第三章、 材料與方法
3.5 質體製備
本實驗所用的質體是pCAMBIA1301 長度為 11837bp 其圖譜為(圖 4)，
利用
EcoRⅠ(Promega)和 BamHⅠ(Promega)這二種限制酶進行切割後，經由
DNA Clean/Extraction Kit(GeneMark)去除質體切下來不要的片段。再利用 Roche 的接合酶(T4 DNA Ligase)，接合 27bpDNA 序列標誌與酵素切割後的 質體。3.5.1.1 限制酵素(Restriction Enzyme)切割
利 用 Promega 的 限 制 酵 素 BamHⅠ 與 EcoRⅠ 切 割 質 體 (plasmid) pCAMBIA 1301。作用的體積為 EcoRⅠ0.5μl、BamHⅠ0.5μl、pCAMBIA 1301 5μl、10 倍 Buffer 2μl、無菌水 12μl 最終反應量為 20μl，置於 1.5ml 的微量 離心管(eppendorf tube)中，在 37℃中反應過夜(overnight，O/N)。
3.5.1.2 DNA clean up
利用GeneMark 的 DNA Clean/Extraction Kit 去除質體切下來不要的片 段，其反應步驟如下：
1.加入相同體積的 Binding Solution 均勻並以 vortex 混合
2.將 Spin column 放入 Collection tube 中，將反應溶液放入 Spin column 中並 以微量離心機（microfuge）最高轉速(13000rpm)離心，丟棄 Collection tube 中的濾液
3.加入 700μl 的 Wash Solution，並於最高轉速離心 1 分鐘。重覆一次 4.丟棄濾液並於最高轉速離心 3 分鐘去除殘餘的酒精
5.將 Spin column 轉移至新的離心管並加入 30μl 的 Elution Solution 至 column，靜置 1 分鐘
6.以最高速離心 1 分鐘來洗脫(elute)DNA，將 DNA 存放於離心管並儲存於 -20℃中備用
3.5.1.3 接合作用(Ligation)
利用Roche 的 T4 DNA ligase 接合 27bpDNA 序列標誌與酵素切割完的 質體pCAMBIA1301。作用的體積為 pCAMBIA1301(vector) 8μl、分子標誌 (insert) 2μl、10 倍 Buffer 3μl、T4 DNA ligase 1μl、無菌水 6μl 最終反應量為 20μl，置於 1.5ml 的微量離心管中，在室溫下反應 30 分鐘。接合好 A 的質 體稱為1301A；接合好 B 的質體稱為 1301B。
3.5.2 重組質體轉形作用(transformation)
本實驗是利用電穿孔法(electroporation)進行轉形作用，電穿孔法係應用 高脈衝電壓，讓細胞膜出現短暫、可逆性的開放小孔，以導入外源DNA 分 子轉染入宿主細胞的技術，而本實驗之宿主細胞為大腸桿菌。經由電穿孔 器(BIO-RAD)將構築好的標的質體，轉形至 Yeastern Biotech 的 E.coli compement cell 中，其步驟如下：
1.將電菌管放在冰上預冷
2.加入 40μl E.coli 的 compement cell 與 2μl 構築好的質體 1301B 3.用拭鏡紙擦乾電菌管二邊的電極
4.管壁凸起朝前，放入電穿孔器(BIO-RAD)往前推至卡住 5.開機Îsetting 選 Manual 調至 1.8vÎpulse Î進行電菌 6.取 1ml LB 培養液至電菌管中混合
7.吸出菌液置於試管，培養在 37℃，200rpm 的震盪器中 1 小時
8.沾取菌液將菌液塗在含有 25ppm kanamycin 的 LB 培養皿(petri dish) 9.將培養皿倒放在 37℃培養箱中 overnight
3.5.3小量質體DNA抽取(miniprep)
3.5.3.1養小量
1.在培養皿底標號各個菌落
2.培養液：含有25ppm Kanamycin(MDBio, Inc.)的LB培養液 3.每個管試管加入5ml的LB培養液
4.用1ml的吸管沾一下菌落，依編號放入試管中
5.培養在37℃ 震盪100rpm黑暗下的培養箱中overnight (16~18小時)
3.5.3.2抽小量
利用Gene-Spin的Plasmid Miniprep Kit進行小量質體DNA抽取，其步驟 如下：
1.從試管中吸出菌液至1.5ml微量離心管8分滿，標上編號 2.離心30秒，去上清液
3.再加菌液至同一個離心管離心，直到菌液用完
4.加入200μl的SolutionⅠ回溶pellet(離心沈澱物)
5.加入200μl的SolutionⅡ讓DNA變性，上下翻轉混合，等3分鐘 6.加入200μl的SolutionⅢ恢復質體DNA，上下翻轉混合，離心5分鐘 7.離心後取上清液至新的微量離心管
8.加1ml的Isoprepenol(異丙醇) 9.置於-20 30℃ 分鐘或-80℃，15分鐘 10.保持4℃離心13000rpm，10分鐘 11.小心倒掉上清液
12.加入70%酒精(ethanol) 1ml 13.離心2分鐘，去上清液
14.放到操作台吹10分鐘去除酒精 15.加TE(pH8)回溶
16.置於-20℃備用
3.5.4 重組質體之限制酵素分析 利用限制酶切割質體中被取代的限制酶切位與原有的切位，以分辦標
的序列是否有插入質體中，如果標的序列順利被取代，則限制酶就無法切 到原有的切位，與限制酶切割過的原質體比較，即可知標的序列是否已接 入 質 體 中 。 以Promega 的 限 制 酵 素 Kpn Ⅰ 與 Nhe Ⅰ 切 割 質 體 pCAMBIA 1301。KpnⅠ(11041)的切位是在EcoRⅠ(11023)和BamHⅠ(11046)之間， 已
被標的序列取代，所以有接成功的1301A和1301B會切不到，只有NheⅠ在 pCAMBIA 1301上有二個切位(2014與5058)切出來的二段片段，而原質體 ( pCAMBIA 1301)切起來會有三段，經電泳分析即可知標的序列是否已接入 質體中。作用的體積為KpnⅠ0.5μl、NheⅠ0.5μl、1301A或1301B 5μl、10倍 Buffer 2μl、無菌水12μl最終反應量為20μl，置於1.5ml的微量離心管中，在 37℃中overnight。
3.5.5標的質體瓊膠電泳確認
3.5.5.1 1%瓊脂(Agarose)膠的配製 1.在三角瓶瓶身畫上100 ml刻度
2.1g agarose(MDBIO, Inc.)加1倍的TBE溶液，超過刻度一些 3.微波90秒、60秒、15秒，將agarose煮至清徹
4.待液面到達刻度且agarose已完全溶解 5.放涼至手可握的溫度，約50~60℃
6.倒入放有孔梳(comb)的製膠容器中 7.凝固後放入4℃，5分鐘
8確認凝固後拔出孔梳
9.放到保鮮袋保存在4℃備用 3.5.5.2電泳分析
1. 反應完的DNA要加入6倍的Dye，再以電泳糟內的TBE調整濃度
2.將1%的瓊脂膠放入電泳糟內倒入1倍的TBE，剛好蓋過膠 3.將1.注入well(孔)
4.以100V進行電泳，待追蹤染劑(bromophenol blue)跑到製膠盒的倒數第二 條線停止，約30分鐘
3.5.5.3染色
1.單手戴手套取膠(不帶製膠盒) 2.放入溴化乙錠(EtBr)中染15分鐘 3.放入無菌水中退染15分鐘
4.將膠放入影像分析儀(UVP Biodoc-ItTM System)中 5.以UV觀察條帶並拍照、記錄