列為「藥中四維」之一「夫人參、熟地、附子、
大黃，實乃藥中之四維……人參、熟地者，治世 之良相也；附子、大黃者，亂世之良將也。」，
在清代名醫陸懋修也有「藥之能起死回生者，惟 有石膏、大黃、附子、人參。」的說法。大黃所 含的emodin是現在醫藥研究的藥效成分，有抗冠 狀病毒的功效(1)，而大黃萃取物也有抗肝炎病毒
的功效(2-4)。
以基因層面為根據，鑑定藥用植物的研究，
近年來蔚為風行，應用各種分子技術的鑑定方法 應運而生，而其中PCR與DNA定序方法為最主要 工具，藉由分析特定DNA標記的DNA序列鑑別 藥材，在植物藥材中最常用的即為ITS (internal transcribed spacer)(5)，本研究即以PCR與DNA定序 方法衍申的Nested PCR與DNA定序方法為研究方 法，並選擇以ITS序列為鑑定依據，藉此建立大黃 藥材與製劑的鑑定方法，期能應用於中藥檢驗及 中藥典修正時的參考依據。
前 言
中華中藥典記載大黃為蓼科Polygonaceae植 物北大黃(掌葉大黃) Rheum palmatum L.、南大黃 (藥用大黃) Rheum officinale Baillon或其同屬別種 植物去外皮之乾燥根莖，明訂大黃同屬植物可以 入藥，而在中華人民共和國藥典記載僅有掌葉大 黃、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim et Balf) 及藥用大黃三種為正確基原。掌葉大黃與唐古特 大黃主產甘肅、青海、西藏、四川等地，主要為 栽培；藥用大黃主產四川、貴州、雲南、湖北、
陝西等省，栽培或野生。
大黃最早見於《神農本草經》草部下品，歷 代本草典籍如新修本草、本草拾遺、本草綱目、
本草備要等等均有收載。《神農本草經》記載
「大黃味苦寒，主下瘀血、血閉、寒熱、破癥 瘕、積聚、留飲、宿食、蕩滌腸胃、推陳致新、
通利水榖、調中化食、安和五藏。」，大黃在中 藥裡是相當重要的藥材，明代名醫張景岳把大黃
利用 Nested PCR-DNA定序方法鑑定大黃藥材及其製劑成分
呂康祖 徐曉玫 李蕙君 劉芳淑 羅吉方 林哲輝
第三組摘 要
大黃藥材歷來使用基原混亂，不乏Rheum同屬植物入藥情形，本研究即在建立大黃藥 材及製劑的Nested PCR與DNA定序鑑別方法。本局中藥標本室存有購自大陸原產地且經 鑑定及GPS定位之三種大黃標準藥材：掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)及藥用大黃(Rheum officinale Baill.)，抽取這些標準藥材之DNA，
經PCR擴增作為DNA標記的ITS (internal transcribed spacer)，並加以定序後，作為標準序 列，用以比對鑑定檢體大黃基原，並依標準序列設計引子，以偵測檢體中之大黃成份。20 件大黃製劑檢體中可檢出12件含R. officinale、2件R. tanguticum與4件Rheum palmatum 與2件 非R. officinale、R. tanguticum、Rheum palmatum之大黃品種，12件以外觀性狀及組織鏡檢不 易鑑別的藥材檢體，以本研究方法鑑定為10件R. officinale及2件R. tanguticum。
關鍵詞：大黃、Nested PCR、DNA定序、鑑定
材料與方法
一、材料㈠檢體
1. 藥材：共15件，包括掌業大黃、唐古特大 黃及藥用大黃標準品共3件，購自藥技中 心，保存於本局中藥材標本室，標本編號 依序是A1504、A1505及B1505，12件品質 監測計畫採購藥材。
2. 製劑：共20件，為20件複方製劑(包含6種 方劑)。
㈡試藥
1. 一般化學藥品：購自Sigma (Sigma, St.
Louis, MO, U.S.A.)、Merck (Merck, Darmstadt, Germany)、Amresco (Ohio,U.
S.A.)。
2. PCR純化套組：GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit購自GE Healthcare (Buckinghamshire, UK)。
3. DNA聚合反應試劑：PCR Master Mix 5X (Taq polymerase 1.25 U，dNTP 200 µM，
reaction buffer)購自GeneMark (Bio Basic, Canada)。
4. 引子：購自百力(臺灣)，PCR時用RpFb (5’- GCGGATTATGCCAAGGACTA -3’)、
RpRb(5’- GTCACAACGGTGGTCGAG -3’, Y=T/C)，Nested PCR用RpF1(5’- G A A C A A G A G Y G T G T C C C A - 3 ’ ) 及 RpR2(5’- GAGACAMGATGCGATGCT -3’, M=C/A)。
5. 瓊 脂 膠 體 ： A g a r o s e B L ow E E O 購 自 GeneMark (Bç Basic, Canada)。
6. 100 bps ladder marker及6倍載入膠片緩衝 液：GeneMark (Bç Basic, Canada)。
7. ExoSAP-IT：購自USB (Cleveland, Ohio, U.S.A.)。
8. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit：購自ABI Prism (Foster, U.S.A.)。
㈢器材
1. 迷你電泳槽及鑄膠器(Mupid II, Cosmo Bio,
Chuo-Ku, Tokyo, Japan)。
2. 聚合酶連鎖反應器(Gradient Palm-cycler, Corbett Research Co., Australia and Astec PC320, Astec株式會社, Japan)。
3. 影像系統(ImageQuant 300, GE Healthcare, UK)。
4. DNA自動定序儀(ABI 3730, U.S.A.)。
二、方法
㈠DNA萃取與純化
DNA萃取與純化方法是依照本局已發表的 論文“Identification of Saposhinkoviae Radix in Concentrated Chinese Medicine Preparations by Nested PCR and DNA Sequencing Methods”(6) 的方法進行，將檢體藥材及製劑檢體磨碎或 切碎，稱取100 mg置於2 mL微量離心管中 搗碎，加入1 mL之lysis buffer (100 mM Tris- HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% N-lauroyl sarcosine sodium salt, and 1 mg/mL proteinase K)，56ºC 水浴1小時。加入與溶液等體積之 phenol：chloroform： isoamyl alcohol (25 : 24 : 1; v/v/v)，混合萃取，以12000 × g離心5分 鐘。離心後取水層，加入65ºC預熱的CTAB- NaCl溶液(10% hexadecyltrimethylammonium bromide in 0.7 M NaCl)，使CTAB濃度大於 1%，加入NaCl溶液使濃度大於0.7 M，混 合後置於65ºC水浴15分鐘，加入等體積之 chloroform：isoamyl alcohol (24 : 1; v/v)，混 合萃取，以12000 × g離心5分鐘。離心後取 水層，加入0.7倍體積之isopropanol及1/10倍 體積之3 M sodium acetate(aq)，以12000 × g離 心5分鐘。離心後倒去上清液，使沉澱物風乾 後，加入50 - 100 µL之無菌水溶解。以PCR 純化套組純化檢體DNA後，DNA溶液供PCR 與Nested PCR之用。
㈡PCR與Nested PCR
取3 - 5 µL DNA溶液作模板，25 µM primer RpFb、RpRb各0.5 µL進行PCR，條件為 94ºC/30 sec，58ºC/30 sec，72ºC/30 sec共30
cycles。取第一次PCR產物取1 - 2 µL作模 板，25 µM primer RpF1、RpR2各0.5 µL進行 Nested PCR，條件為94ºC/30 sec，58 ºC/30 sec，72ºC/30 sec共30 cycles。
㈢電泳與定序分析
取PCR產物5 µL，與6倍載入膠片緩衝液1 µL 混合，置入1.8 %瓊脂膠體，在電泳槽(+)極 端加入0.5 µL 10 mg/mL ethidium bromide後，
進行電泳，電泳條件100 V、30分鐘，以影 像系統觀察，確認PCR結果，並拍攝影像。
PCR結果確認後，取5 µL PCR產物加入2 µL ExoSAP-IT 37ºC 反應15 min，除去多餘的 dNTP，再於85ºC 反應15 min，將ExoSAP-IT 中酵素去活性化。取反應後的混合物1 µL，
以BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI Prism, Foster, U.S.A.)進行定序反應，
再由ABI 3730自動定序儀進行定序，將定序 結果與大黃標準藥材序列進行序列比對，得 到鑑定結果。
結果與討論
大黃目前本局有3件標準品，分別是掌葉大黃 Rheum palmatum、唐古特大黃Rheum tanguticum、
藥用大黃Rheum officinale，大黃在GenBank上並 沒有ITS的序列資料，所以必須先取得標準品藥材 的ITS序列，利用18F1、28R的普遍性引子PCR及 定序，定序序列常有干擾的情形，經過反覆試驗 及分析干擾序列，設計出一組引子可供大黃藥材 及製劑檢體Nested PCR之用，但產物片段較短，
僅386 bps大小，但足可供區分各種大黃基原，
Nested PCR產物電泳結果如圖一所示，將Nested PCR產物定序分析，得到的序列可歸納成五種，
包括3種標準品與製劑檢體Rp1C、Rp5A，序列列 示於圖二。
將檢體序列分析的結果與標準品的序列進行 比對，並將比對結果與標準品的序列差異分別列 示於表一、表二，由檢體與標準品序列的差異位 置可以看出，序列差異會出現在某幾個固定位置 上，但是同一種的大黃基本序列是固定的，這 可能顯示大黃品種間的交配情形頻繁，所以雖
然為同一種(species)大黃，外表型會產生有些許 差異，而被認為是另一種大黃。另外製劑檢體 Rp1C、Rp5A序列與標準品序列相差較大，無法 逕予鑑定為標準品同種之大黃，但與標準品序列 仍有約95 %相似性左右，應為同屬植物。
12件品質監測計畫採購大黃藥材鑑定結果整 理列示於表一，這些檢體因為利用外觀性狀及 組織鏡檢不易鑑別，故而採用本研究方法加以 區分，結果顯示這些大黃檢體，鑑別結果多數 是藥用大黃，12件中有10件之多，由表一結果來 看，鑑定為藥用大黃的檢體ITS序列，DNA序列 上在固定的幾個位置上，會有相當多不同的變異 組合，在表二製劑檢體檢出藥用大黃的DNA序 列上，也有相同的情形，這或許對應著這些檢體 的外觀性狀的差異或特徵的不明顯，使得應用外 觀性狀及組織鏡檢方法，不易確認檢體為何種大 黃。
大黃製劑的鑑定結果列示於表二，20件檢 體中，12件檢出Rheum officinale , 2件檢出Rheum tangquticum, 4件Rheum palmatum, 2件不屬於上 圖一、大黃藥材及製劑Nested PCR 產物電泳
Lane 1: 100 bps ladder marker, Lane 2: 掌葉大黃 A-1-5-04 Lane 3: 唐古特大黃 A-1-5-05, Lane 4: 藥用大黃 B-1-5-05 Lane 5: 大黃藥材 Rp16, Lane 6: 大黃製劑 Rp1B Lane 7: 大黃製劑 Rp5G, Lane 8: blank (no template)
1 2 3 4 5 6 7 8
1 60 Rheum palmatum GAACAAGAGTGTGTCCCATACACCTCGGCGCGCGTGCAATGTCGCATCATTTCTACTTAA Rheum tanguticum ---C---A---G-G---G-A-TG-C---A--- Rheum officinale ---C---G---A-G---G-G-CA-T---G--- Rp1C ---C---A---G-A---G-A-TG-C---A--- Rp5A ---C---G---G-G---T-A-CG-C---G--- 61 120 Rheum palmatum TAGAATGACACTCGGAAATGGATATCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCRAAAT Rheum tanguticum C----T---A---C---G---- Rheum officinale C----T---T---C---G---- Rp1C C----T---A---C---G---- Rp5A C----C---T---C---G---- 121 180 Rheum palmatum GCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCACGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGC Rheum tanguticum ---CA---C Rheum officinale ---TG---T Rp1C ---CG---C Rp5A ---TG---C 181 240 Rheum palmatum GCCCGAAGCCTTCTGGCCGAGGGCACGTCTGTCTGRGCATCACGCACCTTATCGCCCATG Rheum tanguticum ---G---C--G---C---C---- Rheum officinale ---G---C--G---T---A---- Rp1C ---A---C--G---C---C---- Rp5A ---G---T--G---C---C---- 241 300 Rheum palmatum CCCCCTCCGGGGGGCCGAGGCAGAGACTGGCCTCCCGTGCGCCTCGGCGCACTGCCGGCC Rheum tanguticum ---G---A---C-G----C---G-C----TA--- Rheum officinale ---C---A---C-A----T---G-T----GA--- Rp1C ---C---A---C-G----C---A-C----TG--- Rp5A ---C---G---T-G----C---G-C----GA--- 301 360 Rheum palmatum TAAACGCARGCCCCACGGCCACAAGAAGCCGCAACGATTGGTGGTGTACCAGCGGCCTCG Rheum tanguticum ---C-G---C-A-G--Y--G---G--- Rheum officinale ---C-G---C-G-C--C--C---G--- Rp1C ---C-G---C-A-G--C--A---A--- Rp5A ---T-G---T-G-A--C--G---G--- 361 386
Rheum palmatum TCCCGTGAAGCATCGCATCGTGTCTC Rheum tanguticum ---C---T--- Rheum officinale ---M---C--- Rp1C ---C---T--- Rp5A ---C---T--- 圖二、 3 種大黃標準品與製劑檢體RP1C、Rp5A 序列
「-」代表與上方序列相同，Y = C/T、R = A/G、M = C/A
表二、大黃製劑檢體表、鑑定結果及與標準品序列差異
編號 製劑名稱 鑑定 序列
差異數 序列差異位置
Rp1B 乙字湯 Rheum tanguticum 3 152(G)*, 255(C), 294(G)
Rp1C 乙字湯 非3種標準品 - -
Rp1E 乙字湯 Rheum officinale 0 無
Rp1F 乙字湯 Rheum palmatum 1 61(C)
Rp2B 八味帶下方 Rheum officinale 1 66(C)
Rp2C 八味帶下方 Rheum officinale 0 無
Rp2E 八味帶下方 Rheum palmatum 4 29(T), 61(C), 183(A), 286(A) Rp2F 八味帶下方 Rheum officinale 4 66(C), 171(T), 219(G), 335(T)
Rp3B 大柴胡湯 Rheum officinale 3 66(C), 97(T), 219(G)
Rp3C 大柴胡湯 Rheum officinale 5 30(G), 66(C), 197(A), 219(G), 223(C)
Rp3E 大柴胡湯 Rheum palmatum 1 61(C)
Rp3F 大柴胡湯 Rheum officinale 5 30(G), 66(C), 219(G), 223(T), 281(A)
Rp4B 大承氣湯 Rheum officinale 1 66(C)
Rp4C 大承氣湯 Rheum officinale 1 340(A)
Rp5A 消痔丸 非3種標準品 - -
Rp5G 消痔丸(丸劑) Rheum officinale 2 66(C), 219(G)
Rp6A 麻子仁丸 Rheum tanguticum 2 152(G), 255(C)
Rp6B 麻子仁丸 Rheum officinale 2 66(C), 219(G)
Rp6C 麻子仁丸 Rheum officinale 2 30(G), 223(C)
Rp6F 麻子仁丸 Rheum palmatum 1 61(C)
*：( )內為標準品序列在該DNA序列位置取代的鹽基
表一、品質監測計畫採購大黃藥材檢體表、鑑定結果及與標準品序列差異
編號 鑑定 序列差異數 序列差異位置
Rp1 Rheum officinale 4 66(C)*, 213(T), 219(G), 241(-)**
Rp2 Rheum officinale 3 66(C), 219(G), 223(C)
Rp3 Rheum officinale 4 66(C), 213(T), 219(G), 241(-)
Rp4 Rheum tanguticum 4 152(G), 248(T), 255(C), 294(G)
Rp5 Rheum officinale 4 66(C), 213(T), 219(G), 241(-)
Rp6 Rheum officinale 3 66(C), 219(G), 316(T)
Rp7 Rheum tanguticum 5 112(C), 152(G), 248(T), 255(C), 294(G)
Rp8 Rheum officinale 4 66(C), 171(T), 219(G), 335(T)
Rp9 Rheum officinale 3 66(C), 219(G), 223(C)
Rp10 Rheum officinale 4 66(C), 197(A), 219(G), 223(C)
Rp16 Rheum officinale 5 66(C), 213(T), 219(G), 241(-), 335(T)
Rp27 Rheum officinale 3 30(G), 66(C), 223(C)
*：( )內為標準品序列在該DNA序列位置取代的鹽基
**：「-」表示為gap
述3種標準品之大黃。製劑鑑定的結果，以藥用 大黃入藥的為多，中華中藥典上記載「本品為蓼 科Polygonaceae植物北大黃Rheum palmatum L.、
南大黃Rheum officinale Baillon或其同屬別種植物 去外皮之乾燥根莖。」，而中華人民共和國藥典 中，大黃的基原為掌葉大黃Rheum palmatum L.、
唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或藥 用大黃Rheum officinale Baill.的乾燥根及根莖，與 研究結果也大抵相符，但是仍有2件製劑檢體檢出 不屬於上述3種標準品的大黃成分，因中華中藥 典規定同屬植物也可使用，就不致於成為誤用藥 材，但是由此可見大黃藥材使用基原混亂，同屬 植物畢竟成份有差異，以柴胡為例，同屬的大葉 柴胡就含有毒性，以同屬植物也可入藥的情形，
將無法確保一定藥效與安全性，建議可由DNA序 列鑑定入手，將可使用的大黃作一規範，使得大 黃用藥有所依循。
結 論
Nested PCR與DNA定序方法可用於難以鑑別 的大黃藥材與中藥製劑中所使用的大黃，如付諸 實行，對於中藥的品管將極有幫助，而本研究方 法可精確鑑定藥材的物種，對於藥典制定時藥材 基原的認定，將可以此作為參考依據。
參考文獻
Ho, T. Y., Wu, S. L., Chen, J. C., Li, C. C. and Hsiang, C. Y. 2007. Emodin blocks the SARS coronavirus spike protein and angiotensin-con- verting enzyme 2 interaction. Antiviral Res. 74(2):
92-101.
Li, Z., Li, L. J., Sun, Y. and Li, J. 2007. Identifica- tion of natural compounds with anti-hepatitis B virus activity from Rheum palmatum L. ethanol extract. Chemotherapy. 53(5): 320-6.
Hsiang, C. Y., Hsieh, C. L., Wu, S. L., Lai, I.L.
and Ho, T. Y. 2001. Inhibitory effect of anti-py- retic and anti-inflammatory herbs on herpes sim- plex virus replication. Am J. Chin Med. 29(3-4):
459-67.
Wang, Z., Wang, G., Xu, H. and Wang, P. 1996.
Anti-herpes virus action of ethanol-extract from the root and rhizome of Rheum officinale Baill.
Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 21(6): 364-6, 384.
Nikolaus, J. S. and Maria, C. C. 2008. Genome- based approaches to the authentication of medicinal plants. Planta Med. 74: 603-623.
Lu, K. T., Lo, C. F., Chang, H. C. and Lin, J. H.
2005. Identification of Saposhinkoviae Radix in concentrated Chinese medicine preparations by nested PCR and DNA sequencing methods. J.
Food and Drug Analysis 13: 219-224.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Identification of Rhei Radix et Rhizoma and Its Preparations by Nested PCR and DNA Sequencing
Methods
KANG-TSU LU, HSIAO-MEI HSU, HUI-CHUN LEE, FANG-SU LIU, CHI-FANG LO AND JER-HUEI LIN
Pharmacognosy Divisçn
ABSTRACT
Many Rheum species are used as Rhei Radix et Rhizoma. This study applied Nested PCR and DNA sequencing methods to identify which Rheum specie is present in the preparations of Chinese medicine. Three kinds of standard raw materials including Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. and Rheum officinale Baill. were deposited in our specimen room. The standard raw materials were authenticated and purchased from source area orientated by global positioning system. ITS (internal transcribed spacer) of the extracted DNA from standard raw materials was amplified by PCR, and then analyzed by auto DNA sequencer to obtain the standard sequences. One set of primers based on the standard sequences, was thus designed to identify Rhei Radix et Rhizoma components. Sequence data of samples were compared with the standard sequences to confirm the Rheum species in the preparation. The results showed that 12 in 20 samples of preparation contained R. officinale, two contained R. tanguticum and four contained R. palmatum. Two contained Rheum species which are not R. palmatum, R. tanguticum or R. officinale. Twelve raw material samples could not be authenticated with the morphology and microscopy. The proposed method could be applied to identify these samples of raw material as that 10 samples are R. officinale and two are R. tanguticum.
Keywords: Rhei Radix et Rhizoma, ITS, nested PCR, DNA sequencing
