【11】證書號數：I361041 【45】公告日： 中華民國 101 (2012) 年 04 月 01 日 【51】Int. Cl.： A01H1/00 C12N15/63 (2006.01) (2006.01) C12N15/29 (2006.01) 發明 全 9 頁 【54】名 稱：促進植物產生香味之基因、蛋白質及方法
GENE, PROTEIN AND METHOD FOR IMPROVING AROMA PRODUCTION IN PLANTS
【21】申請案號：097127663 【22】申請日： 中華民國 97 (2008) 年 07 月 21 日 【11】公開編號：201004559 【43】公開日期： 中華民國 99 (2010) 年 02 月 01 日 【72】發 明 人： 陳虹樺 (TW) CHEN, HONG HWA；蕭郁芸 (TW) HSIAO, YU YUN；蔡文杰
(TW) TSAI, WEN CHIEH；陳文輝 (TW) CHEN, WEN HUEI 【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG
UNIVERSITY 臺南市東區大學路 1 號 【74】代 理 人： 蔡東賢 【56】參考文獻： US 2002/0106772A1 蕭郁芸，大葉蝴蝶蘭(Phalaenopsis bellina)香味生合成及其相關基因之研究， 國立成功大學生命科學系碩博士論文，2008 年 5 月 29 日
Hsiao, et al., “Comparison of transcripts in Phalaenopsis bellina and Phalaenopsis equestris (Orchidaceae) flowers to deduce monoterpene biosynthesis pathway”, BMC Plant Biology, 6, 14, 2006.
Hsiao, Y.Y et al., A novel geranyl diphosphate synthase without an Asp-rich motif functioning as a homodimer in a plant. Taiwan Proteomics Society International Conference 2007.Abstract Book, P123. NCKU,Tainan, Taiwan.
審查人員：黃教威 [57]申請專利範圍 1. 一種經單離之核酸分子，其包括選自下列聚核苷酸所組成之群：(a)SEQ ID NO：1 之核 苷酸序列；及(b)編碼 SEQ ID NO：2 胺基酸序列的聚肽之聚核苷酸。 2. 一種載體，其包含根據請求項 1 之核酸分子。 3. 根據請求項 2 之載體，其係可於植物體中表現之穿梭載體。 4. 根據請求項 2 之載體，其包含可誘導之啟動子。 5. 一種套組，其包含如請求項 2 至 4 中任何一項之載體。 6. 一種經轉殖之細胞，其包含如請求項 2 至 4 中任何一項之載體。 7. 根據請求項 6 之細胞，其中該細胞為原核細胞。 8. 根據請求項 6 之細胞，其中該細胞為植物細胞。 9. 根據請求項 8 之細胞，其中該細胞為單子葉植物細胞。 10. 根據請求項 9 之細胞，其中該細胞為蘭科植物細胞。
11. 根據請求項 10 之細胞，其中該細胞為蝴蝶蘭細胞。 12. 根據請求項 8 之細胞，其中該細胞為阿拉伯芥細胞。 13. 一種製造轉殖植物之方法，其步驟包含：(a)將具根據請求項 1 之核酸分子導引至植物細 胞以獲得將該植物轉殖細胞；及(b)將該植物轉殖細胞再生製造該轉殖植物。 14. 根據請求項 13 之方法，其中該植物細胞為單子葉植物細胞。 15. 根據請求項 14 之方法，其中該植物細胞為蘭科植物細胞。 16. 根據請求項 15 之方法，其中該植物細胞為蝴蝶蘭細胞。 17. 根據請求項 13 之方法，其中該植物細胞為阿拉伯芥細胞。 18. 根據請求項 13 之方法，其中該植物細胞係源自擬原球體。 19. 根據請求項 13 之方法，其中步驟(a)係以基因槍(gene gun)將該核酸分子導引至該植物細 胞。 20. 一種製造植物轉殖細胞之方法，其係將根據請求項 1 之核酸分子導引至植物細胞中，以 獲得該植物轉殖細胞。 21. 根據請求項 20 之方法，其中該植物細胞為單子葉植物細胞。 22. 根據請求項 21 之方法，其中該植物細胞為蘭科植物細胞。 23. 根據請求項 22 之方法，其中該植物細胞為蝴蝶蘭細胞。 24. 根據請求項 20 之方法，其中該植物細胞為阿拉伯芥細胞。 25. 根據請求項 20 之方法，其中該植物細胞係源自擬原球體。 26. 根據申請專利範圍第 20 項之方法，其係以基因槍將該核酸分子導引至該植物細胞。 27. 一種經單離之蛋白質，其係由根據請求項 1 之核酸分子所編碼。
28. 根據請求項 27 之蛋白質，其具有二磷酸香葉酯合成酶(geranyl diphosphate synthase，GDPS) 之功能。
29. 根據請求項 28 之蛋白質，其具有二磷酸法呢酯合成酶(farnesyl diphosphate synthase， FDPS)之功能。 30. 根據請求項 27 之蛋白質，其係具有如 SEQ ID NO：2 所示之胺基酸序列。 31. 根據請求項 27 之蛋白質，其係用以催化植物產生單萜及其前驅物。 32. 根據請求項 31 之蛋白質，其中該植物係為單子葉植物。 33. 根據請求項 32 之蛋白質，其中該植物係為蘭科植物。 34. 根據請求項 33 之蛋白質，其中該植物係為蝴蝶蘭。 35. 根據請求項 31 之蛋白質，其中該植物係阿拉伯芥。 36. 根據請求項 31 之蛋白質，其中單萜之前驅物係為二磷酸香葉酯或二磷酸法呢酯。 37. 根據請求項 31 之蛋白質，其中單萜係為香葉醇(geraniol)或裏哪醇(linaool)。 38. 一種於植物體促進單萜類及其前驅物分子合成之蛋白質之方法，其包含增加根據請求項 27 至 37 任何一項之蛋白質於該植物體的表現量。 39. 根據請求項 38 之方法，其包含增加包含於該植物體之至少一細胞內增加編碼該蛋白質之 核酸分子之套數。 40. 根據請求項 39 之方法，其中該細胞係源自擬原球體。 41. 一種於植物體促進香味產生之方法，其包含增加根據請求項 27 至 37 任何一項之蛋白質 於該植物體的表現量。 42. 根據請求項 41 之方法，其包含增加包含於該植物體之至少一細胞內增加編碼該蛋白質之
43. 根據請求項 41 之方法，其中該細胞係源自一擬原球體。 44. 一種用於植物以抵抗微生物或昆蟲感染之方法，其包含增加根據請求項 27 至 37 任何一 項之蛋白質於該植物體的表現量。 45. 根據請求項 44 之方法，其包含增加包含於該植物體之至少一細胞內增加編碼該蛋白質之 核酸分子之套數。 46. 根據請求項 45 之方法，其中該細胞係源自擬原球體。 圖式簡單說明 圖 1.北美冷杉及金魚草之大次單位 GDPS 中之保守性富含天冬胺酸酯之基元(DDXXD， 黑格)，及 PbGDPS 中之假定活性位點(EAEVE)。破折號指示為達成最佳比對所插入之間隔。 水平線指示假定 N 端轉運肽區域。箭頭指示 PbGDPS 之截斷位點。 圖 2.PbGDPS 之酶活性。(A)具有不同金屬離子(包括 Mg2 ＋ 或 Mn2 ＋ 及 K＋ )(10 mM)之 經純化重組 PbGDPS 蛋白(100 μg)之異戊 烯基轉移酶活性。煮熟蛋白係於同一檢定中用作陰 性對照物。每一點為來自三個獨立實驗之值的平均值。垂直條指示標準誤差值。(B)藉由使用 具有不同鏈長之各種異戊烯基二磷酸酯作為受質來對 PbGDPS 產物進行薄層層析(TLC)表 徵。在煮熟蛋白(色帶 1)及 PbGDPS 重組蛋白(色帶 2)與[4－14 C]IPP、DMADP、GDP 及 FDP 一起培育後，將反應產物去磷酸化，藉由 TLC 檢定且隨後自動放射照相。"Or"係指起源位點 及由可靠標準物(包括香葉醇(GOH，Rf ＝ 7.5 cm)、法呢醇(FOH，Rf ＝ 9 cm)及香葉基香葉醇 (GGOH，Rf ＝ 9.6 cm))鑑別之香葉醇。獨立地將該實驗重複三次。(C)定量在(B)由二磷酸異 戊烯酯產物之酶性水解產生之異戊烯醇的分析中之放射性－TLC。 圖 3.(A)藉由北方墨點雜合來分析 PbGDPS 之空間表現(色帶 1－8)及時間表現(色帶 9－ 16)。核糖體 RNA 指示在每一色帶中負載相同量之總 RNA。(B)定量自大葉蝴蝶蘭之開花之日 (Dd)至開花後第 14 天(D ＋ 14)所散發之裏哪醇及香葉醇。(C)在開花後第 5 天(D ＋ 5)在花瓣 之表皮上原位定位 PbGDPS。將切片與反義 3'－特異性 RNA 探針(a－b)或有義特異性 RNA 探 針(c－d)雜合。UP 為上表皮。 圖 4.大葉蝴蝶蘭、姬蝴蝶蘭"W9－72"及朵麗蝶蘭"5"之芳香物種及姬蝴蝶蘭與朵麗蝶蘭之 無香物種。(A)芳香及無香蝴蝶蘭屬物種。(B)藉由用具有在開花後第 5 天自各種花分離之 RNA 之 PbGDPS 基因特異性引子進行 RT－PCR 來偵測 PbGDPS 轉錄。(C)在開花後第 5 天在 10 小時(9 am 至 6 pm)內每次取樣期間自 3 朵花採集此花揮發性成份且藉由 GC－MS 分析。 圖 5.藉由酵母雙雜合檢測來確認形成均二聚體之 PbGDPS 蛋白。將經含有 PbGDPS 之結 合載體與活化載體共轉化之酵母菌株 AH109 於不具有白胺酸、色胺酸及組胺酸之合成極度缺 陷型(minimal Synthetic Dropout)(SD)培養基上劃線培養(a)。將相對於左側畫面中彼等者之酵 母菌株在不具有腺嘌呤、組胺酸、白胺酸及色胺酸之 SD 培養基上劃線培養(b)。1，pGBKT7 －PbGDPS ＋ pGADT7－PbGDPS；2，pGBKT7－PbGDPS ＋ pGADT7－PbGDPS；3， pGADT7－T ＋ pGBKT7－53(陽性對照物)；4，pGADT7－PbGDPS ＋ pGBKT7(陰性對照物)。 圖 6.基於植物 GDPS(a－d)、FDPS 及 GGDPS 之間的序列相似度之系統發育樹。 圖 7.3－D PbGDPS 模型結構與白芥 GGDPS 晶體結構(2J1P_A)之比較。(A)白芥 GGDPS 晶體結構。直接或經由 Mg＋ 2 與兩個受質結合之富含天冬胺酸酯之基元中之二磷酸酯接觸的 殘基。第一及第二富含天冬胺酸酯之基元分別為紫色及綠色。未與第二富含天冬胺酸酯之基 元中之二磷酸酯接觸的天冬胺酸酯殘基(D237)標記為紅色。(B)PbGDPS 之模型結構。對應於 白芥 GGDPS 中兩個常見受質結合之富含天冬胺酸酯之基元的位置為紫色及綠色。對應於白 芥 GGDPS 之 D237 之富含麩胺酸酯之區域中的殘基(E192)及對應於白芥 GGDPS 之 D98 之 E94(其遠離模型結構中之結合位點)標記為紅色。
圖 8.PbGDPS 中富含 Glu 基元突變對其催化產物之影響。(A)不同之經純化重組 PbGDPS 突變(PbGDPS－Asp 及 PbGDPS－Ala)或野生蛋白(100 μg)之異戊烯基轉移酶活性。煮熟蛋白 係於同 一檢定中用作陰性對照物。每一點為來自三個獨立實驗之值的平均值。垂直條指示標 準誤差值。(B)藉由使用具有不同鏈長之各種異戊烯基二磷酸酯作為受質來對 PbGDPS 突變或 野生產物進行薄層層析(TLC)分析。在煮熟蛋白(色帶 1)及 PbGDPS 重組突變蛋白(色帶 2)與[4 －14 C]IPP、DMADP、GDP 及 FDP 一起培育後，將反應產物去磷酸化，藉由 TLC 檢定且隨 後自動放射照相。"Or"係指起源位點及由可靠標準物(包括香葉醇(GOH，Rf ＝ 7.5 cm)、法呢 醇(FOH，Rf ＝ 9 cm)及香葉基香葉醇(GGOH，Rf ＝ 9.6 cm))鑑別之香葉醇。獨立地將該實驗 重複三次。
