結果

4.1 重組質體之限制酵素分析

由圖 6 可看到 1301A 和 1301B 利用限制酵素 KpnⅠ與 NheⅠ進行切割 後，經由瓊脂電泳進行分析，在電泳圖上均出現

NheⅠ在 2014 和 5458 這二

而對照組 pCAMBIA 1301 也如預期 KpnⅠ在 EcoRⅠ(11025)和 BamHⅠ (11046)之間的 11041 切出一刀和 NheⅠ在 2014 和 5458 這二處切斷，將 pCAMBIA 1301 分成 5583bp、3444 bp、2810 bp 這三段條帶。證明在 1301A

和 1301B 中 EcoRⅠ和 BamHⅠ之間的 21bp 確實有被 27bp 的標誌 DNA 序 列(A 或 B)所取代，而重組成 1301A 和 1301B 這二個質體。

4.2 抗生素篩選系統之建立

在基因轉殖前分別將原球體移入含有 hygromycin 的篩選培養基中，試 驗濃度分別為：0、5、10、15、20、25、30、35、40、50mg/l，每個處理十

顆原球體，移入二週後觀察到 JB7019 與 JB6023 之原球體在 hygromycin 20mg/l 的培養基中篩選二週後，其存活率即為 0%；在 hygromycin 20mg/l 以下濃度的培養基中，部份原球體可存活下來 (表一)。所以轉殖後 JB7019 與JB6023 的 hygromycin 篩選濃度為 20mg/l。

4.3 低壓基因槍轉殖條件

圖 7 是將褐色顏料注入低壓基因槍，以測試轉殖之條件。在試驗條件，

氦氣壓力分為 30、50、70psi；距離為 3、6、9 公分；DNA 注入量為 5 或 10μl 中挑選出槍擊效果最佳的四個處理。從圖 7 可知在槍擊後以氦氣壓力 50psi、3cm、DNA 注入量為 10μl 之槍擊效果較其他三個處理氦氣壓力 30psi、距離 3cm、DNA 注入量為 10μl；氦氣壓力 50psi、距離 6cm、DNA

注入量為10μl；氦氣壓力 70psi、距離 3cm DNA 注入量為 10μl 槍擊條件下，

其槍擊的點較為集中，濃度較深是較適合的槍擊條件。

4.4 GUS 的暫時性表達

玉米糊粉層及胚經由低壓基因槍在50psi的氦氣壓力下、距離3cm、

1301B注入量為10μl的條件下槍擊後，置於MS培養基在室溫下培養一天，

利用X-Gluc染色在37℃反應一天後，在玉米糊粉層與胚上都可以明顯的觀 察到藍色散彈狀的著色(圖8)，證明低壓基因槍能將外源DNA送入植物體中 並進行表達。

4.5 聚合酶鏈鎖反應分析及定序 4.5.1PCR

待轉殖植株葉片組織量足夠後即抽取基因組DNA，利用HPT與自行設 計質體上序列之引子對pUC318進行聚合酶鏈鎖反應分析。

4.5.1.1 HPT引子對

擬轉殖株利用HPT引子經由聚合酶鏈鎖反應擴大增殖抗hygromycin的 hygromycin phosphotransferase (hpt)基因後，以瓊脂電泳分析，在電泳圖上 可以看到妖精蘭轉殖株4、5、17、23、25、26皆增幅出一條509bp的條帶(圖 9)；而軛瓣蘭轉殖株8、10、15、19、22(圖10)也幅出一條509bp的條帶。

4.5.1.2 pUC318引子對

擬轉殖株利用pUC300和pUC18L為引子經由聚合酶鏈鎖反應擴大增殖 1301B上從HindⅢ多重選殖位(multiple cloning site )開始到上游300bp之間的 序列(圖11)此段序列包含轉入的B序列，以瓊脂電泳分析，在電泳圖上可以 看到妖精蘭轉殖株4、5、17、23、25、26 (圖12)、33、35、36、37、38、

39、40(圖13)皆增幅出一條300bp的條帶。

4.5.1.3轉殖株再生葉片PCR測試

將轉殖株葉片由基部全部去除，待長出新葉片後即抽取基因組DNA再 進行PCR測試，以證明PCR增幅之條帶非轉殖後殘留之外源DNA。經由HPT 與pUC318引子對電泳後，經由瓊脂電泳分析，在電泳圖上可以看到妖精蘭 轉殖株4、5、17皆各別增幅出一條509bp與300bp(圖14)的條帶。

4.5.2 定序

將擬轉殖株利用pUC300與pUC18L這二個引子進行PCR後300bp的產 物，利用自動定序儀進行定序分析。由於自動定序儀在進行定序時DNA片

段前後各20~30bp會消除，而pUC18L引子太靠近標的序列，所以會影響定 出序列的完整性，所以即利用PCR後DNA片段前後會帶有A的特性，將此產 物先接在TA質體(pGEM-T Easy Vector)上，再利用T7引子進行定序分析。

定序結果顯示在妖精蘭轉殖株4號中，確實有轉入設計好的B序列(圖15)；38 號轉殖株有轉入1301A標誌(圖16)；而其餘的轉殖株皆為質體1301之序列。

4.6 低壓基因槍之轉殖率

本試驗由於早期轉殖後進行篩選之植株存活率極低，幾乎沒有存活之

植株，所以即將移篩選培養基後原培養皿所剩原球體，移至不含抗生素之 培養基中進行培養，待長成植株後即抽取基因組DNA進行PCR分析。本研 究利用低壓基因槍轉殖妖精蘭共有13棵轉殖株，若以轉殖時原球體的數目 為分母，則轉殖率平均為1.85%；如果以轉殖後直接不經篩選的原球體為分 母，則轉殖率平均為10%。而軛辦蘭經低壓基因槍轉殖後共有5棵轉殖株，

平均轉殖率為6.25%；且轉殖株之形態與一般植株無異(圖17)。