築在標的基 因旁,所以在轉殖後抗抗生素基因會與標的基因一同轉入植物體中一起表 達,使轉殖成功之植株可以在含有抗生素的培養基上存活,以達到初步篩 選的效果。高徵素(hygromycin)和康黴素(kanamycin)是常用的篩選藥劑,作

用機制為在植物的粒線體與葉綠體上,破壞葉綠體的蛋白質合成,使植株 黃化而達到篩選的效果(Wilmink and Dons, 1993)。雖然康黴素在雙子葉植物

上應用的非常普遍,但是在單子葉植物篩選時所需的濃度較高且效果不 好,容易出現假性(false positive)轉殖株,造成鑑定工作的負擔。而用高徵 素篩選蝴蝶蘭時,在濃度50mg/l時就具有篩選效果(Belarmino and Mii, 2000),所以目前大部份的蘭花轉殖都是以高徵素作為篩選藥劑。

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2.5 基因槍基因轉殖法

基因槍法(biolistics)為直接傳遞基因至受體基因組的方法,最早的構想 於1984年由美國康乃爾大學John Sanford教授首先提出,並在1987年第一次 利用基因槍的原理成功地應用在洋蔥表皮細胞轉殖中(Klein et al., 1987)。

2.5.1 基因槍轉殖技術之發展

自從1984年基因槍轉殖技術發展以來,此種操作容易且不受物種限制 的基因傳遞法,廣泛地應用在動物、植物及微生物等許多物種上,包括那 些非常困難轉殖的單子葉作物,如水稻、小麥等皆有成功的例子。基因槍 轉殖法有許多不同的名稱,從最早期稱為微粒投射法(microprojectile)至今 的粒子槍法(particle gun)、粒子轟擊法(particle bombardment)、生物彈道法 (biolistic system or biolistic process)、生物彈珠法(biological ballistics)或是生 物彈道傳送系統(biolistic bioparticle dlivery system)等(曾和劉,2004)。

2.5.2 基因槍轉殖機制

基因槍法的基本原理為藉由類似槍管的儀器,將裸露的DNA附著在鎢 (tungsten)或金粉(gold particle)等高密度金屬微粒(1.0-1.6μm)表面後,利用爆 炸、空氣壓縮、瞬間振動產生的動能高速推力(~300m/sec),將帶有DNA的

金屬微粒射出,以穿透細胞壁與細胞膜,而將附著在金屬粒子表面的基因 傳送到細胞中。早期基因槍是以火藥爆炸所產生的瞬間衝力為動力(Sanford, 1988),但由於危險性高、控制不易、力量太大造成細胞大面積傷害,存活

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再生不易,所以之後發展利用空氣(Oard et al., 1990) 、高電壓(Christou et al., 1991)、氦氣(Finer et al., 1992)等推進系統,但改進效果有限。經過Sanford 等人多次修正與改良後,此設備及操作方式由杜邦公司繼續發展成”Biolistic PDS-1000”而達商品化階段,並搭配可控制的氦氣加速裝置成為PDS-1000/

He系統(圖1)是目前全世界廣為採用的基因槍轉殖設備。其是以高壓氦氣來 啟動轟擊,當氣體在加速管(gas accelerstion tube)的裂磔膜片(rupture disk)爆 裂時,強震波的氣體撞擊大載體片(macrocarrier)上包裏DNA的金屬粒子,

粒子加速進入植物細胞,其上的DNA隨之釋放(曾和劉,2004)。

2.5.3 影響轉殖效率之因素

影響基因槍轉殖之效率,包括粒子加速推力、金屬粒子種類、目標基 因大小、受體材料選擇、DNA附著程序、插入基因的穩定性等因子。粒子 加速推力一般是利用氦氣為動力來源,因為氦氣具有安全性高、價格便宜 及使用便利等優點;金屬粒子的種類早期是利用價格便宜且容易取得之鎢 粒子,但其表面常呈不規則狀,轟擊後會造成細胞的過度傷害且對於某些 作物具有毒害作用,所以目前多數研究人員會選擇價格昂貴的金粉,因為 金粉粒子表面圓滑,於轟擊後對組織的傷害可降至最低,且DNA更易附著 所以其轉殖成功率較高;較小的目標基因容易被金屬粒子攜帶,而10kb以 上的DNA在轟擊加速時易斷裂,導致轉殖率下降; 植物受體材料宜選用由 體胚發生(somatic embryogenesis)的再生途徑,較不易發生嵌合體(chimeric)

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現象; DNA在附著於金屬粒子時會加入氯化鈣(CaCl2),幫助穩定質體的構 型與分散質體DNA。過程中會以無水酒精回溶金屬微粒,可以減少組織汙 染的機會,但需置於冰上減緩揮發速度,且最好在1小時內用完,以免DNA 浸泡太久發生斷裂而降低轉殖率;基因槍法由於是利用轟擊的方法將DNA

傳送至受體基因組中,由於目前其機制未明,所以通常每個細胞會接受過 多的基因套數(copy number),而造成基因默化(transgene silencing)而降低轉 殖率。

2.5.4 基因槍轉殖之優缺點

基因槍轉殖法最大優點為不受植物材料與種類之限制,不似農桿菌有 自然宿主的障礙,也沒有轉殖後細菌復發的疑慮,且轉殖後植株受到的傷 害小恢復較快,又不似電穿孔或PEG等方法需以原生質體(protoplast)為轉殖 受體,增加轉殖後植株的再生能力。目前基因槍轉殖的設備已商業化,具 有操作方便、快速、一次處理大量材料,且試驗材料部位不受限制等優點;

而基因槍轉殖法目前還有設備高單價高、轉殖株易發生嵌合體與標的基因 隨機插入基因組位置不明且數量過多等問題有待克服。

2.6 低壓基因槍簡介

生物鎵低壓基因槍(圖2)不同於以往基因槍的地方,在於它是應用空氣 動力學理論,使氣體經專利設計之噴嘴壓縮而產生高速噴流,以帶動粒子 進入受體。其使用氮氣或氦氣,加上極小的壓力,即可在不傷害細胞與極

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低噪音的條件下,以氣體加速微粒子至極高速度,將攜帶之外來基因送入 動物或植物細胞之細胞質或細胞核,使之表現特殊的生物功能,解決了以 往所遭遇有關於噪音、細胞被高壓震波殺死等問題。震波型基因槍會對組 織造成傷害,形成壞死區(dead zone),但BioWare低壓基因槍則將對目標組 織的殺傷副作用降到最低。雖然使用低壓氣流,但不會影響其正常使用。

BioWare低壓基因槍已取得台灣90125886與美國專利USA 09/990/981。

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第三章、材料與方法

3.1 植物材料 3.1.1 JB7019

妖精蘭(Mormodes),其假莖多肉肥厚,葉片由假莖的底部抽出,外鞘

將假莖層層包覆,花期較晚,一般在落葉後的冬天至隔年的春天由假莖的 中間部份至頂端間開出3-6支的花梗,花有濃郁香味。本實驗是利用妖精蘭 (Mormodes lawremce)自交品系之原球體進行轉殖。

3.1.2 JB6023

對瓣蘭屬(Zygopetalum)原產於巴西,大約有20個種類,特性是具有香氣 且花期持久,而軛瓣蘭(Zygopetalum mackayi)是Zygopetalum屬中常見的栽培 種。本實驗是利用軛瓣蘭之原球體進行轉殖。

3.2低壓基因槍轉殖條件試驗 3.2.1原理

低壓基因槍是依據空氣動力學的理論,在大氣中當噴嘴內外壓差大於 0.9個大氣壓時,即可產生超音速流,再依據兩相流理論,在超音速流中的 微粒,僅需數公分距離,即可由靜止加速到極高的速度。本基因槍原始設 計的理論依據,是現有基因槍產品中從未有的方式。其優點為可利用氦氣 與氮氣做為動力來源、子彈配製容易、使用氣壓較低不會引起細胞傷害而 造成細胞死亡(dead zone) 、操作簡易且消毒方便。

(24)

3.2.2低壓基因槍轉殖條件

將褐色顏料注入低壓基因槍,以測試轉殖之條件。其試驗條件如下:

氦氣壓力分為30、50、70psi;距離為3、6、9公分;DNA注入量為5或10μl。

3.3抗生素篩選系統之建立

在基因轉殖前分別將原球體移入含有Hygromycin(MDBio, Inc.)的篩選 培養基中,試驗濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/l。

移入後二週觀察原球體存活率,以試驗出能抑制未轉殖原球體生長最低之 抗生素濃度,作為轉殖後之篩選濃度。

3.4 DNA序列標誌之設計

由於DNA序列標誌要接在EcoRⅠ和BamHⅠ之間,所以要設計出EcoR

Ⅰ的切位AATTCG和BamHⅠ的切位GATTCG,其間還有21個鹼基所以整個 DNA序列標誌共有27個鹼基對(圖3),而A的序列為AAT TCA AAA AGG GGG CAC CGA AAA AAG與B的序列為AAT TCA AAA AGG GGG CAA

AGA AAA AAG僅差二個鹼基。其中以5個A代表亞洲地區之代碼;5個G代 表台灣之代碼;5個鹼基之排列組合代表品種所有者之註冊代碼;最後以6 個A代表蘭花品種之代碼。

3.5 質體製備 3.5.1 質體構築

(25)

本實驗所用的質體是pCAMBIA1301 長度為 11837bp 其圖譜為(圖 4),

利用

EcoRⅠ(Promega)和 BamHⅠ(Promega)這二種限制酶進行切割後,經由

DNA Clean/Extraction Kit(GeneMark)去除質體切下來不要的片段。再利用 Roche 的接合酶(T4 DNA Ligase),接合 27bpDNA 序列標誌與酵素切割後的 質體。

3.5.1.1 限制酵素(Restriction Enzyme)切割

利 用 Promega 的 限 制 酵 素 BamHⅠ 與 EcoRⅠ 切 割 質 體 (plasmid) pCAMBIA 1301。作用的體積為 EcoRⅠ0.5μl、BamHⅠ0.5μl、pCAMBIA 1301 5μl、10 倍 Buffer 2μl、無菌水 12μl 最終反應量為 20μl,置於 1.5ml 的微量 離心管(eppendorf tube)中,在 37℃中反應過夜(overnight,O/N)。

3.5.1.2 DNA clean up

利用GeneMark 的 DNA Clean/Extraction Kit 去除質體切下來不要的片 段,其反應步驟如下:

1.加入相同體積的 Binding Solution 均勻並以 vortex 混合

2.將 Spin column 放入 Collection tube 中,將反應溶液放入 Spin column 中並 以微量離心機(microfuge)最高轉速(13000rpm)離心,丟棄 Collection tube 中的濾液

3.加入 700μl 的 Wash Solution,並於最高轉速離心 1 分鐘。重覆一次 4.丟棄濾液並於最高轉速離心 3 分鐘去除殘餘的酒精

(26)

5.將 Spin column 轉移至新的離心管並加入 30μl 的 Elution Solution 至 column,靜置 1 分鐘

6.以最高速離心 1 分鐘來洗脫(elute)DNA,將 DNA 存放於離心管並儲存於 -20℃中備用

3.5.1.3 接合作用(Ligation)

利用Roche 的 T4 DNA ligase 接合 27bpDNA 序列標誌與酵素切割完的 質體pCAMBIA1301。作用的體積為 pCAMBIA1301(vector) 8μl、分子標誌 (insert) 2μl、10 倍 Buffer 3μl、T4 DNA ligase 1μl、無菌水 6μl 最終反應量為 20μl,置於 1.5ml 的微量離心管中,在室溫下反應 30 分鐘。接合好 A 的質 體稱為1301A;接合好 B 的質體稱為 1301B。

3.5.2 重組質體轉形作用(transformation)

本實驗是利用電穿孔法(electroporation)進行轉形作用,電穿孔法係應用 高脈衝電壓,讓細胞膜出現短暫、可逆性的開放小孔,以導入外源DNA 分 子轉染入宿主細胞的技術,而本實驗之宿主細胞為大腸桿菌。經由電穿孔 器(BIO-RAD)將構築好的標的質體,轉形至 Yeastern Biotech 的 E.coli compement cell 中,其步驟如下:

1.將電菌管放在冰上預冷

2.加入 40μl E.coli 的 compement cell 與 2μl 構築好的質體 1301B 3.用拭鏡紙擦乾電菌管二邊的電極

(27)

4.管壁凸起朝前,放入電穿孔器(BIO-RAD)往前推至卡住 5.開機Îsetting 選 Manual 調至 1.8vÎpulse Î進行電菌 6.取 1ml LB 培養液至電菌管中混合

7.吸出菌液置於試管,培養在 37℃,200rpm 的震盪器中 1 小時

8.沾取菌液將菌液塗在含有 25ppm kanamycin 的 LB 培養皿(petri dish) 9.將培養皿倒放在 37℃培養箱中 overnight

3.5.3小量質體DNA抽取(miniprep)

3.5.3.1養小量

1.在培養皿底標號各個菌落

2.培養液:含有25ppm Kanamycin(MDBio, Inc.)的LB培養液 3.每個管試管加入5ml的LB培養液

4.用1ml的吸管沾一下菌落,依編號放入試管中

5.培養在37℃ 震盪100rpm黑暗下的培養箱中overnight (16~18小時)

3.5.3.2抽小量

利用Gene-Spin的Plasmid Miniprep Kit進行小量質體DNA抽取,其步驟 如下:

1.從試管中吸出菌液至1.5ml微量離心管8分滿,標上編號 2.離心30秒,去上清液

3.再加菌液至同一個離心管離心,直到菌液用完

(28)

4.加入200μl的SolutionⅠ回溶pellet(離心沈澱物)

5.加入200μl的SolutionⅡ讓DNA變性,上下翻轉混合,等3分鐘 6.加入200μl的SolutionⅢ恢復質體DNA,上下翻轉混合,離心5分鐘 7.離心後取上清液至新的微量離心管

8.加1ml的Isoprepenol(異丙醇) 9.置於-20 30℃ 分鐘或-80℃,15分鐘 10.保持4℃離心13000rpm,10分鐘 11.小心倒掉上清液

12.加入70%酒精(ethanol) 1ml 13.離心2分鐘,去上清液

14.放到操作台吹10分鐘去除酒精 15.加TE(pH8)回溶

16.置於-20℃備用

3.5.4 重組質體之限制酵素分析 利用限制酶切割質體中被取代的限制酶切位與原有的切位,以分辦標

的序列是否有插入質體中,如果標的序列順利被取代,則限制酶就無法切 到原有的切位,與限制酶切割過的原質體比較,即可知標的序列是否已接 入 質 體 中 。 以Promega 的 限 制 酵 素 Kpn Ⅰ 與 Nhe Ⅰ 切 割 質 體 pCAMBIA 1301。KpnⅠ(11041)的切位是在EcoRⅠ(11023)和BamHⅠ(11046)之間, 已

(29)

被標的序列取代,所以有接成功的1301A和1301B會切不到,只有NheⅠ在 pCAMBIA 1301上有二個切位(2014與5058)切出來的二段片段,而原質體 ( pCAMBIA 1301)切起來會有三段,經電泳分析即可知標的序列是否已接入 質體中。作用的體積為KpnⅠ0.5μl、NheⅠ0.5μl、1301A或1301B 5μl、10倍 Buffer 2μl、無菌水12μl最終反應量為20μl,置於1.5ml的微量離心管中,在 37℃中overnight。

3.5.5標的質體瓊膠電泳確認

3.5.5.1 1%瓊脂(Agarose)膠的配製 1.在三角瓶瓶身畫上100 ml刻度

2.1g agarose(MDBIO, Inc.)加1倍的TBE溶液,超過刻度一些 3.微波90秒、60秒、15秒,將agarose煮至清徹

4.待液面到達刻度且agarose已完全溶解 5.放涼至手可握的溫度,約50~60℃

6.倒入放有孔梳(comb)的製膠容器中 7.凝固後放入4℃,5分鐘

8確認凝固後拔出孔梳

9.放到保鮮袋保存在4℃備用 3.5.5.2電泳分析

1. 反應完的DNA要加入6倍的Dye,再以電泳糟內的TBE調整濃度

(30)

2.將1%的瓊脂膠放入電泳糟內倒入1倍的TBE,剛好蓋過膠 3.將1.注入well(孔)

4.以100V進行電泳,待追蹤染劑(bromophenol blue)跑到製膠盒的倒數第二 條線停止,約30分鐘

3.5.5.3染色

1.單手戴手套取膠(不帶製膠盒) 2.放入溴化乙錠(EtBr)中染15分鐘 3.放入無菌水中退染15分鐘

4.將膠放入影像分析儀(UVP Biodoc-ItTM System)中 5.以UV觀察條帶並拍照、記錄

3.6大量質體DNA抽取

3.6.1.1養大量

1.培養液:含有25ppm kanamycin的LB培養液 2.每個三角瓶加入200ml培養液

3.用1 ml的吸管沾一下菌落,連同吸管一起放入三角瓶中 4.培養在37℃ 震盪100rpm黑暗下的培養箱中overnight

3.6.1.2抽大量(maxiprep)

利用VIOGENE的Plasmid Maxiprep Kit抽取1301B質體的DNA,其步驟如 下:

(31)

1.從試管中吸出菌液至50ml離心管8分滿標上編號 2.離心6000×g 15分鐘(離心管稱重誤差0.5g保持平衡) 3.重覆加菌液至離心管,直到菌液用完

4.將Maxi-V500TM Column放入錐形瓶中,加入5ml 98%的酒精,去過濾液 5.加20ml的VP4 Buffer到Maxi-V500TM Column中,去過濾液

6.用10ml的VP1 Buffer回溶pellet

7.加入10ml的VP2 Buffer混合(翻轉10次),等5分鐘 8.加入預冷好10ml的VP3 Buffer混合(翻轉10次) 9.4℃下離心,20000×g 15分鐘

10.將上清液倒入Maxi-V500TM Column中,去過濾液 11.用30ml的VP5 Buffer清洗Column,去過濾液

12.換下方容器,加10ml的VP6 Buffer洗脫,留下清液 13.加入7.5ml(0.75倍)異丙醇(Isoprepenol),混合

14.4℃下離心15000×g 30分鐘,去上清液

15.加入5ml 70%的酒精,洗清,4℃下離心15000×g 10分鐘,去上清液 16.在操作台風乾DNA pellet 10分鐘,用300μl的TE或無菌水(ddH2O)回溶 17.分裝至1.5ml微量離心管

18.存放DNA在-20℃備用

(32)

3.6.2基因槍子彈配製

1.取37μl金粉(母液40mg/ml)、25μl無菌水、5μl 1301B(1μg/μl)放到250μl 微 量離心管中,vortex混合

2.50μl加CaCl2(2.5M)、20μl spermidine (100mM)二者都滴在管壁再一起vortex 10秒混合

3.離心5秒,去上清液

4.加200μl酒精(100%) ,用超音波震盪機(BRANSON)混合一下 5.離心,去上清液

6.在冰上加100μl酒精(100%)

7.每次用量10μl(每次用前都要用超音波震盪一下)

3.7基因槍轉殖流程

1.將配製好的子彈放置在無菌操作台中的冰桶上 2.將低壓基因槍接上氦氣,壓力調整為50psi

3.將欲轉殖之PLB放在9㎝ 培養皿中央,範圍約直徑1㎝,蓋上鐵網 4.取10μl的子彈注入基因槍中

5.基因槍垂直於培養皿穿過鐵網的孔距離為3cm,槍擊

6.將槍擊後的PLB移至MS(Duchefa Biochemie)培養基中,培養一週 7.一週後換到含有hygromycin的MS篩選培養基進行第一次篩選 8.兩週後換到新的篩選培養基進行第二次篩選

(33)

9.兩週後換到新的篩選培養基進行第三次篩選 10.兩週後將存活的PLB移到MS培養基進行培養

3.8 GUS活性組織化學分析

3.8.1 玉米GUS暫時性表達試驗

利用6%次氯酸鈉消毒玉米10分鐘,剝去表皮層露出糊粉層或取出胚,

利用低壓基因槍轉殖1301B,置於MS培養基上,室溫下培養一天,用 X-Gluc(SIGMA)染色,進行組織化學分析。

3.8.2 配製1ml GUS solution

1.以61.5ml的1M K2HPO4與38.5ml的1M KH2PO4配成Phosphate buffer(pH7) 2.再用Phosphate buffer(pH7)為溶劑配製5mM Potassium hexacyanoferrateⅡ

和5mM Potassium hexacyanoferrateⅢ混合的溶液稱之Phosphate buffer 3.利用Phosphate buffer850μl與Dimethyl formamde (DMF) 150μl為溶劑加入

3mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, SIGMA) 4.待X-Gluc 溶解後再加入0.1% Triton X 100

3.8.3去色溶液(destaining solution) 50% 酒精(ethanol)

10% 甲醛(formaldehyde) 5% 醋酸(acetic acid)

(34)

3.8.4染色流程

1.組織浸漬在GUS solution中37℃,overnight

2.將組織移到destaining solution在4℃中反應去除葉綠素 3.直到看見藍色著色或去除葉綠素

3.9 擬轉殖株基因組 DNA 之抽取 1.取 50mg 葉片以液態氮研磨成粉狀

2.加入 1ml CTAB buffer 與 7μl RNaseA(10mg/ml)稍加研磨

3.待溶化成液態後吸入 1.5ml 微量離心管中放置在 65℃,30 分鐘 4.在 4℃下離心 13K rpm,10 分鐘

5.取上清液至新的微量離心管中

6.加 700μl phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1),混合 7.在 4℃下離心 13K rpm,10 分鐘

8.取上層液至新的微量離心管中

9.加 700μl chloroform:isoamyl alcohol (24:1)混合 10.在 4℃下離心 13K rpm,10 分鐘

11.小心吸取上層液,加 0.6~1 倍異丙醇,混合後放在-80℃,15 分鐘以上 12.在 4℃下離心 12K rpm,20 分鐘,去上清液

13.用 200μl 70%酒精 wash pellet,去除酒精 14.用 200μl 100%酒精 wash pellet,去除酒精

(35)

15.將微量離心管置於操作台中吹乾約 10 分鐘,去除殘餘酒精 16.以適量 TE 回溶

17.以分光光度儀(GeneQuant )測 OD 值

3.10 聚合酶鏈鎖反應及定序

3.10.1 PCR ( polymerase chain reaction )

利用Violet的Taq DNA 聚合酵素進行聚合酶鏈鎖反應流程如下:

1.取5’的引子(10mM )1μl、3’的引子(10mM )1μl、Taq DNA聚合酵素

(polymerase)0.5μl、10倍Taq buffer 2μl、2.5mM dNTPs 2μl、無菌水12.5μl 混合成PCR反應溶液,置入250μl的微量離心管中

2.取1μl擬轉殖株的基因組DNA加入19μl的1.,混合,離心 3.取1μl質體(P)加入19μl的1.,混合,離心,作為正對照組

4.取1μl野生型(WT)基因組DNA加入19μl的1.,混合,離心,作負對照組 5.取1μl無菌水加入19μl的1.,混合,離心,作對照組

6.放入PCR反應器(TGRADIENT Biometra)中

7.反應溫度為94℃ 5分鐘,94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒共28個循環,

72℃,10分鐘

8.進行電泳分析或保存在-20℃

9.反應好20μl的PCR產物加入3μl的6倍Dye

10.將1%的膠放入電泳糟內倒入1倍的TBE溶液,剛好蓋過膠

(36)

11.將10.注入well(孔)

12.以100V進行電泳,待追蹤染劑(bromophenol blue)跑到製膠盒的倒數第二 條線停止,約30分鐘

14. 單手戴手套取膠(不帶製膠盒) 15. 放入EtBr中染15分鐘

16. 放入無菌水中退染15分鐘

17. 將膠放入自動顯像機器中以UV觀察條帶並拍照記綠

3.10.2 定序(sequencing)

3.10.2.1 pGEM®-T Easy Vector Ligation

利用Promega 的 LigaFastTM Rapid DNA Ligation System 接合 300bp PCR 產物與 Promega 的 pGEM®-T Easy Vector。作用的體積為 pGEM®-T Easy Vector 0.5μl、300bp PCR 產物 1.5μl、2 倍 Buffer 5μl、ligase 1μl、無菌水 2μl 最終反應量為10μl,置於 1.5ml 的微量離心管,在 22~24℃下反應一個小時。

3.10.2.2 Transformation

利用熱休克的轉形法 (Heat-shock transform)讓 compement cell 的細胞 膜出現短暫、可逆性的開放小孔,以導入外源DNA 分子轉染入宿主細胞的 技術,而本實驗之宿主細胞為大腸桿菌

E.coli compement cell (DH5α)。

將接合好 10μl 的反應液加入 50μl 的 E.coli compement cell 中,置於冰 上3~5 分鐘後迅速放入 42℃水浴中 2 分鐘後迅速插回冰上,加入 150μl SOC 培養液混合後在37℃中培養一個小時。

(37)

3.10.2.3 藍白篩選

pGEM®-T Easy Vector(圖 5)上設計有 lacZ 基因,而 insert 的插入位即在

lacZ 基因中,即當 vector 沒有接合 insert 時,表示 lacZ 基因沒有被破壞,

所以利用IPTG(isopropylthiogalactosidase)當 inducer 可以表現出 lacZ 蛋白(β- galactosidase)而與 X-gal (5-bromo- 4- chloro-3-indoyl- β-D- galactopyranoside)

作用,產生藍色的菌落;反之當 insert 接入 vector 後 lacZ 基因即被破壞,

無法與 X-gal 作用,所以能夠在 LB/Car/X-gal 的培養基上形成白色菌落。

取 50μl 培養後的菌液混入 25μl 的 X-gal(20mg/ml)和 25μl 的 IPTG (50mg/ml),塗在含有 50ng/ml carbenicillin 的 LB 培養皿進行藍白篩選,培 養在37℃下,O/N。

3.10.2.4 小量質體 DNA 抽取(miniprep)

從藍白篩的培養皿中挑選五個白色的獨立菌落在LB 培養液中 37℃、

100rpm 下養小量 O/N,利用 Gene-Spin 的 Plasmid Miniprep Kit 進行小量質 體DNA 抽取,加 30μl 的 TE 回溶,置於-20℃備用。

3.10.2.5 重組質體之限制酵素分析 Promega 的限制酵素 NotⅠ進行重組質體分析。pGEM®-T Easy Vector

上在insert 二端附近各有一個 NotⅠ的切位,利用 NotⅠ切割後會出現一條 略大於PCR 產物 300bp 的條帶與剩下的質體共二條條帶;而出現異常條帶 數與大小者即去除。作用的體積為

NotⅠ0.5μl、重組質體 2μl、10 倍 Buffer

(38)

2μl、無菌水 15.5μl 最終反應量為 20μl,置於 1.5ml 的微量離心管中,在 37℃

中反應O/N。經電泳分析後,一個擬轉殖株編號送二個樣本進行定序分析。

3.10.2.6 定序

將限制酶分析後,出現正常條帶的DNA 送至中央研究院交由定序師以 pGEM®-T Easy Vector 上的 T7 引子,利用自動定序儀進行定序分析。

(39)

第四章、結果

4.1 重組質體之限制酵素分析

由圖 6 可看到 1301A 和 1301B 利用限制酵素 KpnⅠ與 NheⅠ進行切割 後,經由瓊脂電泳進行分析,在電泳圖上均出現

NheⅠ在 2014 和 5458 這二

處切斷將1301A 和 1301B 分成預期大小 8393bp 與 3444bp 的這二段條帶;

而對照組 pCAMBIA 1301 也如預期 KpnⅠ在 EcoRⅠ(11025)和 BamHⅠ (11046)之間的 11041 切出一刀和 NheⅠ在 2014 和 5458 這二處切斷,將 pCAMBIA 1301 分成 5583bp、3444 bp、2810 bp 這三段條帶。證明在 1301A

1301B 中 EcoRⅠ和 BamHⅠ之間的 21bp 確實有被 27bp 的標誌 DNA 序 列(A 或 B)所取代,而重組成 1301A 和 1301B 這二個質體。

4.2 抗生素篩選系統之建立

在基因轉殖前分別將原球體移入含有 hygromycin 的篩選培養基中,試 驗濃度分別為:0、5、10、15、20、25、30、35、40、50mg/l,每個處理十

顆原球體,移入二週後觀察到 JB7019 與 JB6023 之原球體在 hygromycin 20mg/l 的培養基中篩選二週後,其存活率即為 0%;在 hygromycin 20mg/l 以下濃度的培養基中,部份原球體可存活下來 (表一)。所以轉殖後 JB7019 與JB6023 的 hygromycin 篩選濃度為 20mg/l。

(40)

4.3 低壓基因槍轉殖條件

圖 7 是將褐色顏料注入低壓基因槍,以測試轉殖之條件。在試驗條件,

氦氣壓力分為 30、50、70psi;距離為 3、6、9 公分;DNA 注入量為 5 或 10μl 中挑選出槍擊效果最佳的四個處理。從圖 7 可知在槍擊後以氦氣壓力 50psi、3cm、DNA 注入量為 10μl 之槍擊效果較其他三個處理氦氣壓力 30psi、距離 3cm、DNA 注入量為 10μl;氦氣壓力 50psi、距離 6cm、DNA

注入量為10μl;氦氣壓力 70psi、距離 3cm DNA 注入量為 10μl 槍擊條件下,

其槍擊的點較為集中,濃度較深是較適合的槍擊條件。

4.4 GUS 的暫時性表達

玉米糊粉層及胚經由低壓基因槍在50psi的氦氣壓力下、距離3cm、

1301B注入量為10μl的條件下槍擊後,置於MS培養基在室溫下培養一天,

利用X-Gluc染色在37℃反應一天後,在玉米糊粉層與胚上都可以明顯的觀 察到藍色散彈狀的著色(圖8),證明低壓基因槍能將外源DNA送入植物體中 並進行表達。

4.5 聚合酶鏈鎖反應分析及定序 4.5.1PCR

待轉殖植株葉片組織量足夠後即抽取基因組DNA,利用HPT與自行設 計質體上序列之引子對pUC318進行聚合酶鏈鎖反應分析。

(41)

4.5.1.1 HPT引子對

擬轉殖株利用HPT引子經由聚合酶鏈鎖反應擴大增殖抗hygromycin的 hygromycin phosphotransferase (hpt)基因後,以瓊脂電泳分析,在電泳圖上 可以看到妖精蘭轉殖株4、5、17、23、25、26皆增幅出一條509bp的條帶(圖 9);而軛瓣蘭轉殖株8、10、15、19、22(圖10)也幅出一條509bp的條帶。

4.5.1.2 pUC318引子對

擬轉殖株利用pUC300和pUC18L為引子經由聚合酶鏈鎖反應擴大增殖 1301B上從HindⅢ多重選殖位(multiple cloning site )開始到上游300bp之間的 序列(圖11)此段序列包含轉入的B序列,以瓊脂電泳分析,在電泳圖上可以 看到妖精蘭轉殖株4、5、17、23、25、26 (圖12)、33、35、36、37、38、

39、40(圖13)皆增幅出一條300bp的條帶。

4.5.1.3轉殖株再生葉片PCR測試

將轉殖株葉片由基部全部去除,待長出新葉片後即抽取基因組DNA再 進行PCR測試,以證明PCR增幅之條帶非轉殖後殘留之外源DNA。經由HPT 與pUC318引子對電泳後,經由瓊脂電泳分析,在電泳圖上可以看到妖精蘭 轉殖株4、5、17皆各別增幅出一條509bp與300bp(圖14)的條帶。

4.5.2 定序

將擬轉殖株利用pUC300與pUC18L這二個引子進行PCR後300bp的產 物,利用自動定序儀進行定序分析。由於自動定序儀在進行定序時DNA片

(42)

段前後各20~30bp會消除,而pUC18L引子太靠近標的序列,所以會影響定 出序列的完整性,所以即利用PCR後DNA片段前後會帶有A的特性,將此產 物先接在TA質體(pGEM-T Easy Vector)上,再利用T7引子進行定序分析。

定序結果顯示在妖精蘭轉殖株4號中,確實有轉入設計好的B序列(圖15);38 號轉殖株有轉入1301A標誌(圖16);而其餘的轉殖株皆為質體1301之序列。

4.6 低壓基因槍之轉殖率

本試驗由於早期轉殖後進行篩選之植株存活率極低,幾乎沒有存活之

植株,所以即將移篩選培養基後原培養皿所剩原球體,移至不含抗生素之 培養基中進行培養,待長成植株後即抽取基因組DNA進行PCR分析。本研 究利用低壓基因槍轉殖妖精蘭共有13棵轉殖株,若以轉殖時原球體的數目 為分母,則轉殖率平均為1.85%;如果以轉殖後直接不經篩選的原球體為分 母,則轉殖率平均為10%。而軛辦蘭經低壓基因槍轉殖後共有5棵轉殖株,

平均轉殖率為6.25%;且轉殖株之形態與一般植株無異(圖17)。

(43)

第五章、討論

5.1抗生素篩選系統

植物基因轉殖後為減少後續繁複且大量的培養與繼代工作,而在早期 有效率的去除未轉殖成功的植株,所以建立高效率的篩選系統是有其必要 性。抗生素篩選系統之建立是在植物進行轉殖前,先利用不同濃度的抗生 素進行未轉殖株的存活試驗,找出能抑制未轉殖株生長的最低抗生素濃度 作為篩選濃度。而抗抗生素基因是在構築轉殖標的基因之初,將帶有抗抗 生素的基因構築在標的基因旁,所以在轉殖後抗抗生素基因會與標的基因 一同轉入植物體中一起表達,使轉殖成功之植株可以在含有抗生素的培養 基上存活,以達到初步篩選的效果。本實驗所用之質體pCAMBIA 1301上帶 有之篩選基因為hpt (hygromycin phosphotransferase)基因,對hygromycin抗生 素具有抗性。在實驗前期轉殖後之原球體經由抗生素篩選培養基三次篩選 後,存活下來的很少甚至存活下來之原球體也會陸續褐化,經抗生素篩選 後存活率為0%。鄭(2003)在轉殖文心蘭時也有遇到類似的情形,文心蘭在 天然抗性測試時篩選濃度為20mg/l G418,但轉殖株經由此濃度篩選後存活 率為0%,她在討論中認為可能是因為培植體的種類及生長階段不同所造 成。本研究中轉殖株不耐篩選劑篩選除了可能是因為未轉殖成功外,極有 可能是原球體轉殖時受到金粉粒子衝擊受到嚴重之物理傷害,使其對抗生 素之耐受力不如之前抗生素篩選系統之結果所致。因此,在實驗後期轉殖

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後會降低原球體抗生素之篩選濃度進行篩選,但篩選後存活率仍不佳,所 以之後是以生長在不含抗生素之培養基中未經篩選之植株進行轉殖株之分 析。進一步進行原球體槍擊後抗生素耐受力試驗發現,未經轉殖之原球體 經由金粉粒子槍擊後,其對抗生素之耐受性會明顯地降低(表二)。因此,本

研究前期之轉殖株之所以不耐抗生素而大量褐化,可能是因為轉殖後之植 株被攜帶質體所用之金粒子創傷而造成對抗生素耐受力降低所致。

5.2低壓基因槍轉殖條件

在前人的研究中顯示以Bio-Rad公司的Biolistic (PDS1000/He) Particle Delivery System型基因槍轉殖蘭花時,在氦氣壓力650psi(許,1997)、650及 900psi (謝和黃,1995)、1100psi (林,1999)和1550psi (Chi et al., 1998)的高 氦氣壓力條件下GUS的暫時性表現最好;而利用氦氣壓力1100psi轉殖石斛 蘭原球體(Yu et al., 1999)與文心蘭類原球體(李,2000)皆可獲得具有抗性之 擬轉殖株;石斛蘭利用1350psi的氦氣壓力有較高的轉殖率(Davina et al., 2007)。而國人自行研發之生物鎵(BioWare)低壓基因槍,利用在動物轉殖上 是以50psi的氦氣壓力的效果最佳(Cheng et al., 2005)。在本實驗中是首次利 用在植物體基因轉殖的穩定性表現﹙stable xpression﹚的研究,而在槍擊條 件試驗中以氦氣壓力50psi、距離3cm、DNA注入量10μl的槍擊效果較佳,其 著色的範圍集中且濃度較濃;而在利用70psi或30psi的氦氣壓力配合不同距 離的槍擊條件,其染劑經槍擊後會較為分散力量不集中且濃度也較低。進

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一步利用玉米糊粉層與胚GUS的暫時性表達分析與1301B分子標誌轉殖妖 精蘭之定序分析証明,生物鎵低壓基因槍有別於以往Bio-Rad公司的Biolistic 型基因槍只需利用低於50psi的氦氣為動力即有能力將外源DNA送入植物體 中。

5.3重組質體酵素切割確認

本研究中重組質體雖然可以利用KpnⅠ與NheⅠ進行切割,經由瓊脂電 泳進行分析,從條帶數可直接証明分子標誌有接入質體中;卻無法證明質 體中完全不含有未接成功之質體。所以在試驗後期進行定序分析時即發 現,部分轉殖株為轉入pCAMIBA1301質體之序列,而轉殖株中正確轉入分 子標誌之機率則為16.7%。

5.4 GUS的暫時性表達﹙transient expression﹚

本實驗中所用之質體pCAMBIA 1301上帶有的報導基因(reporter genes) 為gus,這種報導基因是在細胞轉殖後24小時內就可以進行的短暫分析(徐,

2004)。gus基因在轉殖後會產生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase),其在植物 組織中表現的機制是以X-Gluc(5-bromo-4-chloro-indolyl glucuronide)為受質 (substrae) 經由X-Gluc染色溶液浸泡在37℃下反應催化後會產5-bromo-4- hloro-indigo經氧化作用組織會呈現藍色的著色,因此可以藉由這種短暫表 現之快速視覺確認的標記,作為在轉殖初期確定基因是否有進入轉殖細胞

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中的證據,但是有最高的暫時性表現率,並不表示將來一定會得到最多的 轉殖植株,真正的轉殖效率,必須以再生植株中有轉殖基因穩定表現的效 率為準(劉,2003)。在本實驗中利用玉米糊粉層及胚進行低壓基因槍轉殖之 暫時性表達的測試,經GUS的組織化學分析可證實低壓基因槍在50psi的低 氦氣壓力下可以順利的將外源DNA送入植物體細胞中。

本研究中轉殖株葉片經GUS組織化學分析,其GUS表現量不如預期,

可能是因為植物體表現部位(Duchesns and Charest, 1992)、細胞生長時期與 環境(Gallo-Meagher and Irvine , 1993)和DNA甲基化(Klein et al., 1990)等因 素所造成之表現差異。

5.5低壓基因槍轉殖

由生物鎵公司所提供之小鼠表皮活體試驗中BioWare低壓基因槍與 Bio-Rad基因槍之比較(表三),可知BioWare低壓基因槍其優點為,使用極小 的氣體壓力為動力,即可在不傷害細胞與極低噪音的條件下,以氣體加速 微粒子至極高速度,將攜帶之外來基因送入動物細胞之細胞質或細胞核,

使之表現特殊的生物功能,解決了以往所遭遇有關於噪音、細胞被高壓震 波殺死等問題且將對目標組織的殺傷副作用降到最低。而本實驗進一步的 將BioWare低壓基因槍應用在植物體細胞上,不僅初步地利用玉米糊粉層及 胚GUS的暫時性表現來證實低壓基因槍應用在植物體上之可行性,更進一 步的將分子標誌1301B轉殖蘭花原球體經由PCR與定序分析證實,低壓基因

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槍在利用50psi的低氦氣壓力下,就可以順利地將外源DNA轉殖至植物體上。

5.6轉殖效率

轉殖技術中最難突破的是轉殖效率過低的問題。雖然不論農桿菌法或 基因槍法,都可成功的將外來基因送入具再生能力的植物細胞中,但其中 只有一部份細胞能真正接收外來基因,而在這一小部份的細胞中,又只有 更少的細胞能穩定的表現外來基因,並遺傳至子代。因此在轉殖試驗中,

需要正確計算轉殖效率(劉,2003)。由於蘭科植物營養生長期長且組織培養 時易產生酚類物質影響植株生長與分化,因此在基因轉殖方面有時效及生 理上等困難度。在基因槍轉殖蘭科植物的前人研究中顯示,蝴蝶蘭的轉殖 率為0.52%(邱,1999)、1%( Anzai, 1996)、2.5%(黃,2001);石斛蘭的轉殖 率為5%(Yu et al., 1999)、春石斛和秋石斛的轉殖率為12%和2%( Men et al., 2003);東亞蘭的轉殖率為15% (Yang et al., 1999)。目前本研究利用低壓基 因槍轉殖妖精蘭與軛辦蘭的轉殖率平均為1.85%與6.25%。轉殖率是由PCR 確認之轉殖株為分子,槍擊原球體的數量為分母所計算出之比率。由於妖 精蘭是早期轉殖試驗所用之品種,經由抗生素三次篩選後轉殖株存活率很 低,所以直接將恢復培養基中進行篩選後剩餘之少部分原球體,移植至不 含抗生素之培養基進行繼代培養,待植株組織量足夠後直接進行PCR分析故 轉殖率偏低;若以不經篩選之原球體為分母,則妖精蘭的轉殖率平均為 10%。本試驗利用低壓基因槍轉殖蘭科植物結果顯示其平均轉殖率,並不亞

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於Bio-Rad公司的Biolistic (PDS1000/He) Particle Delivery System型基因槍利 用高氦氣壓力時的轉殖率。

5.7植物品種鑑定系統

以外表形態直接進行品種鑑定,是目前普遍分辨物種之方式,但卻容 易受到形態相似及鑑定人員之觀點、植物生育時期與環境不同而在鑑定時 會產生差異(傅等人,1997)。蘭科植物由於幼年性長,利用傳統的鑑定技術 相當更是耗時(陳,1995)。而利用同功酶的鑑定技術能區別不同物種,但在

不同時期偵測、植物取樣部位及發育階段不同時,很容易使鑑定結果發生 偏差。DNA分子標誌技術是直接鑑定植物基因之遺傳變異,此方式不會因

為植物所處環境而有所變化,也不受鑑定植物之生育時期及人為因素所影 響,比傳統的植物形態鑑定方式更客觀、準確、直接且快速(傅等人,1997)。

新一代利用PCR的分子標誌技術容易受到標誌片段數目影響鑑定時的穩定 度(Pejic et al., 1998)。RFLP分析所需要的DNA量相對較多且費用較高,技 術不易自動化,又有篩選同質探針的困難,所以較為費時;RAPD分析最大 的問題就是進行PCR時鍊合溫度(annealing temperature)較低,容易引起錯誤 的配對(mismatch),造成增幅產物的再現性及一致性不佳;SSR的利用受限 於引子的取得,因為必須先將DNA定序或去基因銀行中尋找相關的序列,

才能合成引子,所需的時間與經費較多;AFLP為顯隱性的分子標誌,需配 合完整的譜系資料才可以進行區別(曾,2000)。而這些分子標誌都是在鑽研

(49)

發掘植物品種間形態、生理生化或染色體上可利用的差異,作為品種登記 鑑定的依據。然而自然界中植物種類非常多且繁雜,而人類所利用的栽培 品系(variety)早已超越分類品種(species)的研究範疇,其中又以蝴蝶蘭 最為明顯,全世界只有50種蝴蝶蘭原種,但已申請命名登錄的雜交品系非

常多,而未申請登錄者更多,因此要由有限的蝴蝶蘭品種本身發展出可適 用於品系間高複雜性的登記鑑定方法,可想而知會遇到的困難(高,2003)。

蘭花種苗生產主要使用兩種途徑,其一為雜交授粉後經無菌播種,生 產實生苗(李,1990);另一途徑為利用組織培養誘導擬原球體(Islam et al., 1998)或芽切芽的增殖方式進行繁殖。本研究將設計好DNA序列標誌轉殖至 妖精蘭與軛瓣蘭,將轉殖株之葉片由基部剪去,使其再生葉片再進行PCR

分析,結果顯示轉殖株再生之組織亦帶有分子標誌。利用轉殖株誘導之分 生苗皆會帶有此分子標誌,品種權所有者可以具體以PCR或定序等方式確認 DNA序列標誌,可作為新興的分子標誌系統。

5.8 結論

台灣農業生產成本高,因此必需重視種源權之保護,使本身站穩在蘭 花產業上游的地位,以育種質量保持在國際市場中的競爭力。在美國,以 人為方法所改變製造培育出來的植物新品種是可以取得專利。基於避免壟 斷,影響農業之正常經營與運作之考量,我國對於植物新品種尚不給予專 利保護。但為鼓勵重點研發,我國對於某些特定植物之新品種給予植物種

(50)

苗法之保護。通常保護期間是十五年,權利人除享有使用權,尚有推廣銷 售之權利與義務(梁和謝,2003)。但目前在植物品種認證工作上,往往還是

停留在以外在表現型為主的判斷,此法雖行之有年,但讓人詬病的地方還 是很多。 所以建立一套客觀且具公信力之植物品種認證系統(附錄一)是刻 不容緩的。本實驗利用核苷酸排列組合的多樣性,來代表植物品種所有者 等資料,設計之 DNA 標誌序列去除前後限制酶切位之序列外,尚有 21 個 鹼基可以進行排列組合,故有421種組合輔以數字即可成為基因認證代碼,

配合適當政策即可建立蘭花專屬的品系登記與註冊系統(附錄二)。將設計好 之分子標誌經由生物鎵低壓基因槍轉殖入植物基因組中,穩定遺傳到其有 性或無性增殖子代。因此,該植物品種的量產子代可以非常具體的以聚合 酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)、生物晶片(Biochip)或 DNA 定 序(DNA sequencing)等方式,讀出其 DNA 序列所代表的品種所有者資料,

藉以完全保護品種所有者之品種權。對於植物產品、育種、智慧財產權和 糾紛的仲裁,以及整個農業生產體系的各個環節、進出口市場和植物品種 國家法令政策,得以明確完整的保護,確保我國政府及民間業者長久以來 累積的品種資源和實力,免於國內外業者以生物技術無償量產分生苗低價 回銷自有品種及混亂市場的威脅,亦增加品種所有者之收益,促進育種者 育種之意願提升國家整體之種源實力。本研究不僅成功地將分子標誌轉殖 至妖精蘭,更是首次成功地將低壓基因槍應用在植物轉殖試驗上。

(51)

第六章、參考文獻

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數據

圖 1. Biolistic PDS-1000/He 粒子撞擊基因傳送系統

圖 1.

Biolistic PDS-1000/He 粒子撞擊基因傳送系統 p.60
圖 4. pCAMBIA1301 之圖譜 ( CAMBIA 網站的資料)

圖 4.

pCAMBIA1301 之圖譜 ( CAMBIA 網站的資料) p.63
圖 5. pGEM ® -T Easy Vector circle 之圖譜(Promega 網站的資料)

圖 5.

pGEM ® -T Easy Vector circle 之圖譜(Promega 網站的資料) p.64
圖 11. pCAMBIA-1301 上引子序列的位置

圖 11.

pCAMBIA-1301 上引子序列的位置 p.70
圖 17.  低壓基因槍轉殖的轉殖株在組培瓶中之形態  A:妖精蘭 ( Mormodes lawrence)

圖 17.

低壓基因槍轉殖的轉殖株在組培瓶中之形態 A:妖精蘭 ( Mormodes lawrence) p.76

參考文獻

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