國立宜蘭大學生物技術研究所碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis

(1)

國立宜蘭大學生物技術研究所碩士論文

Institute of Biotechnology National Ilan University

Master Thesis

Bupivacaine 誘導犬乳癌細胞凋亡機制及 osteopontin 促使犬乳癌細胞轉移機制之研究

Study on bupivacaine induce canine breast cancer apoptosis and osteopontin promote canine breast cancer migration

指導教授：賴裕順博士

鄭永祥博士 Yu-Shen Lai, Ph. D.

Yeong-Hsiang Cheng, Ph. D.

研究生：邱乙書 Yi-Shu Chiu

中華民國九十七年七月

(2)

(3)

(4)

(5)

謝誌謝誌謝誌謝誌

兩年碩士生涯中，要感謝的人非常多！因為有你們，我才能順利通過考驗。

感謝我的父母和弟弟、妹妹，因為你們全力的支持，讓我沒有後顧之憂，我才能得以實現念研究所的計畫。

感謝我的指導教授賴裕順老師，在我最徬徨無助、反反覆覆甚至要放棄就讀研究所時讓我加入 MV 實驗室，在兩年紮實的訓練後，讓我不論是課業、邏輯思考、實驗技術、英文閱讀都有所精進，老師甚至全力協助我開啟了進入博士班的大門，但最後還是讓老師失望了，真的很對不起！感謝我的指導教授鄭永祥老師，雖然相處的時間不多，但老師總能適時導正我的觀念和給予我新的想法，讓我的實驗的進行和論文的撰寫更為順利。感謝陳威戎老師，給予我無限的鼓勵和關懷，也成為驅使我完成學業的動力。

感謝與我共患難的好夥伴讌君和瑾玟，你們的關心和陪伴讓我有家的感覺，不時的建議讓我更了解自己的優缺點。感謝任勞任怨擔任司機、採買和影片供應商的小胖學長，使我們的生活更為安逸。感謝雁玲、建智和郁慧無時無刻的支援，使實驗室更有秩序。感謝安騏、國瑋和麗安小朋友，總在我難過時給予我安慰，還有一起分享秘密和快樂。感謝母體明傑同學，確保電腦的順暢。感謝楹涵和卓臻同學，經常受到我的請託和騷擾卻仍不厭其煩。

特別感謝倚昇，雖然位在不同城市，但多年走來始終如一，讓我沒有後顧之憂去追求夢想。還有好姊妹雅玲和惠讌、馬吉宇宸、親親小可、身體二十一歲的龍哥和遠在南非的宜秀，雖然分散多地，你們的關心讓我更加勇敢堅強。

最後，祝福你們平安、幸福、快樂。

(6)

摘要摘要摘要摘要

Bupivacaine 是一長效型醯胺類局部麻醉劑，高安全性且可使用於分娩婦女。主要作用於阻斷細胞膜上的鈉離子通道，抑制動作電位產生與訊息傳導，達到阻止痛覺的上傳，產生麻醉止疼的作用。在本研究中，發現 bupivacaine 為 time- 和 dose-depend 促使犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 死亡。Bupivacaine 可以誘導凋亡小體的形成、

phosphatidylserine (PS) 的外翻、染色質濃縮、DNA 被切割以及 DNA 片斷化等典型細胞凋亡特徵。Bupivacaine 誘導細胞凋亡時，主要造成 DNA 片斷化的 caspase-3, -8 and -9 酵素活性也上升。但是，使用廣效型 caspase 抑制劑 100 µM z-VAD-fmk 並不能完全抑制細胞的死亡，表示除了經由 caspase 的細胞凋亡途徑之外，還有不經由 caspase 的細胞凋亡途徑參與 bupivacaine 所誘導的細胞凋亡。

Osteopontin (OPN) 高度表現於乳癌細胞中，並且被認為與癌細胞轉移具有絕對的相關性。OPN 有長短不同的三種 isoform，分別被命名為 OPNa、OPNb 和 OPNc。其中，OPNc 僅表現於具轉移性的乳癌細胞中，並不表現於正常乳房細胞中，OPNc 可能可以做為乳癌的轉移的指標。本篇研究中，將全長的 OPNa、最短的 OPNc 或載體轉殖於不具轉移性的犬乳癌細胞株後，比較其轉移能力是否不同。根據 RT-PCR 的分析，

只有轉殖 OPN 的細胞株會分泌 OPN。從細胞增殖試驗可知 OPNa 和 OPNc 都不會改變細胞生長速率，但從傷口癒合分析中顯示 OPNa、OPNc 和都會促使癌細胞移動能力增加，又以 OPNc 最為顯著。OPNc 的表現使乳癌細胞具有較高的轉移能力，所以 OPNc 可能可以做為乳癌轉移的指標基因。

(7)

Abstract

Bupivacaine is a local anaesthetic drug belonging to the amino amide group. Bupivacaine blocks sodium channels, an action potential cannot arise and signal conduction is inhibited. In this study, bupivacaine induced apoptosis of canine breast cancer cell (DTK-SME-like) in a time- and dose-dependent manner. Bupivacaine induced formation of apoptotic bodies, phosphatidylserine (PS) translocation, chromatin condensation, DNA cleavged and DNA fragmentation similar to typical apoptosis inducers. Caspase-3, -8 and -9 were all activated by bupivacaine correlation with the degree of DNA fragmentation. However, general caspase inhibitor (z-VAD-fmk) was found not to inhibit cell death completely. The present studies suggest that and caspase-independent pathway is involved in apoptosis indced by bupivacaine.

Osteopontin (OPN) is expressed at high levels by breast cancers and contributes importantly to the metastatic potential. OPN is subject to alternative splicing, which yields 3 messages, OPNa, OPNb and OPNc. In this study, the non-metastatic canine cell line (DEE), which do not express endogenous OPN were stably transfcted to overexpression fulllength form of osteopontin (OPNa) or shortest splice variant (OPNc) or a control vector and compared for functional differences in metastatic behavior. According to RT-PCR analysis, abundant amounts of OPN were secreted of the transfected cells but not the vector controls. In proliferation, neither OPNa nor OPNc alters cell progression. In wound healing assay, OPNc facilitated migration and show distinct protrusions, which are absent from OPNa-transfected cells or vector controlsand. The above results suggest that overexpression of OPNc has induced metastatic behavior. We evaluated OPNc as a selective maker.

(8)

目錄 (table of contents)

謝誌 ... I

摘要 ... II

Abstract... III 目錄 (table of contents) ... IV

圖表目錄 (list of tables and figures) ... VII

第一章、文獻回顧 ... 1

一、乳癌概況 ... 1

二、乳癌的分類 ... 1

三、癌症的轉移 (metastasis) ... 2

四、乳癌的治療 ... 4

五、細胞凋亡 ... 6

六、Bupivacaine ... 12

七、Osteopontin ... 14

第二章、研究目的 ... 23

第三章、材料 ... 25

一、細胞株 ... 25

二、菌株 ... 25

三、載體 ... 25

(9)

四、藥劑 ... 25

五、儀器 ... 28

第四章、方法 ... 30

一、細胞培養 ... 30

二、Bupivacaine 的配製 ... 30

三、細胞毒性試驗 ... 30

四、細胞凋亡試驗 ... 32

五、凋亡路徑分析 ... 34

六、Osteopontin 表現載體的構築 ... 35

七、基因選殖 ... 38

八、癌細胞轉移能力分析 ... 40

九、DNA 濃度的測定 ... 41

第五章、結果 ... 42

一、Bupivacaine 對犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞存活率的影響 ... 42

二、Bupivacaine 對犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞型態的影響 ... 42

三、Bupivacaine 誘導犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞凋亡 ... 42

四、Bupivacaine 誘導犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞凋亡後 caspase 的活化 ... 44

五、轉殖的犬乳癌細胞株 (DEE) 中 OPNa 和 OPNc 之表現分析 ... 44

六、癌細胞轉移能力分析 ... 45

(10)

第六章、討論 ... 46

一、Bupivacaine 可以誘導犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞凋亡 ... 46

二、Bupivacaine 誘導的細胞凋亡是經由 caspase 的活化 ... 47

三、Bupivacaine 誘導的細胞凋亡可能有不經由 caspase 活化的途徑的參與 ... 47

四、核酸水解酶的參與 bupivacaine 誘導犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 的細胞凋亡 ... 48

五、Bupivacaine 可以誘導人乳癌細胞株 (HCC 1937) 的細胞凋亡 ... 49

六、OPN 可以增加犬乳癌細胞株 (DEE) 移動能力 ... 49

七、OPN 的表現可能促使上皮細胞間質轉化現象的發生 ... 50

八、OPN 可能藉由其他機制促使癌細胞轉移 ... 50

九、OPNa 和 OPNc 在癌細胞轉移中功能的差異 ... 51

第七章、圖表 ... 52

參考文獻 ... 65

(11)

圖表目錄 (list of tables and figures)

圖一、死亡受體之細胞凋亡訊息傳導途徑 ... 9

圖二、粒線體之細胞凋亡訊息傳導途徑 ... 10

圖三、內質網途徑之細胞凋亡訊息傳導途徑 ... 11

圖四、OPN 的蛋白質二級結構 ... 16

圖五、OPN 的結構 ... 16

圖六、OPNa、OPNb 和 OPNc 的結構 ... 17

圖七、OPN 和細胞表面 integrin αvβ3、CD44 結合並調控下游基因的表現 ... 20

圖八、OPN 調控 uPA、MMPs 促使細胞轉移... 21

圖九、MTT 經粒線體代謝為 formazan，可被 570 nm 偵測 ... 31

圖十、MTT 測試不同濃度 bupivacaine (0~8 mM) 對犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 之細胞存活率分析 ... 52

圖十一、MTT 測試 2 mM bupivacaine 對犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 之細胞存活率分析 ... 53

圖十二、倒立式光學顯微鏡觀察 2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之細胞型態 ... 54

圖十三、螢光顯微鏡觀察 2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之 Annexin V 染色 ... 55

圖十四、螢光顯微鏡觀察 2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之 hoechst 33258 染色 ... 56

(12)

圖十五、螢光顯微鏡觀察 2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之

去氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記分析 ... 57

圖十六、電泳膠片分析 2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之 DNA 片斷化 ... 58

圖十七、2 mM bupivacaine 培養犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 後之 caspase-3、-8、-9 活性分析 ... 59

圖十八、MTT 檢測以廣效型 caspase 專一性抑制劑 100 µM z-VAD-fmk 預培養後，2 mM bupivacaine 對犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 之細胞存活率分析 ... 60

圖十九、OPN 的表現分析 ... 61

圖二十、OPNa、OPNc 的表現對細胞生長速率影響之分析 ... 62

圖二十一、倒立顯微鏡觀察 OPN-overexpressed 細胞株傷口癒合 ... 63

圖二十二、傷口癒合試驗分析之癒合面積比例 ... 64

(13)

第一章第一章第一章

第一章、、、、文獻回顧文獻回顧文獻回顧文獻回顧

一、乳癌概況

根據衛生署 2007 年的統計，我國共有 1552 例乳癌死亡病例，為排名第四的女性癌症，是常見的婦女癌症。世界衛生組織估計 2000 年約有 470,000 名新病例，2002 年有 239,000 名婦女因乳癌死亡，是全球女性常見癌症第四名。

二、乳癌的分類

乳癌大致分為乳腺管道上皮 (mammary ductal epithelium) 或乳腺小葉 (mammary lobular) 的惡性腫瘤，乳腺管道的上皮癌佔所有乳癌病例的百分之九十以上 (Kelsey, 1993)。

原發性乳癌的病理分類或臨床分期對其治療方式及預後追蹤相當重要。乳癌的病理分類可分為非侵襲性 (non-invasive)、侵襲性 (invasive)、上皮癌及來自乳頭的 Paget 疾病 (World health organization, 1981)。乳癌的臨床分期可分為零期至四期，零期癌為早期或非侵犯性癌，癌腫瘤只局限於原位，尚未侵犯到周圍組織，亦可稱為原位癌或非侵犯性癌。一期癌為癌腫瘤直徑少於二公分，且腋下淋巴結內尚未發現有癌細胞，癌腫瘤只局限在乳房組織內。二期為癌腫瘤直徑少於二公分，但腋下淋巴結已發現有癌細胞；或者癌腫瘤直徑在二公分至五公分之間，腋下淋巴結已有或尚未發現癌細胞；或者癌腫瘤直徑大於五公分，腋下淋巴結尚未有癌細胞。三期為癌腫瘤小於五公分，癌細胞已轉移至腋下淋巴腺；或者癌腫瘤大於五公分；或者癌細胞上轉移到胸壁、肋骨以及胸肌；或者發炎性乳癌，此為較罕見的乳癌，乳房表面皮膚已出現紅腫。四期時，癌細胞已擴散至身體各部位，如骨、肺、肝或腦等。

近年來由於醫學進步，經由適當的治療，乳癌的十年存活率平均達 60%。第一期乳癌的存活率則高達 80%，零期乳癌甚至接近 100%，但第二期乳癌以後已有轉移的病

(14)

人存活率則小於 50% (TCOG 乳癌研究委員會, 2004)，可知癌細胞的轉移和病人的預後有絕對的關係 (Hayashi, 2007)。

三、癌症的轉移 (metastasis)

(一)、癌症的形成 (carcinogenesis)

Hanahan 等作者於 2000 年以 six hallmarkers 對癌症形成的過程做了詳細註解。癌症形成的過程是一不正常的組織生長過程，細胞先是獲得自我供應生長訊號的能力 (self-sufficiency in growth signals) ，進而細胞複製與增生失去調控 (insensitivity to antigrowth signals and limitless replicative protencial) ，同時抵抗細胞凋亡 (evading apoptosis)，最後進行血管新生 (sustained angiogenesis)，並向外侵犯而轉移至其他組織或器官 (tissue invasion and metastasis) (Hanahan, 2000)。上皮細胞間質轉化 (epithelial- mesenchymal transition, EMT) 的現象在近幾年被提出參與癌症的發展。

(二)、癌細胞轉移和上皮細胞間質轉化現象的關係

生物體大部分由上皮細胞 (epithelial cell) 和間質細胞 (mesenchymal cell) 所組成，這兩種細胞分別表現兩類不同的細胞特性。上皮細胞具有極性 (polarity)，藉由細胞黏附分子 (cell adhesion molecules) 的分布而決定其定位，也是靠著這些細胞黏附分子，

上皮細胞才得以相互連結並且附著於細胞底部的基質，進而形成各種上皮組織。間質細胞則是具有移動能力的細胞，並且能夠在細胞基質間自由移動，而多半不需要細胞黏附分子的存在。這兩種細胞在生物體內並不是永遠都固定原本的細胞特性，在許多情況之下，這兩種細胞會相互轉換，以進行特定的生物活動，這種細胞轉換的現象被稱為上皮細胞間質轉化。

上皮細胞間質轉化現象最早是從雞胚胎發育中觀察到的。Duval 學者在 1897 發現上皮細胞和間質細胞參與雞胚胎神經管發育；Lillie 學者在 1908 在雞胚胎發育時，上

(15)

皮細胞和間質細胞之間出現轉換的現象 (Lillie, 1908)；Greenburg 等學者經由細胞實驗證實上皮細胞確實會暫時喪失細胞極性，並且表現移動能力的間質細胞特性 (Greenburg, 1982)。這種細胞相互轉換特性的狀況會不斷的發生，也構成了胚胎發育成形最重要的步驟。

在胚胎發育的過程中，細胞黏附分子的調控非常重要，如 cadherin。Cadherin 是位於細胞膜上的穿膜蛋白，透過細胞之間以類似免疫球蛋白構造的部分連結鄰近細胞，並且與細胞內的細胞骨架相接。根據在不同細胞的分布而有不同的命名，在上皮細胞的就稱為 E-cadherin，而不同的 cadherin 在細胞之間的鍵結力也有所不同。E-cadherin 的表現最主要功能為上皮細胞間的黏附，以維持組織的穩定；如果 E-cadherin 的表現被抑制，上皮細胞間的黏附被破壞，進而使上皮細胞轉變為類似具有移動能力的間質細胞，

也就是上皮細胞間質轉化。因此，上皮細胞在進行上皮細胞間質轉化的過程中，

E-cadherin 的喪失以及不同 cadherin 分子間的轉換，是一個相當重要的特徵。

上皮細胞間質轉化中 E-cadherin 的喪失與腫瘤的分化以及病人的存活有顯著的相關性 (Batlle, 2000)。在癌細胞晚期惡化及產生轉移能力之過程中，癌細胞可以經由一些機制造成 E-cadherin 表現的喪失，例如透過可造成上皮細胞間質轉化之重要轉錄因子如 snail、slug、SMN-interacting protein 1 (SIP1)、twist 的表現，而抑制 E-cadherin 的表現而導致上皮細胞間質轉化 (Cano, 2000; Bolós, 2003; Domínguez, 2003; Kang, 2004)。腫瘤細胞產生上皮細胞間質轉化時， E-cadherin 的喪失同時也伴隨著其他 cadherin的生成，而這些新生成的 cadherin 分子，多半都是屬於細胞鍵結力較弱的成員，例如 N-cadherin 等。當細胞表現出鍵結力較弱的 cadherin 時，就等同釋放出一個促進細胞移動的訊號，讓這些癌細胞發生侵犯轉移的機會與能力大增。

除了 E-cadherin 表現的喪失，上皮細胞間質轉化時在腫瘤細胞中也可以偵測到間質細胞骨架蛋白表現，如 vimentin (Thiery, 2002; Thiery, 2006)。此外，癌細胞進行上皮細胞間質轉化時也會藉由分泌重要之轉錄因子如 Snail，促使基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 分解細胞外基質 (extracellular matrix)，促使細胞侵入性增加

(16)

(Yokoyama, 2003)。

四、乳癌的治療

目前早期乳癌大多採取手術切除治療 (Intra, 2002)，並配和放射療法 (radiotherapy) (Coates, 1998; Coates, 2002; Bartelink, 2003) 以確定癌細胞被全部破壞。再依據手術病理報告，對個別病人的腫瘤細胞上的荷爾蒙受體、Her2/neu 抗原表現狀況、腫瘤大小、腫瘤細胞分化、腋下淋巴結轉移數目等，來決定手術後的化學治療、荷爾蒙治療或單株抗體療法 (McCready, 2003)。

(一)、化學療法 (chemotherapy)

化學治療藥物主要為藉由細胞凋亡 (apoptosis) 來達到抑制腫瘤細胞生長的效果 (Calderon, 2002; Venugopal, 1996)。乳癌病患所使用的抗癌藥物包括 DNA alkylators、

intercalators、antimetabolites、antitumor antibiotics 以及 tubulin inhibitors (Greenspan, 1996)。

在 1960 年後期，化學療法最常合併使用 cyclophosphamide 、 methotrexate 、 5-fluorouracil (5-FU) 、 prednisone 及 vincristine 。 1970 年代，臨床上主要使用 anthracyclines，如 doxorubicin、epirubicin。Anthracyclines 會和 DNA 結合，抑制 RNA 和蛋白質的合成。Anthracyclines 也會產生自由基 (free radical)，阻斷 topoisomerase Ⅱ，

使 DNA 不能複製。Anthracyclines 常會和 cyclophosphamide 以及 5-fluorouracil 合併使用。在 1990 年代，taxanes 最常被使用，如 paclitaxel、docetaxel。Taxanes 會和微管蛋白 (tubulin) 結合，引起微管聚合作用 (tubulin polymerization) (Schiff, 1979)。由於微管 (microtubule) 必須在聚合作用和去聚合 (depolymerization) 之間取得平衡，而 taxanes 會破壞此平衡，使乳癌細胞停留在細胞週期 G2/M 期。

(二)、荷爾蒙療法 (hormonal therapies)

(17)

荷爾蒙療法可以減緩或阻止乳癌細胞的生長。在 1896 年 Beatson 使用卵巢切除術 (ovariectomy) 來防止腫瘤復發，並且可以治療原發性的腫瘤 (Beatson, 1896)，所以性荷爾蒙是乳癌的主要決定因素，而性荷爾蒙的影響是受其受體 (receptor) 所調控。在所有性荷爾蒙中，雌激素 (estrogen) 與乳癌的發生最具相關性，抑制雌激素和雌激素受體 (estrogen receptor, ER) 的作用已經成為治療乳癌的主要對策，而更進一步地發展出 antiestrogens。

1、Antiestrogens

Antiestroges 藉由阻斷雌激素對乳癌細胞的作用以抑制乳癌細胞的生長，Tamoxifen 是最普遍的一種荷爾蒙療法藥物。當癌細胞表面具有雌激素受體，稱之為 estrogen receptor positive (ER positive)。Tamoxifen 可以有效的阻止雌激素和其受體的結合，抑制癌細胞的生長。因此，使用 Tamoxifen 之前必須先確定乳癌細胞是屬於 ER positive，

才能發揮良好的藥效 (Fisher, 1998; Cuzick , 2003)。

2、Aromatase inhibitors

Aromatase inhibitors 抑制脂肪組織中雌激素的產生 (Winer, 2002)，使用於更年期後女性。常用的 aromatase inhibitors 有 anastrozole (Arimidex)，letrozole (Femara) 以及 exemestane (Aromasin)。

3、黃體激素 (progestogens)

黃體激素是女性天然的荷爾蒙，progestogen 則是人工合成的黃體激素衍生物。許多腫瘤須依賴特定的性荷爾蒙生長，癌細胞表面具有這些性荷爾蒙的受體，progestogen 可以阻斷性荷爾蒙和其受體的結合，抑制癌細胞的活化及生長。此類藥物有 megestrol acetate (Megace) 以及 medroxyprogesterone acetate (Provera) (Quella , 1998)。

4、Pituitary down-regulators

黃體激素釋放激素 (luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH) 相似物，或促性

(18)

腺激素釋放素 (gonadotropin releasing hormone, GnRH) 相似物會降低腦中促雌激素 (estrogen-stimulating hormone) 的產生，使體內雌激素的含量降低，抑制癌細胞的活化及生長。此類藥物有 goserilin (Zoladex)，但 goserilin 只有對 ER positive 的乳癌細胞有效，並且會引起和更年期相似的副作用，包括熱潮紅，發汗，性慾降低，頭痛和心情改變 (Jonat, 2002)。

(三)、單株抗體療法 (monoclonal antibody therapy)

HER-2 (human epidermal growth factor receptor-2) 即是 HER2/neu proto-oncogene，

為上皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor family, EGF) 之一，所以 HER-2 在細胞增生、轉移以及分化的調控扮演重要角色 (Yarden, 2001)。有二到三成的乳癌患者的癌細胞會過度表現 HER-2，稱之 HER-2 positive。研究顯示 HER-2 過度表現的乳癌病患其平均存活年數較 HER-2 表現正常的病患短 (Slamon, 1987)。HER-2 過度表現 是因 HER2/neu 基因的表現被放大，使得 HER-2 過度表現的病患預後極差 (Pauletti, 1996)。

單株抗體對 HER-2 胞外區域 (HER-2 extracellular domain) 具有高度的親合性，因此被用做抗 HER-2 的治療 (Shepard, 1991)。Trastuzumab (Herceptin^®) 可阻斷上皮生長因子和其受體 HER-2 結合，而抑制癌細胞的生長。Trastuzumab 可用於已經轉移的癌細胞，但只對具有 HER-2 (HER2-positive) 的癌細胞才有效 (Kunitomo, 2004; Toi, 2004)。

除了荷爾蒙療法以外，化學療法和單株抗體療法之主要目的皆是誘導癌細胞凋亡 (apoptosis)，所以，細胞凋亡機制的探討，也是癌症治療中被討論的重要一環。

五、細胞凋亡

1971 年 Kerr 首先發現一種與細胞壞死相異的細胞死亡方式，命名為細胞凋亡

(19)

(Kerr, 1972)。細胞凋亡在生命現象中廣泛存在，不僅在病理狀態下發生 (Searle, 1982)，

更常在生理及藥理狀態下被觀察到 (Kerr, 1972)，如胚胎發育、荷爾蒙作用 (Wyllie, 1973)、免疫反應 (Stacey, 1985)、藥物作用、細胞內 pH 值改變、DNA 傷害、抗癌藥物 (Eastman, 1992) 或放射線等作用下，皆可觀察到細胞凋亡的現象。凋亡被認為是一種細胞主動的、基因調控下進行的程序性死亡 (programmed cell death)。

細胞凋亡與細胞增殖是相反且互相調節的生理現象，若兩者間失去平衡，就可能引發如癌症、後天免疫缺乏症候群 (acquired immunode-ficiency syndrome, AIDS) 或阿茲海默症 (Alzheimer's disease) (Cotman, 1994; Behl, 2000) 等疾病，因此，細胞凋亡是一種維持正常人體生理機能重要的保護措施 (Kerr, 1994)。

(一)、細胞凋亡的形態學變化

細胞凋亡形態學上變化可分為早、晚期。早期時，細胞核周圍會出現染色質濃縮 (chromatin condensation)，細胞膜內縮而細胞型狀變圓。接著 DNA 會以核小體 (histone) 為單位，產生 180-200 base pair 的整數倍斷裂 (DNA fragmentation)。當細胞的結構蛋白被分解後，細胞開始皺縮 (shrinkage)，細胞膜形成小泡 (membrane bleb)。到了晚期，

細胞核會開始裂解，形成數個凋亡小體 (apoptotic bodies)。

在細胞凋亡過程中，並不會發生胞器或是胞膜破裂，但是可能發生粒線體膜電位下降及通透性增加 (Kroemer, 2000)。當細胞產生凋亡時，粒線體膜電位下降而失去製造 ATP 的能力時，此時細胞膜無法維持其內外層的對稱性，而大量分佈於細胞膜內層的 phosphatidylserine (PS) 會翻轉到細胞膜外層。最後，在體內的凋亡細胞可被吞噬細胞所吞噬，在體外則進行二次細胞壞死 (secondary necrosis) (Uller, 2004)。

(二)、細胞凋亡的途徑

目前已知有兩種主要訊息傳導途徑可以調控細胞凋亡現象，一種途徑是經由 caspase 活化而引起細胞凋亡途徑 (caspase-dependent apoptotic pathway) (Nguyen, 2003) ，另一種途徑則是不經由 caspase 活化而引起細胞凋亡 (caspase-independent

(20)

apoptotic pathway)。

1、經由 caspase 活化而引起細胞凋亡途徑

經由 caspase 活化而引起細胞凋亡途徑可分為三種，一種是藉由細胞表面之死亡受體 (death receptor) 而引發之細胞凋亡，亦稱為外部途徑 (extrinsic pathway) (Igney, 2002) ；一種是藉由粒線體產生之細胞凋亡，亦稱為內部途徑 (instrinsic pathway) (Krammer, 1999; Schmitz, 2000)；第三種為 Nakagawa 等生理學家於 2000 年提出的內質網途徑 (endoplasmic reticulum pathway) (Nakagawa, 2000) 。這三種途徑皆造成 cysteine aspartyl-specific proteases (caspases) 的活化。

(1)、外部途徑

細胞外的死亡受體 (death receptor) 是腫瘤壞死因子受體 (tumour-necrosis factor receptor, TNFR) 超級家族的成員，如 TNFR1、CD95 (Apo-1/Fas)、DR3/WSL、TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2L 等受體具有死亡區域 (death domain) (Krammer, 1999; Schmitz, 2000)，可連接胞內連結蛋白 (intracellular adaptor protein) 如 FADD)。死亡受體如 CD95 會被專一性配體 (ligands) 如 CD95L 結合並活化。當配體與其專一性死亡受體結合形成誘發死亡訊息傳導複合體 (death-inducing signaling complex, DISC)，即會促使 initiator capases 如 caspase-8、caspase-10 的活化，最後啟動 caspase-3 活化而引發細胞凋亡。Caspase-8、caspase-10 可活化 Bid，藉由被活化的 Bid 進一步促使內部途徑的 caspase-9 活化 (Igney, 2002)。

(21)

圖一、死亡受體之細胞凋亡訊息傳導途徑 (Igney, 2002)。

(2)、內部途徑

在粒腺體啟動細胞凋亡主要是藉由 Bcl-2 家族調節。Bcl-2 家族可分為抗細胞凋亡蛋白 (antiapoptotic proteins) 如 Bcl-2 、 Bcl-XL 、 Bcl-W 等和促進細胞凋亡蛋白 (proapoptotic proteins) 如 Bax、Bak、Bcl-Xs、Bid、Bad 等 (Huang, 2000)。促進細胞凋亡蛋白會造成粒線體膜間隙 (mitochondrial intermembrane space) 的細胞色素 c (cytochrome c) 釋放至細胞質中，並且與細胞凋亡蛋白酶活化因子 (apoptotic protease activating factor 1, Apaf-1) 結合形成 apoptosome，進而活化 caspase-9 ，最後啟動 caspase-3 活化而引發細胞凋亡。

(22)

圖二、粒線體之細胞凋亡訊息傳導途徑 (Igney, 2002)。

(3)、內質網途徑

Nakagawa 等生理學家於 2000 年提出了第三條經由 caspase 活化而引起的細胞凋亡途徑，發現 caspase-12 專一性地存在於內質網中，並且和 grp78、presenilin-2 及 β-amyloid precursor protein (APP) 一同存在於內質網。當內質網受到外在壓力刺激後，

可觀察到 Ca²⁺ 從內質網釋出、caspase-12 活化和細胞發生細胞凋亡的現象 (Nakagawa, 2000)。另外有文獻指出，內質網誘發的細胞凋亡也可受到 Bcl-2 家族的調控，因為在內質網上亦可發現 Bcl-2 蛋白的存在 (Ferrari, 2002)。

(23)

圖三、內質網途徑之細胞凋亡訊息傳導途徑 (Breckenridge, 2003)。

2、不經由 caspase 活化而引起細胞凋亡途徑

內部途徑亦可能藉由不經由 caspase 活化而引起細胞凋亡途徑誘導細胞凋亡，如透過 endonuclease G (Endo G) 或誘導細胞凋亡因子 (apoptosis-inducing factor, AIF) 的活 化來啟動細胞凋亡。以 Endo G 為例，Endo G 在線蟲 (C. elegans) 身上發生的細胞凋 亡中，扮演了一個重要的角色 (Parrish, 2003)。當細胞在受到某些細胞凋亡刺激之後，

會經由 Bcl-2 家族成員 (包含了 pro-apoptotic 及 anti-apoptotic) 調控粒線體，由膜間質釋放 cytochrome-c、AIF 和 Endo G 等蛋白質至細胞質中，以進行細胞凋亡。而 Endo G 會進一步轉移至細胞核內，並對核內的核糖核酸作用，產生寡核體 DNA 片段，在此誘導 Endo G 的粒線體路徑中，並不需要 caspases 的參與 (Donovan, 2004)。

(三)、細胞凋亡的執行者 (caspase enzyme family)

目前 caspase 家族發現至少 14 種 caspase 的存在。根據他們的同源性，可大致分為三類。第一類為 ICE subfamily of cytokine processors，此類 caspases 包含 caspase-1、

(24)

-4、-5、-11、-12、-13、-14，此類 caspase 的功能與發炎反應有較大的關係。第二類為 ICH-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators ，此類 caspases 被稱為 apoptotic initiators ，包含 caspase-2 、 -8 、 -9 、 -10 。此類 caspase 的功能為活化 apoptotic executioners，使 apoptotic executioners 執行細胞凋亡的作用。第三類為 Ced-3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners，此類 caspases 被稱為 apoptotic executioners，包含 caspase-3、-6、-7。此類 caspase 的功能為執行細胞凋亡 (Shi, 2002; Zornig, 2001)。

Initiator capases 被活化後會切割修飾和活化 executioner caspases ，活化的 executioner caspases 可切割死亡受質，造成特徵生化和型態上的改變 (Rathmell, 1999)。

當 PARP 被切割後會由 116 kDa 被水解成 85 kDa 及 31 KDa ， PARP (poly-ADP-ribose polymerase) 即失去修復受損的 DNA、調控細胞增殖與死亡的平衡、

和維持基因體的穩定性的作用 (Armstrong, 1996; Hung, 1998; Wang, 1999; Kohler, 2002;

Yoon, 2002)。當 nuclear LAMINS 被切割後會造成染色質濃縮及細胞核裂解。當 ICAD (inhibitory subunit of the caspase-actived DNase) 被切割後，會引起核酸內切酶釋放至細胞核去執行切割片段 DNA。細胞骨架被切割後會造成細胞斷裂及形成凋亡小體。(Savil, 2000)

六、Bupivacaine

(一)、簡介

Bupivacaine 為一長效型局部麻醉劑 (Foster, 2000)。使用藥物來產生麻醉止痛作用的發展主要開始於十九世紀中期，古柯鹼 (cocaine) 最早在西元 1884 年，被 Koller 與 Gaertner 兩位學者發現其具有止痛作用。依據與古柯鹼結構的相似性，還陸續發現 atropine 以及 homotropine 等用於眼科的局部麻醉劑。西元 1957 年，科學家無意中製造出兩個新的局部麻醉劑，mepivacaine 以及 bupivacaine。其中 bupivacaine 麻醉效果持久且給藥途徑選擇性多，包括利用浸潤 (infiltration)、周邊神經阻斷 (peripheral nerve

(25)

block)、硬膜或是脊髓給藥 (epidural or spinal anesthesia) 等方式來產生麻醉，而被廣泛地使用至今 (Rachel, 2000; Yvan, 2001)。

(二)、結構

局部麻醉劑的結構可大分為 aromatic head、carbon chain linkage 與 amino tail 等三大部分。依據中間連接的碳鏈結構分為酯類 (esters) 與醯胺類 (amides)，酯類局部麻醉劑，如 procaine 或是 cocaine，主要在血液中被血漿 pseudocholinesterase 水解代謝，

因此麻醉止痛的作用很短，而醯胺類局部麻醉劑會有少量被血液中 esterase 水解，但其主要代謝部位是在肝臟，因此在體內半衰期較長，止痛效果亦較長，如 bupivacaine 便是屬於此類。

(三)、藥物基本性質

Bupivacaine 之化學式為 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)-2-piperidine-carboxamide (C₁₈H₂₈N₂O) ，亦可命名為 1-butyl-2’,6’-pipecoloxylidide (Chang, 2001) ，分子量為 288.43；製備成鹽酸鹽形式，C18H28N2O‧HCl，分子量為 324.89。屬於醯胺類局部麻醉劑 (amino-amide type local anaesthetic)。

(四)、藥理作用

局部麻醉劑作用的產生主要在於阻斷細胞膜上的離子通道，特別是與動作電位形成相關之鈉離子通道 (sodium channel)，阻斷了鈉離子內流 (sodium influx )，便可達到抑制動作電位產生與訊息傳導的作用 (Brody, 1998; Courtney, 1978)。而 bupivacaine 可以抑制甚至完全阻斷突觸傳訊的作用，還可以對神經節直接產生作用，包括降低突觸後細胞膜的電阻性 (membrane resistance)、提高動作電位發生的閾值 (firing threshold)、減低動作電位的 amplitude 進而抑制動作電位的發生 (Tabatabai, 1990)，達到阻止痛覺的上傳，產生麻醉止疼的作用。

(五)、臨床上的應用

(26)

臨床上 bupivacaine 多用在手術麻醉，且可以不同途徑投予，如眼部手術時的麻醉、分娩過程中硬膜外或尾部麻醉、浸潤麻醉和緩解手術後的疼痛等，可單獨投予或併用一般的麻醉劑或血管收縮劑，亦可用於分娩婦女 (Foster, 2000)

(六)、副作用

局部麻醉劑產生全身性毒性的狀況是較少見的，通常會發生是因為劑量過高 (overdosage) 或是意外注射入血管的情況下。中樞神經系統 (centralnervous system) 與心血管系統 (cardiovascular system) 是最主要產生毒性的部位，而中樞神經系統對於局部麻醉是較為敏感的，因此其毒性作用也會較早出現 (Edde, 1977; Sage, 1985)。

(七)、Bupivacaine 誘導細胞凋亡

目前關於 bupivacaine 誘導細胞凋亡的研究仍不多，機制也尚未完全清楚。分別在 2002、2003 年有學者發現局部麻醉藥 (local anesthetics) 包含 bupivacaine 會誘導人類血癌細胞株 U937 和人類腎臟 HK-2 細胞株進行細胞凋亡 (Arai, 2002; Lee, 2004)。

Unami 等學者於 2003 年發現 bupivacaine 可能是藉由外部途徑誘導人類白血病 HL-60 細胞株進行細胞凋亡，並且有 time- dependent 和 dose-dependent 的現象。接著作者利用基因晶片檢測，發現 heat shock protein 70 (HSP70)、c-jun 和 c-fos 等基因有被向上調控 (up-regulated)，而 c-myc 和 poly-ADP-ribose polymerase (PARP) 基因則是被向下調控 (down-regulated) (Unami, 2003)。

七、Osteopontin

(一)、Osteopontin 的簡介

Senger 等人於 1979 年首次發現一種轉型特異性分泌蛋白與腫瘤的關係，稱之為轉型相關性磷酸蛋白 (transformation-specific secreted phosophoproteins) (Senger, 1979;

Senger, 1980)。後來 Pichler 等從骨組織中分離出一種非膠原的骨基質蛋白 (Pichler,

(27)

1995)，其特性與 Senger 等發現的磷蛋白相似，正式命名為 osteopontin (OPN) (Oldberg, 1986; Mark, 1987)。

OPN 不僅是細胞外基質，也是淋巴細胞因子和巨噬細胞趨化和黏附分子，調節骨的形成，促進巨噬細胞黏附和聚集，促進平滑細胞遷移和腫瘤細胞轉移等多種生理功能 (Pichler, 1995; Dede, 1997; Lan, 1998)。OPN 是一種與腫瘤細胞的轉化、浸潤和轉移有關的蛋白質，甚至有人認為 OPN 是一種腫瘤標誌物。同時，OPN 和動脈粥狀硬化 (atherosclerosis)、感染等多種病理現象相關，亦被認為是一種新的細胞訊號分子。

(二)、OPN 的組成

人類 OPN 的基因位於染色體 4q13 上。OPN 經由 RNA 的 splicing 和轉譯後磷酸化、糖基化及蛋白水解程度的不同而以多種形式存在 (Pichler, 1995; Lan, 1998)，分子量大約是 41 kDa 至 75 kDa (Smith, 1987; Patarca, 1989; Denhardt, 1993; Hijiya, 1994, Behrend, 1993; Yamamoto, 1995, El-Tanani, 2006)。

目前為止，小鼠、大鼠、豬、牛、雞和人 OPN 的基因已被發現 (Denhardt, 1993)，

經由比較分析後，發現這些物種 OPN 基因的核苷酸有中度的序列保守性，其中胺基端、羧基端和編碼含 RGD 三胜肽序列的 50 個胺基酸區有高度的序列保守性。

OPN 基因含有 6 個 exon 和 5 個 intron，啟動子含有一個 TATA 盒 (-28-22)、

一個反向的 CCAAT 盒 (-55-50) 和一個 GC box (-100-93)。人類 OPN 基因編碼為 314 個胺基酸，人類和大鼠的 OPN 胺基酸序列有 65 % 的同源性。OPN 經由 RNA 的 splicing 和轉譯後磷酸化、糖基化及蛋白水解程度的不同而以多種形式存在 (Pichler, 1995; Lan, 1998)。OPN 的二級結構有 8 個 α helix 和 6 個 β sheet。

(28)

圖四、OPN 的蛋白質二級結構。

OPN 蛋白中含有一 RGD 序列，這一序列在不同物種的 OPN 中都普遍存在，RGD 序列對於 OPN 的黏附功能有重要作用 (Senger, 1979; Senger, 1980; Oldberg, 1986;

Mark, 1987)。OPN 藉由 RGD 序列與細胞表面的整合素 (integrin) 或細胞表面受體 CD44 結合 (Weber, 1996)，而 CD44 已被證實不但參與細胞的黏附、移動，甚至可以和基質金屬蛋白酶結合並相互作用而協助細胞的侵入。

圖五、OPN 的結構 (Philip, 2004)。

(29)

癌細胞中會表現三種 isoform 的 OPN，分別命名為 OPNa、OPNb、OPNc。OPNa 具有全長的基因，長度為 942 個核苷酸；OPNb 缺少 exon 5，長度為 900 個核苷酸；

OPNc 缺少 exon 4，長度為 861 個核苷酸 (Young, 1990)。

圖六、OPNa、OPNb 和 OPNc 的結構 (He, 2006)。

(三)、OPN 的分布和調控

OPN 最初發現於成骨細胞 (osteoblast) 和蝕骨細胞 (osteoclast) (Pichler, 1995)，之後發現巨噬細胞、T 淋巴細胞、腎小管上皮細胞、平滑肌細胞、各種上皮細胞和一些腫瘤細胞均能產生 OPN (Pichler, 1995; Lan, 1998; Malyankar, 1997; Nagasaki, 1997)。此外，人的正常組織如肝、膽、胰、胃腸道、子宮、尿道、乳腺、唾液腺、汗腺及肺支氣管均有 OPN 的表達 (Denhardt, 1993)。

OPN 的表現受激素、生長因子、細胞因子及癌基因等多種因素的調控。1, 25-二羥維生素 D3 (1, 25-dihydroxyvitamin D) 正向調控 OPN 的表現，血管張力素 Ⅱ (angiontensin II, AngⅡ)、上皮生長因子、轉型生長因子 β (transforming growth factor β,

(30)

TGFβ)、血小板衍生生長因子 (platelet-derived growth factor, PDGF)、腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor α, TNFα)、白介素 1α (interleukin 1α, IL-Iα) 促進 OPN 的表現，其它如刀豆球蛋白 A (concanavalin A, ConA)、組織血纖維蛋白溶原活化劑 (tissue plasminogen activator, t-PA)、激活的 ras 基因也會促進 OPN 的表現；甲狀腺素則會負向調節 OPN 的表現 (Denhardt, 1993; Nagasaki, 1997)。

(四)、OPN 在多種癌症中的表現

大量的研究說明 OPN 與多種腫瘤細胞的發生、發展、轉移有關，甚至認為 OPN 可以作為一種判斷預後及監測腫瘤復發或轉移的指標，且具有較高的臨床意義 (Sodek, 2000)。Furger 等認為 OPN 在人類多種腫瘤中都呈現高表達，並且在有些腫瘤的病人血液中亦出現高水準表達。最近的臨床研究也提示 OPN 不僅與多種類型的腫瘤相關，

而且 OPN 在病人血液和腫瘤組織中的高表達有助於做為腫瘤的預後參考 (Furger, 2001)。

Coppola 等採用免疫組織化學技術檢測 350 例病人腫瘤組織和 113 例不同部位的正常組織，結果發現 100% 胃癌細胞 OPN 表達陽性，85% 結腸癌、82% 腎盂移行細胞癌、81% 胰腺癌、72% 腎細胞癌、71% 肺癌和子宮內膜癌、70% 食管癌、58% 頭頸部鱗狀細胞癌和 59% 卵巢癌等 OPN 表現為陽性，說明 OPN 廣泛表達在人體不同腫瘤組織中，OPN 參與腫瘤的形成。同時，OPN 在多種腫瘤類型以及在不同階段的腫瘤病理分型中有不同表現的程度，證明 OPN 在腫瘤的侵襲與轉移中扮演重要角色 (Coppola, 2004)。

另外有一些研究發現，人及齧齒類動物的原癌基因 (proto-oncogene) 轉化為癌基因後，會促進細胞內 OPN 分泌增加。已經有轉移情況的癌症病人的血清中 OPN 濃度升高；在腫瘤促進劑作用下某些細胞 OPN 表達增多；OPN 的表達還與某些腫瘤相關基因如 ras、v-myc 等的表達密切相關 (Tuck, 1997)。

George 等發現前列腺癌病患轉移至骨的腫瘤標本中 OPN 呈高量表達，同時 OPN

(31)

mRNA 表現也呈陽性，所以前列腺癌的惡性程度和轉移與 OPN 的表現量成正相關 (George, 1999)。Hotte 等也發現血清 OPN 表現量與前列腺癌轉移至骨呈正相關，而和生存率呈負相關 (Hotte, 2002)。

Agrawal 等藉由基因晶片技術，對臨床不同分期的結腸癌病例分析 12000 個基因表現，發現 OPN 在腫瘤的發生、發展過程中有一定的標誌作用 (Agrawal, 2003)。另外，

Yeatman 等也說明了 OPN 與結腸癌侵襲與轉移有正相關 (Yeatman, 2003)。

(五)、OPN 在乳癌中的表現

Cook 等學者利用基因晶片分析，發現 OPN 在乳癌中所誘發的基因含跨 six hallmarkers，OPN 和乳癌的發展有絕對的關係 (Cook, 2005)。

Rudland 等利用免疫組織化學方法對 333 例 Ⅰ 期和 Ⅱ 期乳癌手術病人腫瘤標本進行分析，發現 OPN 表達與乳癌的淋巴結轉移相關，並且 OPN 陽性的病人只有 26% 生存期超過 19 年，而 OPN 陰性的病人中 94% 依然存活，認為 OPN 與乳癌病人的預後密切有關，癌細胞表現 OPN 的病人生存率低且生存率較低 (Rudland, 2002)。

Sharp 和 Urquidi 研究發現具高度轉移性乳癌細胞株中 OPN 有高表現量 (Sharp, 1999; Urquidi, 2002)。Singhal 也發現 OPN 在有轉移的乳癌患者血清中的表現明顯高於無轉移者，且 OPN 表現量較高者的生存率明顯較低 (Singhal, 1997)。

Tuck 等發現 OPN 不僅藉由和特殊的細胞表面整合素結合啟動生長因子誘導乳癌細胞的轉移，同時增加蛋白水解酶的活性促使癌細胞轉移。所以學者認為 OPN 在腫瘤組織中與血液中的表現可以做為女性乳癌的預後指標 (Tuck, 2001; Mi, 2006; Frey, 2006)。

(六)、OPN 調控癌細胞轉移的可能機制

先前已經有許多學者在具轉移的腫瘤細胞株或已有轉移情況的組織中發現 OPN 有高量的表現，也有文獻證實 OPN 可能參與癌細胞的轉移、血管新生 (Fumiyuki, 2002)

(32)

等，都說明 OPN 在癌細胞轉移時扮演極重要的角色。

OPN 可以藉由和整合素-αvβ3 或 CD44 結合後，調控 NF-κB (nuclear factor-κB)或是活化 PI3K/Akt 進而誘導蛋白水解酶如基質金屬蛋白酶或尿激酶型胞漿素原活化子 (urokinase-type plasminogen activator, uPA) 的表現，促使癌細胞轉移 (Weber, 1996; Philip, 2003; Das, 2003)。

腫瘤的生長、浸潤及轉移依賴血管形成。Shijubo 等在體內實驗發現 OPN 會調控血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的表現，同時促使內皮細胞的遷移而促使血管新生 (Shijubo, 2000)。

OPN 可以抑制 NO 及 O^2- 、OH^- 等自由基的產生，使得癌細胞在周圍環境的生存率提高，促進轉移細胞的生存 (Denhardt, 1994)。另外，OPN 可以調控 NF-κB (Philip, 2001)，而抑制細胞凋亡。

圖七、OPN 和細胞表面 integrin αvβ3、CD44 結合並調控下游基因的表現 (Desai, 2007)。

(33)

圖八、OPN 調控 uPA、MMPs 促使細胞轉移 (Rangaswami, 2006)。

(七)、OPNc 可以做為預測乳癌發展和遠處轉移的標定基因

目前醫生診斷乳癌的三大標定基因為雌激素受體 (ER)、黃體激素受體 (PR) 和 HER-2 等三者的表現，但 ER、PR 和 HER-2 也會在正常的乳房組織中被檢測到，且這三個蛋白質為細胞表面分子，可以促進細胞生長，所以不能準確的預測腫瘤的轉移 (Mirza, 2008)。

OPN 與腫瘤的侵入和轉移密切相關，因此 OPN 可能可以做為一種判斷預後及監測腫瘤復發或轉移的指標。OPN 的表現可以在基因層次被抑制，或以蛋白合成阻斷 OPN 和其受體結合，以抑制癌細胞的轉移，這也可以做為日後癌症治療的新方向 (Weber, 2001; Zhang, 2004)。

(34)

最新的研究發現，轉移性乳癌細胞株皆可以檢測到 OPN 三種 isoform 的表現，但在正常細胞中仍可檢測到 OPNa、OPNb 的表現，卻幾乎檢測不到 OPNc 的表現 (He, 2006)。Mirza 等作者對包含乳癌患者和正常人等 178 名病患進行了為期兩年的追蹤研究，結果發現，在乳癌患者中，OPNc 陽性率比其他三大標定基因高。其中，78% 的乳癌和 36% 的癌細胞周圍組織中也被偵測到有 OPNc 的表現，而在所有正常組織中未偵測到 OPNc (Mirza, 2008)。

綜合以上結果，OPN 可以做為一種判斷預後及監測腫瘤復發或轉移的指標，尤其以 OPNc 表現的偵測最具意義。

(35)

第二章第二章第二章

第二章、、、、研究研究研究研究目的目的目的目的

犬乳癌佔雌性犬癌症的 52 % (Vail, 2000)，亦是雌性犬中主要的癌症。目前國內、

外犬乳腫瘤治療以外科手術為主，但手術後都有高轉移率及復發率 (Ahern, 1996; Allen, 1989; Gobello, 2001; MacEwen, 1985; Moulton, 1990)。犬乳癌和人乳癌有相似的生理特性 (Nerurkar, 1989)，也和人乳癌有相似的高發生率，相較其他動物使用人為誘發方式 (Sukumar, 1995)，犬更適合做為人類乳房腫瘤防治之研究。在近幾年的研究中，犬乳癌已做為人乳癌研究的動物模式 (Schneider, 1970; Pierrepoint, 1985)，所以本篇亦使用犬乳癌細胞做為研究的對象。本篇研究中使用具 tumorigenesis 的 DTK-SME-like 和不具 tumorigenesis 的 DE-E 等兩株犬乳癌細胞株。

乳癌為國人常見的婦女癌症，也是全球女性常見癌症第四名，對女性健康造成非常大的危害。目前乳癌的化學治療藥物缺乏對細胞的選擇性，毒殺癌細胞同時也傷害正常細胞，易造成嚴重的副作用，故找出使癌細胞自殺卻不影響正常細胞的化學治療藥物是刻不容緩的課題。從乳癌的臨床分期和相對病人存活率可知，癌細胞的轉移和病人的預後有絕對的關係，所以積極研究乳癌轉移的關鍵基因，可以抑制癌細胞的轉移而提高病人存活率。

Bupivacaine 是一長效型醯胺類局部麻醉劑，可用於分娩婦女，具高安全性。目前 bupivacaine 誘導細胞凋亡的相關文獻非常少，僅在人類白血病細胞株 (U937)、人類腎臟細胞株 (HK-2) 和人類白血病細胞株 (HL-60) 發現 bupivacaine 會誘導細胞凋亡 (Arai, 2002; Lee, 2004; Unami, 2003)。本研究嘗試以 bupivacaine 誘導犬乳癌細胞株 (DTK-SME-like) 細胞凋亡，藉由細胞凋亡途徑分析，探討 bupivacaine 是否有潛力做為乳癌化學治療藥物，並可能僅對局部癌細胞作用。

OPN 是一個分泌型高度磷酸化的蛋白質，與乳癌的轉移有絕對的關係 (Cook, 2005)。癌細胞中會表現三種 isoform 的 OPN，分別命名為 OPNa、OPNb、OPNc。最新的研究中發現，OPNc 僅表現於轉移性乳癌細胞 (He, 2006; Mirza, 2008)，因此，OPNc

(36)

可能是最主要誘導乳癌轉移的關鍵基因。本研究分析 OPNa 及 OPNc 是否誘導犬乳癌細胞株 (DEE) 發生上皮細胞間質轉化而促使癌細胞轉移，以及 OPNa 和 OPNc 兩者所造成癌細胞轉移的程度差異性，探討 OPNc 是否可做為乳癌的轉移指標基因，日後可以做為癌症治療的新方向。

(37)

第第第

第三三三三章章章章、、、、材料材料材料材料

一、細胞株

(一)、犬乳癌細胞株 (canine breast cancer)：DTK-SME-like、DE-E。

(二)、人類乳癌細胞株 (human breast cancer)：MDA-MB-231。

二、菌株

(一)、E. coli：XL-10 Gold (tetracycline-resistance)。

三、載體

(一)、真核表現載體：pCMVTag4A (kanamycin-resistance)。

四、藥劑

(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), MTT (Bio basic inc.) 10 × ligation buffer (Roche)

10 × M-MLV buffer (Invitrogen)

10 × NEB buffer 2 (New england biolabs^®inc.) 10 × PCR buffer (Bioman)

1kb DNA marker (Pantech) Agar (Bitek^®)

Agrose (J.T.backer)

Alexa Fluor^® 488 conjugated annexin V (Invitrogen)

(38)

Ampicillin (Sigma)

ApoAlert^® DNA fragmentation assay kit (Clontech) Bovine serum albumin, BSA (Sigma)

Bupivacaine (Sigma) CaCl2 (J.T. backer) CaCl2 (J.T.backer)

Caspase-3/FLICE fluorometric assay kit (Biovision) Caspase-8/FLICE fluorometric assay kit (Biovision) Caspase-9/FLICE fluorometric assay kit (Biovision) Chloroform (Merck)

Dimethyl sulphoxide, DMSO (Sigma) DMEM (Gibco^TM)

dNTP (Yeastern biotech)

Dulbecc’s phosphate-buffered saline, PBS (Gibco^TM) EDTA (J.T.Backer)

Ethanol (Merck)

Ethidium bromide, EtBr (Merck) Fetal bonvium serum, FBS (Gibco^TM) First-strand buffer (Invitrogen) Formaldehyde (Merck)

Gel-M^® extraction miniprep kit (Viogene) Geneticin (Gibco^TM)

Glucose (Sigma) HEPES (Serva)

(39)

Hind III (Roche)

Hoechst 33258 (Sigma) Isopropanol (Merck) Ligase (Roche)

Lipofectamine^TM 2000 reagent (Invitrogene) Methanol (Fluka)

Mini-M^TM plasmid DNA extraction kit (Viogene) M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen)

NaCl (Merck) NaHCO3 (Mweck) Oligo dT (Invitrogen)

Osteopontin forward primer 5’-CCCAAGCTTATGAGAATTGCAGTGATT-3’ (Mission biotech)

Osteopontin forward primer 5’-CCGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGC-3’ (Mission biotech)

PCR-M^TM clean up kit (Viogene) Penicillin (Gibco^TM)

Phenol (Amersco)

Protein binding dye (Bio-rad^®) Proteinase K (Merck)

RNase A (Sigma) RPMI 1640 (Gibco^TM)

S.N.A.P.^TM total RNA isolation kit (Invitrogen) Sodium dodecyl sulfate, SDS (Sigma)

(40)

Sodium pyruvate (Sigma) Streptomycin (Gibco^TM)

TAE buffer (Uniregion bio-tech) Taq DNA polymerase (Bioman) Tetracycline (Sigma)

Tris-base (J.T.backer) Tris-Cl (J.T.baker)

Triton X-100 (J.T.backer) Trypsin (Gibco^TM)

Tryptone (Bio basic inc.)

Xho I (New england biolabs^®inc.) Yeast extract (Bacto^TM)

z-VAD-FMK (Sigma)

五、儀器

電磁加熱攪拌器 (Labtech lms-1003)

0.22 µm 過濾膜 (Nalgene^® mf75^tmfilters with supor^®mach v membrane) 恆溫培養箱中 (Nuaire^tm nu4750)

電子天平 (Mettler toledo pb602-s)

震盪器 (Pantech instruments co. spin mixer 5100)

0.22 µm 過濾膜 (Pall corporation acrodisc^® syringe filters) 血球計數盤 (Hausser scientific bright-line^®hemacytometer) 手持式計數器 (Line h-102)

(41)

24 孔培養盤 (Falcon^®)

倒立式顯微鏡 (Olympus ckx41) 96 孔培養盤 (Falcon^®)

Elisa reader (Molecular devices spctramax m2) 倒立式螢光顯微鏡 (Leica dmirb)

10 cm petri dish (Falcon^®)

倒立式螢光顯微鏡 (Olympus 1x71) 低速離心機 (Tomy lc-220)

高速微量離心機(Kubota 3300) 1.5 ml 離心管 (Viogene)

鑄模槽 (Major science inc. short mini horizontal gel electrophoresis system) 水平電泳槽 (Major science inc. shorter mini gel system)

電源供應器 (Major science inc mp-250n) 紫外線照射儀 (UVp biodoc-it m-20)

全波段長紫外光可見光分光光譜儀 (Thermo genesys 10) PCR 機器 (Bio-rad mycycler^tm thermal cycler)

數位顯示乾浴器 (Basic life bl3001) 恆溫水浴槽 (Firstek b206)

低溫迴轉式震盪培養箱 (裕德 lm-575r) 50 ml 離心管 (Falcon^®)

高速冷凍離心機 (Kubota 6500) 6 孔培養盤 (Falcon^®)

(42)

第第第

第四四四四章章章章、、、、方法方法方法方法

一、細胞培養

DTK-SME-like 和 DE-E 細胞被培養於含有 5% fetal bovine serum、2 g/l NaHCO₃、 0.1 mM sodium pyruvate、4.5 g/l glucose、100 units/ml penicillin 和 100 µg/ml streptomycin 的 RPMI 1640 培養液中。MDA-MB-231 細胞被培養於含有 10% fetal bovine serum、3.7 g/l NaHCO3、100 units/ml penicillin 和 100 µg/ml streptomycin 的 DMEM 培養液中。細胞皆於 37℃、5% CO₂、飽和溼度的恆溫培養箱中培養。

二、Bupivacaine 的配製

(一)、90 mM bupivacaine 的配製

秤重 1.46 g bupivacaine，加入 ddH₂O 定量至 50 ml，震盪溶解。利用 0.22 µm 過濾膜過濾後，4℃ 避光儲存。

(二)、2 mM bupivacaine 的配製

將 90 mM bupivacaine 稀釋於培養液中即可。

三、細胞毒性試驗

(一)、細胞存活率試驗 (MTT assay)

1、實驗原理

MTT (3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 為黃色水溶性的 terazolium 鹽類，可被活細胞中 mitochondria dehydrogenase 還原而產生暗紫色不溶性沈澱物 formazan，本實驗則是根據紫色 formazan 的產量來推斷細胞的相對存活率。

(43)

圖九、MTT 經粒線體代謝為 formazan，可被 570 nm 偵測。

2、步驟

5 × 10⁴DTK-SME-like 細胞被培養於 96 孔細胞培養盤，37℃ 培養 18 小時。加入含有不同濃度 bupivacaine (0~8 mM) 的培養液，37 ℃ 分別培養 18 小時，或以含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 分別培養 0、12、24 和 36 小時。去除培養液，PBS 清洗後，加入 100 µl 的 1 mg/ml MTT/PBS，於 37℃ 恆溫培養箱中培養 3 小時。最後吸乾 MTT 後，加入 100 µl 的 DMSO，置於 ELISA reader 偵測波長 570 nm 的讀值。計算方式為存活率 = (處理組存活細胞/控制組存活細胞) × 100%，以正常培養液下的 DTK-SME-like 細胞做為 100% 來表示。

(二)、細胞型態的觀察

1、實驗原理

利用細胞凋亡特有的生理特徵及型態，以顯微鏡觀察細胞是否觀察細胞的空泡形成、細胞皺縮、染色質濃縮等型態的變化。

2、步驟

1 × 10⁵ DTK-SME-like 細胞被培養於 24 孔細胞培養盤，37℃ 培養 18 小時。加入含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 分別培養 0、12、24 和 36 小時，以倒立式光學顯微鏡觀察細胞型態。

(44)

四、細胞凋亡試驗

(一)、Annexin V 的染色分析

1、實驗原理

凋亡細胞能夠維持細胞膜結構的完整，但細胞膜喪失了其磷脂分子分佈的非對稱性，導致磷脂絲胺酸 (phosphatidylserine, PS) 暴露於胞膜外，使凋亡細胞易被吞噬細胞辨認。暴露胞膜外的磷脂絲胺酸容易被觀察，成為凋亡細胞的另一特徵和檢測指標。

2、步驟

5 × 10⁴DTK-SME-like 細胞培養於 96 孔細胞培養盤，37℃ 培養 18 小時。去除培養液，加入 100 µl 含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 分別培養 0、18 和 24 小時。去除培養液，PBS 清洗後，加入 100 µl 的 binding buffer (0.01 M HEPES pH 7.4、

0.14 M NaCl、2.5 mM CaCl₂) 潤濕細胞，去除 binding buffer。最後將 5 µl 的 Alexa Fluor^® 488 conjugated annexin V 稀釋於 20 µl 的 binding buffer，將稀釋液加入 96 孔盤中，室溫避光培養 15 分鐘，即可使用倒立式螢光顯微鏡觀察。

(二)、Hoechst 33258 的染色分析

1、實驗原理

細胞與胞核濃縮是凋亡早期發生的形態學變化，碎裂的核片斷可以被胞膜包裹游離出細胞外，成為凋亡小體，並被周圍細胞吞噬。染色質的這些特徵性變化，可以用顯微鏡直接觀察。Hoechst 33258 為 bis-benzimidazole 螢光染劑的一種，可結合於雙股 DNA 之 minor grooves 上，可藉由 hoechst 33258 的染色觀察細胞核濃縮。

2、步驟

5 × 10⁶DTK-SME-like 細胞被培養於 10 cm petri dish，37℃ 培養 0 和 18 小時。

去除培養液，加入含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 恆溫培養箱中分別培養 0、

(45)

12 和 24 小時。去除培養液，PBS 清洗後，加入 10 ml 的 1.5% 的 formaldehyde/

PBS ，室溫培養 15 分鐘。去除 1.5% formaldehyde/PBS ，加入 10 ml 的 100%

methanol，室溫培養 20 分鐘。去除 100% methanol，加入 10 ml 的 12 µg/mL hoechst 33258/PBS 溶液，室溫、避光培養 15 分鐘。最後去除 hoechst 33258/ PBS 溶液，PBS 清洗細胞後，即可使用倒立式螢光顯微鏡觀察。

(三)、去氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記分析 (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)

1、實驗原理

細胞進行細胞凋亡時，染色體 DNA 雙鏈或單鏈斷裂而產生 3'-OH 外曝，可在去氧核糖核苷酸末端轉移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 的作用下，將接上螢光 (green fluorescence) 標定之 dUTP，標記到 DNA的 3'- 末端，進行凋亡細胞的檢測。

2、使用 Apoalert^® DNA fragmentation assay kit 檢測

Apoalert^® DNA fragmentation assay kit 內含物有 equilibration buffer、nucleotide mix、terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 和 10 × SSC。

3、步驟

5 × 10⁴DTK-SME-like 細胞被培養於 96 孔細胞培養盤，37℃ 培養 18 小時。去除培養液，加入含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37 ℃ 分別培養 0、18 和 24 小時。

收集貼附及懸浮於培養液中的細胞，PBS 清洗後，加入 100 µl 的 4% formaldehyde/

PBS，4℃ 培養 5 分鐘。去除 4% formaldehyde/PBS，加入 100 µl 的 PBS，室溫培養 5 分鐘，此步驟重複兩次。去除 PBS，加入 100 µl 的 2% Triton X-100/PBS，4 ℃ 培養 5 分鐘。去除 2% Triton X-100/PBS，加入 100 µl 的 PBS，室溫培養 5 分鐘，此步驟重複兩次。加入 25.5 µl 的 TdT reaction buffer (22.5 µl equilibration buffer、2.5 µl

(46)

nucleic acid mix、0.5 µl TdT)，37℃ 培養 1 小時。去除 TdT reaction buffer，加入 100 µl 的 2 × SSC/ddH₂O，室溫培養 15 分鐘。去除 2 × SSC/ddH₂O，加入 100 µl 的 PBS，

室溫培養 5 分鐘，此步驟重複兩次後，即可使用螢光顯微鏡觀察。

(四)、DNA 片斷化試驗 (DNA fragmentation assay)

1、實驗原理

DNA 片斷化 (DNA fragmentation) 為細胞發生 apoptosis 時典型的指標。凋亡細胞會觸發 DNA 內切酶的活化，將核小體間的 DNA 切割，形成 180~200 b.p. 倍數之寡核苷酸片斷，可以在電泳分析觀察到。

2、步驟

5 × 10⁶DTK-SME-like 細胞被培養於 10 cm petri dish，37℃ 培養 18 小時。去除培養液，加入含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 培養 0、12、24 和 36 小時。

收集貼附及懸浮於培養液中的細胞於 1.5 ml 離心管，加入 500 µl 的 digestion buffer (100 mM Tris-base pH 8.0、5 mM EDTA、0.2% SDS、200 mM NaCl、50 µg/ml RNase A、

200 µg/ml proteinase K) 混合，55℃ 培養 45 分鐘。加入 500 µl 的 phenol/chloroform (1：1) 混合，室溫轉速 18,000 × g、離心 20 分鐘。將上清液轉至 1.5 ml 離心管，加入 500 µl 的 100% ethanol 混合，室溫轉速 18,000 × g、離心 10 分鐘，完全除去上清液。將 1.5 ml 離心管中 DNA 風乾，最後加入 20 µl 的滅菌水溶解 DNA。將萃取的 DNA 以 2% agrose gel，利用 100 V、50 分鐘進行 DNA 電泳分析。

五、凋亡路徑分析

細胞凋亡時，伴隨一系列蛋白酶學的改變，多種 caspase 活性變化參與凋亡的啟動、執行過程。檢測 caspase 活性變化，是分析凋亡發生機制和特徵的另一方法。

(一)、Caspase 活性測試 (caspase activity assay)

(47)

1、使用 caspase/FLICE fluorometric assay kit 檢測 caspase-3、caspase-8、caspase-9 的活性

Caspase/FLICE fluorometric assay kit 內含物有 cell lysis buffer、2 × reaction buffer、

1 M DTT 和 caspase 專一性受質 (1 mM DEVD-AFC for caspase-3、1 mM IETD-AFC for caspase-8、1 mM LEHD-AFC for caspase-9)。

2、步驟

5 × 10⁶DTK-SME-like 細胞被培養於 10 cm petri dish，37℃ 培養 18 小時。去除培養液，加入含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37℃ 恆溫培養箱中分別培養 0、12、

24 和 36 小時。收集貼附及懸浮於培養液中的細胞於 1.5 ml 離心管，加入 50 µl cell lysis buffer 混合，冰上培養 10 分鐘。加入 50 µl 含有 10 mM DTT 的 2 × reaction buffer 混合，再分別加入 5 µl 的 caspase-3、-8、-9 的受質混合，37 ℃ 培養 1 小時。

最後將混合液轉至 96 孔盤中，使用 ELISA reader 來判讀吸光值 505 nm 的數值，即可得到 caspase-3、-8、-9 的相對活性。

(二)、Caspase inhibitor assay

5 × 10⁴DTK-SME-like 細胞被培養於 96 孔細胞培養盤，37℃ 培養 18 小時。去除培養液，加入 100 µl 含有廣效型 caspase 專一性抑制劑 100 µM z-VAD-fmk 或含有 0.2 µl DMSO 的培養液 (as control)，37 ℃ 培養 2 小時。去除培養液，加入 100 µl 含有 2 mM bupivacaine 的培養液，37 ℃ 分別培養 0、12、24 和 36 小時後，用細胞存活率試驗分析之。

六、Osteopontin 表現載體的構築

(一)、細胞總 RNA 的萃取

1、使用 S.N.A.P.^TMtotal RNA isolation kit 萃取細胞總 RNA

(48)

S.N.A.P.^TMtotal RNA isolation kit 內含物有 binding buffer、super wash solution、RNA wash solution (100% ethanol added)、S.N.A.P. total RNA columns with collection tubes 和 RNase-free water。

2、步驟

配製 TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.5、1 mM EDTA)。收集 5 × 10⁶ MDA-MB-231 細胞於 1.5 ml 離心管，加入 600 µl 的 lysis buffer (150 µl TE buffer、450 µl binding buffer) 混合，室溫轉速 18,000 × g、離心 3 分鐘。取出上清液轉至 1.5 ml 離心管，加入 300 µl 的 isopropanol 混合。將混合液注入已放入 collection tube 的 S.N.A.P. total RNA column上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，將 collection tube 中的濾液倒掉。

加入 600 µl 的 super wash solution 至 S.N.A.P. total RNA column 上，室溫轉速 18,000

× g、離心 1 分鐘，將 collection tube 中的濾液倒掉。加入 600 µl 的 RNA wash solution 至 S.N.A.P. total RNA column 上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘。再次加入 600 µl 的 RNA wash solution 至 S.N.A.P. total RNA column 上，室溫轉速、18,000 × g、離心 1 分鐘。最後把 S.N.A.P. total RNA column 轉放至 1.5 ml 離心管上，加入 100 µl 的 RNase-free water，室溫靜置 5 分鐘，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，即可得細胞總 RNA。

(二)、反轉錄 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)

反轉錄 PCR 反應溶液最終體積為 20 µl，反應在一 mycycle^TM themal cycle 儀器中進行。先將 5 µg 的細胞總 RNA、1 µg oligo dT primer、first-strand buffer 和 RNase-free water 混合，在 65℃ 進行 annealing 5 分鐘，在 4℃ 進行降溫 10 分鐘，進行 1 個循環。加入 200 units M-MLV reverse transcriptase、0.01 M DTT 和 0.5 mM dNTP，在 42℃ 進行 extension 60 分鐘，70℃ 進行 15 分鐘，進行 1 個循環。

(三)、聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)

聚合酶連鎖反應溶液最終體積 50 µl，反應在一 mycycle^TM themal cycle 儀器中進

(49)

行。將 0.1 µg 的 DNA、0.2 mM dNTP、5 units 的 Taq DNA polymerase、1 × PCR buffer (1.5 mM MgCl₂ added) 和 0.1 µM primer 混合，再進行增幅。Osteopontin 的增幅是在 94℃ 進行 denaturation 60 秒，在 58℃ 進行 annealing 60 秒，在 72℃ 進行 extension 60 秒，進行 35 個循環。OPN 的 primer 為 forward primer 5’-CCCAAGCTTATGAGA ATTGCAGTGATT-3’、reverse primer 5’-CCGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGC-3’。

(四)、PCR 產物的純化

1、DNA 電泳膠體的分離

(1)、使用 Gel-M^®extraction miniprep kit 回收膠體 DNA

Gel-M^®extraction miniprep kit 內含物有 GEX buffer、WF buffer、WS buffer (100%

ethanol added)、elution buffer 和 Gel-M^TM colum collection tube。

(2)、步驟

將 PCR 產物進行 DNA 電泳，切下目標片段所在位置的膠片置於 1.5 ml 離心管。每 200 g 的膠體和 500 µl 的 GEX buffer 在 60℃ 溶解混合。將混合液注入已放入 collection tube 的 Gel-M^TM column 上，室溫轉速 18,000 × g 離心 1 分鐘，將 collection tube 中的濾液倒掉。加入 500 µl 的 WF buffer 至 Gel-M^TM column 上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，將 collection tube 中的濾液倒掉。加入 700 µl 的 WS buffer 至 Gel-M^TM column 上，室溫轉速、18,000 × g、離心 1 分鐘。最後把 Gel-M^TM column 轉放至 1.5 ml 離心管上，加入 50 µl 的二次水，室溫靜置 3 分鐘後，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，即可回收膠體 DNA。

2、PCR 產物純化

(1)、使用 PCR-M^TM clean up kit 純化 PCR 產物

PCR-M^TM clean up kit 內含物有 PX buffer、WF buffer、WS buffer (100 %ethanol added)、elution buffer、PCR-M^TM clomu 和 collection tube。

(50)

(2)、步驟

將體積 100 µl 以內的 PCR 產物和 500 ml 的 PX buffer 混合。將混合液注入已放入 collection tube 的 PCR-M^TM column 上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘後，將 collection tube 中的濾液倒掉。加入 500 µl 的 WF buffer 至 PCR-M^TM column 上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，將 collection tube 中的濾液倒掉。加入 700 µl 的 WS buffer 至 PCR-M^TM column 上，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘。最後把 PCR-M^TM column 轉放至 1.5 ml 離心管上，加入 50 µl 的二次水，室溫靜置 3 分鐘後，室溫轉速 18,000 × g、離心 1 分鐘，即可得到純化的 PCR 產物。

5、DNA 限制酶的剪切

DNA 限制酶的剪切反應溶液最終體積為 50 µl。將限制酶 5 units Xho I、5 units Hind III、1 × NEB buffer 2 (10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、50 mM NaCl、1 mM DTT_.)、

5 µg 的載體 DNA (pCMVTag4A) 或 5 µg 的嵌入 DNA (OPNa 或 OPNc) 混合。將配製好的反應溶液於 37℃ 作用 6 小時，再使用 PCR-M^TM clean up kit 純化 DNA 產物。

6、接合反應

接合反應溶液最終體積為 30 µl。將 1 unit ligase、1 × ligation buffer、已經限制酶切割的 2 µg 的載體 DNA (pCMVTag4A) 和 0.4 µg (OPNa 或 OPNc) 的嵌入 DNA 混合。將配製好的反應溶液 4℃ 作用 16 小時。

七、基因選殖

(一)、大腸桿菌的轉型作用

1、勝任細胞 (competent cells) 的製備

挑取 XL-10 Gold 之單一菌落，加入 3 ml 含 30 µg/ml 的 tetracycline 的 LB (10

國立宜蘭大學生物技術研究所碩士論文 Institute of Biotechnology National Ilan University Master Thesis