肆、討論
一、台灣地區不同族群 SCA8 基因 CTG 重複之遺傳資料庫
本研究中發現無論在台灣地區哪種族群，SCA8 基因 3'端 CTG 三 核 苷 酸 重 複 的 次 數 皆 以 18 次 為 出 現 最 多 的 對 偶 基 因 頻 率
(19.4~27.3%)；而第二常見之重複次數則多為 24 次，在正常人、失智 症患者、帕金森氏症患者及其他神經疾病患者族群所佔比例分別為
14.4、14.5、10.6、15.9%，但在運動失調症患者族群比例僅為 2.8%，
此可能因樣品數目太少導致的誤差(表二)。
我們發現有八個擴增的對偶基因：包括一位正常人(85 次重複)、
三位PD患者(66，87，87 次重複)、一位泛發性路易體疾病患者(97 次 重複)、一位肌張力異常症患者(70 次重複)以及兩位SCA患者(88 及
95~185 次重複) (表三)。除在失智症族群中未觀察到擴增的現象，其 他族群則皆有出現擴增的對偶基因。在正常人族群出現的擴增來自一 位 63 歲的男性，帶有(CTG)85的對偶基因較為特別；由於SCA8 的致 病機轉目前仍尚未明確，國外也有出現擁有擴增片段卻未發病的例 子，但我們亦不排除此男性可能發病的機率。
由淋巴細胞株中萃取的 DNA，經 PCR 放大包括 SCA8 基因 3'端
CTG 片段的研究中，我們在 SCA 患者 4998、1150、4999、3183 樣品 觀察到 CTG 重複不穩定之現象(圖六 A)，即有多種重複序列出現。和 在另外一個由於 3'UTR CTG 擴增所造成的疾病—第一型肌強直萎縮 症(myotonic dystrophy type 1；DM1)的淋巴細胞株培養實驗，觀察到 相同的現象(Hashem et al., 2004)。
二、淋巴細胞中 SCA8、KLHL1 基因的表現
初步 RT-PCR 分析顯示 SCA8 和 KLHL1 在淋巴細胞中皆有表現 (圖四 D、E)，和之前認為 SCA8 基因為腦部專一表現(Benzow and Koob, 2002; Nemes et al., 2000)有所差異。進一步的同步定量 PCR (real-time PCR)實驗，應可偵測出此兩基因在各淋巴細胞中的相對表現量。由 於 SCA8 和 KLHL1 在淋巴細胞中有表現，故進一步將淋巴細胞株運 用在氧化壓力的實驗上。
三、外遺傳研究(epigenetic studies)
(一)Methylation specific PCR assay (MSP)
在 MSP 的實驗中，初步利用 DNA 來自淋巴細胞株或血液樣品，
分別進行實驗；在同一人的樣品中(淋巴細胞株 3183，血液樣品
H1173)，我們觀察到的 U-PCR 和 M-PCR 並未出現不同的結果(表 四)，故推論我們所觀察區域之甲基化情形未受到 Epstein-Barr virus (EBV)的感染，而有所改變。
經過初步觀察，發現大部分的樣品都可觀察到兩組 PCR 產物的 出現，顯示在同一區域偵測到甲基化與未甲基化的現象，但各樣品甲 基化程度不盡相同(data not shown)，此甲基化是否調節 SCA8 基因的 表現則有待觀察。利用包含 CTG 三核苷酸重複片段的引子的 RT-PCR 分析顯示，大部分異基因型者僅表現其中一個等位基因(data not shown)。
(二)Restriction enzyme based-methylation assay (RE-PCR)
在同一樣品經過三種處理後的 DNA 檢查圖(圖五 A)，我們可以 看出經過不會受 CpG 甲基化影響的酵素 MspI 處理的 DNA，的確有 較完全切割的現象；而只經切割緩衝液的處理的 DNA，則未觀察到 明顯的 DNA 片段變化的現象；而經過會受 CpG 甲基化影響的酵素 HpaII 處理的 DNA，切割結果則為於兩者之間。
將 DNA 進行 SCA8-UMO 的 PCR 反應後，我們可以觀察到三者 有不一樣的情況出現(圖五 B~E)；以實驗組(H)和不經切割的 DNA (T) 比較，我們利用定量軟體，偵測兩者之間的差異，用以反映在原始
DNA 上所存在的甲基化的程度。如表五所示，不同的樣品間，的確 存在有不同甲基化程度的現象，但此甲基化程度的差別，和 SCA8 基 因 CTG 重複擴增並沒有絕對相關性。
四、淋巴細胞株的氧化壓力研究
正常人及 SCA8 基因 CTG 重複擴增患者的淋巴細胞株經過 100
µM TBH 處理後，WST-1 細胞增生檢測顯示細胞存活率顯著下降，但 下降的幅度在正常人及患者間未達顯著性(圖七)。
在 Trypan blue 排除試驗部分，各細胞株在未經 TBH 處理的組別 即可看見不同的死亡率，推論各細胞株培養於不含胎牛血清的培養液 時，可能產生了些許不同程度的生存壓力。TBH 處理後的死亡率，
經過標準化後在正常人細胞株中，1908、2105 死亡率較 1729 低，即 1729 對氧化壓力較敏感，推論可能與提供淋巴細胞建立細胞株的個 體的年齡有關(相較於 1908、2105 來自 62、63 歲，1729 來自 70 歲的
正常人)。三位患者細胞株 4999、844、3183 間，3183 對氧化壓力非 常敏感，但此處抗氧化壓力和年齡(86、60、62 歲)或 SCA8 基因 CTG 重複擴增次數(88、92、84 次重複)並未呈現明顯的關連性(圖八)。
在 Superoxide dismutase 試 驗 部 分 ， 各 細 胞 株 的 superoxide
dismutase 活性雖然在 TBH 處理前後都很高(89.8%以上 inhibition)，但 經過標準化後，可以看出在正常人細胞株 1908 在 TBH 處理後，
superoxide dismutase 抑制 formazan dye 生成的活性有顯著的上升，細 胞株 1729 則為些微的上升，細胞株 2105 則是極些微的下降，故推論 氧化壓力可誘導正常人淋巴細胞的 superoxide dismutase 活性上升。相 對而言，SCA8 基因 CTG 重複擴增患者細胞株的 superoxide dismutase 活性，在經過 TBH 處理後並未明顯上升而是些微降低或不變，推論 患者淋巴細胞在面對氧化壓力時相對的失去了誘導的能力(圖九)。
在 TBH 造成氧化壓力的情況下，雖然正常人淋巴細胞之
superoxide dismutase 活性會受到誘導而提升，但正常人細胞株以及 SCA8 基因 CTG 重複擴增患者細胞株的存活率、死亡率卻只有些許的 不同，因此推論 SCA8 基因 CTG 重複擴增，對正常人及擴增患者細 胞株的存活率、死亡率，沒有直接的關係。
