第三章、 材料與方法
3.10 聚合酶鏈鎖反應及定序
3.10.1 PCR ( polymerase chain reaction )
利用Violet的Taq DNA 聚合酵素進行聚合酶鏈鎖反應流程如下：
1.取5’的引子(10mM )1μl、3’的引子(10mM )1μl、Taq DNA聚合酵素
(polymerase)0.5μl、10倍Taq buffer 2μl、2.5mM dNTPs 2μl、無菌水12.5μl 混合成PCR反應溶液，置入250μl的微量離心管中
2.取1μl擬轉殖株的基因組DNA加入19μl的1.，混合，離心 3.取1μl質體(P)加入19μl的1.，混合，離心，作為正對照組
4.取1μl野生型(WT)基因組DNA加入19μl的1.，混合，離心，作負對照組 5.取1μl無菌水加入19μl的1.，混合，離心，作對照組
6.放入PCR反應器(TGRADIENT Biometra)中
7.反應溫度為94℃ 5分鐘，94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒共28個循環，
72℃，10分鐘
8.進行電泳分析或保存在-20℃
9.反應好20μl的PCR產物加入3μl的6倍Dye
10.將1%的膠放入電泳糟內倒入1倍的TBE溶液，剛好蓋過膠
11.將10.注入well(孔)
12.以100V進行電泳，待追蹤染劑(bromophenol blue)跑到製膠盒的倒數第二 條線停止，約30分鐘
14. 單手戴手套取膠(不帶製膠盒) 15. 放入EtBr中染15分鐘
16. 放入無菌水中退染15分鐘
17. 將膠放入自動顯像機器中以UV觀察條帶並拍照記綠
3.10.2 定序(sequencing)
3.10.2.1 pGEM®-T Easy Vector Ligation
利用Promega 的 LigaFastTM Rapid DNA Ligation System 接合 300bp PCR 產物與 Promega 的 pGEM®-T Easy Vector。作用的體積為 pGEM®-T Easy Vector 0.5μl、300bp PCR 產物 1.5μl、2 倍 Buffer 5μl、ligase 1μl、無菌水 2μl 最終反應量為10μl，置於 1.5ml 的微量離心管，在 22~24℃下反應一個小時。
3.10.2.2 Transformation
利用熱休克的轉形法 (Heat-shock transform)讓 compement cell 的細胞 膜出現短暫、可逆性的開放小孔，以導入外源DNA 分子轉染入宿主細胞的 技術，而本實驗之宿主細胞為大腸桿菌
E.coli compement cell (DH5α)。
將接合好 10μl 的反應液加入 50μl 的 E.coli compement cell 中，置於冰 上3~5 分鐘後迅速放入 42℃水浴中 2 分鐘後迅速插回冰上，加入 150μl SOC 培養液混合後在37℃中培養一個小時。
3.10.2.3 藍白篩選
pGEM®-T Easy Vector(圖 5)上設計有 lacZ 基因，而 insert 的插入位即在
lacZ 基因中，即當 vector 沒有接合 insert 時，表示 lacZ 基因沒有被破壞，
所以利用IPTG(isopropylthiogalactosidase)當 inducer 可以表現出 lacZ 蛋白(β- galactosidase)而與 X-gal (5-bromo- 4- chloro-3-indoyl- β-D- galactopyranoside)
作用，產生藍色的菌落；反之當 insert 接入 vector 後 lacZ 基因即被破壞，
無法與 X-gal 作用，所以能夠在 LB/Car/X-gal 的培養基上形成白色菌落。
取 50μl 培養後的菌液混入 25μl 的 X-gal(20mg/ml)和 25μl 的 IPTG (50mg/ml)，塗在含有 50ng/ml carbenicillin 的 LB 培養皿進行藍白篩選，培 養在37℃下，O/N。
3.10.2.4 小量質體 DNA 抽取(miniprep)
從藍白篩的培養皿中挑選五個白色的獨立菌落在LB 培養液中 37℃、
100rpm 下養小量 O/N，利用 Gene-Spin 的 Plasmid Miniprep Kit 進行小量質 體DNA 抽取，加 30μl 的 TE 回溶，置於-20℃備用。
3.10.2.5 重組質體之限制酵素分析 以Promega 的限制酵素 NotⅠ進行重組質體分析。pGEM®-T Easy Vector
上在insert 二端附近各有一個 NotⅠ的切位，利用 NotⅠ切割後會出現一條 略大於PCR 產物 300bp 的條帶與剩下的質體共二條條帶；而出現異常條帶 數與大小者即去除。作用的體積為
NotⅠ0.5μl、重組質體 2μl、10 倍 Buffer
2μl、無菌水 15.5μl 最終反應量為 20μl，置於 1.5ml 的微量離心管中，在 37℃
中反應O/N。經電泳分析後，一個擬轉殖株編號送二個樣本進行定序分析。
3.10.2.6 定序
將限制酶分析後，出現正常條帶的DNA 送至中央研究院交由定序師以 pGEM®-T Easy Vector 上的 T7 引子，利用自動定序儀進行定序分析。