植物基因轉殖之研究

傳統的植物育種是藉由育種家以人工的方式進行品種的雜交組合，利 用複雜的育種公式在田間進行大規模的雜交試驗，憑藉著多年的經驗在田 間逐一篩選，反複試驗以達到品種改良的目的。傳統的育種方式由於異種 間的雜交不親合性(sexual incompatibility)，所以大多限於品種(cultivar)或種 (species)間的基因交換，限制了育種工作的範疇。近十年來，由於遺傳工程

技術的發展，藉由基因轉殖的方法打破了不同物種間的藩籬，使特殊功能 的基因可經由人為操作而送入不同生物體中表現並可穩定的遺傳至後代(吳 和連，1991)，不僅精準地加速育種工作，也豐富物種間的多樣性。

基因轉殖(genetic transformation)是指將一個外來的基因穩定地整合插 入(stable integration)受體植物細胞核內，進而使細胞再生出全新植物的過程 (王等，2004)。植物基因轉殖的方法一般可以分為直接基因轉殖法(direct gene transformation)與間接基因轉殖法(indirect gene transformation)兩種。直 接轉殖法是將DNA片段直接導入標的細胞的細胞質或細胞核中，包括電穿 孔法(electroportion)、微注射法(microinjection)、巨量注射法(macroinjection)

、基因槍法(particle bombardment)、電射光束法(laser beam)、花粉管法(pollen

tube)、聚乙烯二醇(polyethylene glycol , PEG)等。而間接轉殖法是利用質體 (plasmid)當作攜帶外來基因的載體(vector)藉由媒介將外來基因導入標的細 胞內，包括農桿菌轉殖法(Agrobacterium-mediated transformation)、病毒載體 (virus vector)、脂球體(liposome)等方法(Walden and Wingender,1995)，而其 中最常用的就是基因槍法與農桿菌轉殖法。

2.4.1 蘭科植物之基因轉殖

蘭花是蘭科觀賞植物之總稱，也是開花植物中最大類群，約有九百多 屬(genus)，三萬五千多種(Arditti, 1992)。蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)、嘉德麗 亞蘭(Cattleya spp.)、東亞蘭(Cymbidium spp.)、石斛蘭(Dendrobium spp.)、仙 履蘭(Paphiopedilum spp.)、文心蘭(Oncidiums spp.)等都是常見的蘭花。蘭花 的育種一般是以雜交育種為主，選擇具有所需性狀的父母親本進行雜交，

再於雜交後代選擇性狀良好的植株。目前，商業所需的性狀包括花色、花 型、香味及抗病性等。利用傳統育種不僅耗費大量的勞力與空間且需時甚 久，甚至會有雜交不親合的問題。因此，應用遺傳工程將所需的特定性狀 送到蘭花基因組(genome)中是較合適的方式(鄭，2003)。

前人研究中以基因槍轉殖的蘭科植物有蝴蝶蘭(Anzai et al., 1996)、東亞 蘭(Yang et al., 1999)、石斛蘭(Kuehnle and Sugii, 1992；Men et al., 2003；Tee and Maziah, 2005；Davina et al., 2007)、文心蘭(李，2000)；而用農桿菌轉殖 的蘭科植物有蝴蝶蘭(Belarmino and Mii, 2000；陳，2003；Mishiba et al.,

2005)、文心蘭(Liau et al., 2003；唐，2006)、石斛蘭(Yu et al., 2001)。

2.4.2 基因轉殖抗生素篩選系統之建立

植物基因轉殖後為減少後續繁複且大量的培養與繼代工作，而在早期 有效率的去除未轉殖成功的植株，所以建立高效率的篩選系統是有其必要 性。篩選系統包括抗生素篩選(Antibiotic selection)、除草劑篩選(Herbicide selection)、記號基因媒介篩選(Scorable gene-mediated selection)和正向篩選 (Positive selection)，其中又以抗生素篩選最常被利用。抗生素篩選系統之建 立是在植物進行轉殖前，先利用不同濃度的抗生素進行未轉殖株的存活試 驗，找出能抑制未轉殖株生長的最低抗生素濃度作為篩選濃度。而抗抗生 素基因是在構築轉殖標的基因之初，將帶有抗抗生素的基因構築在標的基 因旁，所以在轉殖後抗抗生素基因會與標的基因一同轉入植物體中一起表 達，使轉殖成功之植株可以在含有抗生素的培養基上存活，以達到初步篩 選的效果。高徵素(hygromycin)和康黴素(kanamycin)是常用的篩選藥劑，作

用機制為在植物的粒線體與葉綠體上，破壞葉綠體的蛋白質合成，使植株 黃化而達到篩選的效果(Wilmink and Dons, 1993)。雖然康黴素在雙子葉植物

上應用的非常普遍，但是在單子葉植物篩選時所需的濃度較高且效果不 好，容易出現假性(false positive)轉殖株，造成鑑定工作的負擔。而用高徵 素篩選蝴蝶蘭時，在濃度50mg/l時就具有篩選效果(Belarmino and Mii, 2000)，所以目前大部份的蘭花轉殖都是以高徵素作為篩選藥劑。