細柱五加萃取物在現代醫學研究上，有抑制 癌細胞內酶的作用，使癌細胞無法增生(1,2)，而其 所含之saponin有抑制血小板凝集的效果(3)，並可 以抗發炎(4)，此外，五加皮還具有免疫調節的作 用，可調控許多細胞激素的分泌，未來可廣泛應 用於治療慢性機能退化、過敏及自體免疫等疾病
(5,6)。
目前流通使用的五加皮藥材，有以香加皮 誤用的情形。香加皮為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium的根皮，又稱北五加。香加皮能強心、利 尿、止痛，但有毒性，不可過量和長期服用，以 防蓄積中毒。
香加皮在早期本草中均無此名稱，直到《救 荒本草》中才收載，後根據考證，確認此植物即 為杠柳，主要產於河北、山東、山西、陜西及甘 肅等省。現今科學研究發現，香加皮具有抗腫瘤
(7)及免疫調節的作用，其活性成分為Periplocoside E （北五加皮苷E）(8,9)，但是由於香加皮具有 periplocin（杠柳毒苷）的毒性成分(10)，與五加皮 二者不可混用，1977年版的《中國藥典》已將二
前 言
五加皮藥材始載於《神農本草經》，列為上 品，歷代本草均有記載，味微苦、辛、性溫，有 去風濕、補肝腎、強筋骨的功效，用於風濕痹 痛、筋骨痿軟、體虛乏力、水腫、腳氣。其基原 植物為五加科植物細柱五加，別名五葉路刺、
白刺尖、五葉木、五加，灌木，高2-3公尺，枝 灰棕色，下垂，蔓生狀，無毛，葉上常疏生反曲 扁刺，夏秋季採挖根部，洗淨剝取根皮，晒乾使 用，外表面有稍扭曲的縱皺紋及橫向皮孔，以皮 厚、氣香、斷面灰白色者為佳。細柱五加主產於 湖北、河南、安徽。
細柱五加主要化學成分是苷類，其中紫丁香 苷及紫丁香樹脂酚葡萄糖苷是主要有效成分，具 有與人蔘皂苷相似的生理活性。在製劑的應用 上，《沉氏尊生》五加皮散用於風濕痺痛，四肢 拘攣。《保嬰攝要》五加皮散，用於肝腎不足，
腰膝軟弱及小兒行遲等。五皮飲用於水腫、小便 不利。
利用 Nested PCR與DNA定序方法鑑定 中藥製劑中五加皮藥材成分
呂康祖 鄭涵云 羅吉方 張憲昌 林哲輝
第三組摘 要
五加皮藥材為五加科落葉小灌木細柱五加Eleutherococcus gracilistylus的根皮，市售藥 材常有以香加皮，即蘿摩科植物杠柳Periploca sepium的根皮誤用的情形。本次研究目的 即在鑑別藥材及製劑中五加皮及其誤用情形。收集市售五加皮藥材及其製劑並抽取檢體 DNA，以標準藥材的DNA序列設計引子，Nested PCR-DNA定序方法進行鑑定。5件五加皮 藥材檢體其DNA序列與標準藥材相同，均確認為正品，但序列與GenBank上Eleutherococcus koreanus之序列僅有1個鹼基的差異，而與Eleutherococcus gracilistylus有2個鹼基的差異。而 5件五加皮中藥製劑中，檢出所含之五加皮成分皆是以香加皮替代使用。
關鍵字：五加皮、香加皮、Nested PCR、DNA定序、鑑定
者明確分開，但是，目前大部分地區並未依照藥 典來區分使用，以香加皮當五加皮使用的情形仍 很普遍，對此狀況，應該建立有效的藥材及其製 劑鑑定方法，使之可以更明確加以區分藥材混用 的狀況。
本研究以本組已發表的論文Identification of Saposhinkoviae Radix in Concentrated Chinese Med- icine Preparations by nested PCR and DNA Sequenc- ing Methods(11)的研究方法為基礎，以PCR擴增 的DNA片段為植物核醣體基因的ITS（internal transcribed spacer）序列作為鑑別標記，對五加 皮及香加皮分別建立鑑定方法，使能有更正確靈 敏的檢驗方法，作為中藥材、中藥製劑管理的依 據。
材料與方法
一、材料：㈠檢體
1. 藥材：共9件，五加皮6件，包括購自製藥 技術中心的標準品1件，市售及查驗登記藥 材5件，香加皮市售藥材3件。
2. 製劑：共5件，單方製劑檢體3件、複方製 劑檢體2件。
㈡試藥
1. 一般化學藥品：購自Sigma（Sigma, St.
Louis, MO, U.S.A.）、Merck （Merck, Darmstadt, Germany）、Amresco（Ohio, U.S.A.）
2. PCR純化套組：QIAquick PCR purification kit（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）
3. DNA聚合反應試劑： PCR Master Mix 5X
（Taq polymerase 1.25U，dNTP 200 µM，
reaction buffer）購自GENEMARK（Bio Basic, Canada）
4. 引 子 ： 購 自 百 力 （ 臺 灣 ） ， 確 認 標 準 品 序 列 時 以 普 遍 性 引 子 （ u n i v e r s a l primer）18F1（5’-GTGA ACCTGCG GAAGGATC-3’）、28R（5’-CCGCCTG AC C T G R G G T C - 3 ’ , R = A / G ） 。 鑑 別
五 加 皮 時 P C R 用 E g F n （ 5 ’ - G A G G A TCATTGTCGAAACCTG-3’）、EgRn
（5’-GGAGTGCTCGTCGAGGAC-3’），
Nested PCR用EgF2（5’-GCGAACAC GTTATACCG-3’）、EgR2（5’- ACAA CAGGGTCACATG AGCT-3’）。鑑別香 加皮時PCR用PsF（5’-AGG ATCATTGTC GAATCCTAC-3’）、PsR（5’-GCGATC G T G AC G A AY G C - 3 ’ ） ， N e s t e d P C R 用 P s F 1 （ 5 ’ - A AG TA A AT G AC C AG T G A AC G - 3 ’ ） 、 P s R 1 （ 5 ’ - C T C C AT T GGGAACGA GATC-3’）
5. 瓊脂膠體：Agarose B Low EEO購自GEN- EMARK（Bio Basic, Canada）
6. 100 bp ladder marker及6倍載入膠片緩衝 液：GENEMARK（Bio Basic, Canada）
㈢器材
1. 迷你電泳槽及鑄膠器（Mupid II, Cosmo Bio, Chuo-Ku, Tokyo, Japan）
2. 聚合酶連鎖反應器（Gradient Palm-cycler, Corbett Research Co., Australia and Astec PC320, Astec株式會社, Japan）
3. 影像系統（ImageQuant 300, GE Healthcare, UK）
二、方法
㈠DNA萃取與純化
將檢體藥材及製劑檢體磨碎或切碎，稱取 100 mg置於2 mL微量離心管中搗碎，加入1 mL之lysis buffer（100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% N-lauroyl sarcosine sodium salt, and 1 mg/mL proteinase K），56℃水浴1 小時。加入與溶液等體積之phenol：chloro- form：isoamyl alcohol（25：24：1; v/v/v），
混合萃取，以12000 x g離心5分鐘。離心後 取水層，加入65℃預熱的CTAB-NaCl溶液
（10% hexadecyltrimethylammonium bromide in 0.7 M NaCl），使CTAB濃度大於1%，加 入NaCl溶液使濃度大於0.7 M，混合後置於
65℃水浴15分鐘，加入等體積之chloroform：
isoamyl alcohol（24：1; v/v），混合萃取，
以12000 x g離心5分鐘。離心後取水層，加 入0.7倍體積之isopropanol及1/10倍體積之3 M sodium acetate(aq)，以12000 x g離心5分鐘。
離心後倒去上清液，使沉澱物風乾後，加入 50-100 µL之無菌水溶解。以PCR純化套組 純化檢體DNA後，DNA溶液供PCR與nested PCR之用。
㈡PCR與nested PCR
標準藥材以2 µL DNA溶液作模板，25 µM primer 18F1、28R各0.5 µL進行PCR，條件 為94℃/30sec，58℃/30sec，72℃/30sec共40 cycles。藥材測試是否為五加皮成分時，取 2 µL DNA溶液作模板，25 µM primer EgFn、
EgRn 各0.5 µL進行PCR，條件為94℃/30sec，
61℃/30sec，72℃/30sec共30 cycles。測試是 否為香加皮藥材時，取2 µL DNA溶液作模 板，25 µM primer PsF、PsR 各0.5 µL進行一 次PCR，條件為94℃/30sec，61℃/30sec，
72℃/30sec共30 cycles。測試製劑中五加皮成 分，取0.5 µL DNA溶液作模板，25 µM primer EgFn、EgRn 各0.5 µL進行第一次PCR，條 件為94℃/30sec，61℃/30sec，72℃/30sec共 25 cycles。取第一次PCR產物取0.5 µL作模 板，primer EgF2、EgR2 各0.5 µL進行Nested PCR，PCR條件為94℃/30sec，59℃/30sec，
72℃/30sec共25 cycles。測試製劑香五加成 分，取0.5 µL DNA溶液作模板，25 µM primer PsF、PsR 各0.5 µL進行第一次PCR，條件 為94℃/30sec，57℃/30sec，72℃/30sec共 25 cycles。取第一次PCR產物取0.5 µL作模 板，primer PsF1、PsR1 各0.5 µL進行Nested PCR，PCR條件為94℃/30sec，55℃/30sec，
72℃/30sec共25 cycles。
㈢電泳與定序分析
取PCR產物5 µL，與6倍載入膠片緩衝液1 µL 混合，置入1.8%瓊脂膠體，在電泳槽（+）
極端加入0.5 µL 10 mg/mL ethidium bromide 後，進行電泳，電泳條件100 V、30分鐘，
以影像系統觀察，確認PCR結果，並拍攝影 像。PCR結果確認後，委託明欣（台北，台 灣）進行DNA定序，將定序結果與美國國家 衛生院之GenBank資料庫及標準藥材序列進 行序列比對，得到鑑定結果。
結果與討論
五加皮正品基原為五加科的細柱五加Eleu- therococcus gracilistylus，由廠商查驗登記送驗之 藥材發現常有以香加皮誤用的情形，而香加皮 為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium的根皮，有毒 性，必需謹慎使用，因此本次研究收集了6件五 加皮檢體，包括1件藥技中心的標準品，及5件市 售、查驗登記藥材檢體，另收集3件市售香加皮藥 材，而製劑檢體部分，收集到單方製劑3件，複方 製劑2件。
先將五加皮標準品抽出DNA後，以普遍性引 子18F1、28R做PCR擴增ITS片段並做定序分析，
再與GenBank資料庫比對，結果與Eleutherococ- cus koreanus 的ITS序列最相近，僅有1個鹼基的差 異，而與GenBank上E. gracilistylus（細柱五加）
序列差異2個鹼基，標準品與GenBank上E. korea- nus 及E. gracilistylus 的序列差異位置如圖一所 示。在ITS序列上若有1~2個鹼基的差異，通常是 變種植物所造成，但目前無法收集到GenBank上 E. koreanus 及E. gracilistylus DNA序列來源的植物 檢體，用以確認是否此二者為標準品藥材植物的 變種。因標準品已經鑑定確認，研究中將以標準 品的序列作為五加品標準序列，再對於另外5件五 加皮檢體DNA進行PCR與定序分析比對。研究結 果顯示，5件檢體ITS序列均與標準序列相同，確 認5件藥材檢體均為正品。至於香加皮藥材檢體部 分，亦是以普遍性引子18F1、28R做PCR及定序 分析，結果顯示3件香加皮檢體的序列相同，定序 所得序列結果如圖二所示。因GenBank資料庫並 無香加皮Periploca sepium 序列資料，且未購得香 加皮的標準品，因此將香加皮藥材檢體做外觀及 切片鑑別，確認3件均為香加皮正品，因此以藥材 檢體之ITS序列作為香加皮鑑定比對的標準序列。
就藥材檢體部分的鑑定結果，所有藥材經過PCR-
DNA定序方法確認，並未發生五加皮與香加皮混 淆的情形，這也由於五加皮藥材檢體如果外觀保 持完整，未經過炮製、磨粉等過程破壞，熟習藥 材鑑別的人員藉由物理性的外觀檢查、切片及鏡 檢等，應可區別五加皮與香加皮兩者的差異。
含有五加皮藥材的中藥方劑不多，除了單 方，以五皮飲為主，因此本研究中，僅購得製劑 檢體5件，為不同藥廠所製造的五加皮單方製劑3
件及五皮飲2件。對於製劑中五加皮及香加皮成 分的鑑定，先是以上述研究中所得的五加皮及香 加皮藥材的ITS序列為基礎，分別設計2對專一性 引子，第一次PCR使用EgFn、EgRn與PsF、PsR，
nested PCR時使用EgF2、EgR2與PsF1、PsR1，
對5件製劑檢體，分別測試是否含有五加皮或香 加皮藥材成分。所有製劑檢體在五加皮專一性引 子擴增下，均無任何片段形成，確認檢體不含五 1 AGGATCATTG TCGAATCCTA CAAAAGTAAA TGACCAGTGA ACGCGTTTCC 51 AACTTGGGGA GGTAGGCAGT AAGTTTCAAC CTTGTTGCTT GTCTCTCCTT 101 CGGTCGATTG GTGCCTTGCA CGGTTCCCAG TTGTGCCGTA TAACAAAACA 151 AAAAACCGGC GTGGGAAGCG CCAAGGACTA TGCTAAAGGA ATGCCTCCCG 201 GCGGTCCAGT CGTTCGCGAC CATGGGACGT CGGGGTCATG GCTCCATTTA 251 AATCTAAAAC GACTCTCGGC AACGGATATC TAGGCTCTCG CATCGATGAA 301 GAACGTAGCA AACTGCGATA CTTGGTGTGA ATTGCAGAAT CCCGTGAACC 351 ATCGAGTCTT TGAACGCAAG TTGCGCTTGA AGCCATTAGG CTGAGGGCAC 401 GTCTGCCTGG GCGTCACGTA ATGCGTCGCT CTCTCGCAGC TCGCCCCATA 451 CGGGACGAGT GTTGCTAATG GGGGCGGAGA ATGGCCTCCC GTGTGTAGTT 501 GCGGCTGGCC TAAATTGAAG TCCTTCATTG CGGGTGTCAC GATAAGTGGT 551 GGTTGAAAAG CTCAAGCGAG TCGTGCGCAC CATGCGATTG AGGTGATGTT 601 TTGGACCCTA AGGCGATCTC GTTCCCAATG GAGGAGCATT CGTCACGATC 651 GC
圖二、香加皮藥材檢體DNA定序所得序列（序列長度652bps）
69 五加皮標準品 ...GAACACGTTACCATACCGGGTGAGGGACGTGGGGTGCA
C
AAG...E. koreanus ...GAACACGTTACCATACCGGGTGAGGGACGTGGGGTGCA
A
AAG...E. gracilistylus ...GAACACGTTACCATACCGGGTGAGGGACGTGGGGTGCA
C
AAG...287 307
五加皮標準品 ...AATGCGAT
A
CTTGGTGTGAATTGCAGAAT
CCCGTGAACCA...E. koreanus ...AATGCGAT
A
CTTGGTGTGAATTGCAGAAT
CCCGTGAACCA...E. gracilistylus ...AATGCGAT
C
CTTGGTGTGAATTGCAGAAC
CCCGTGAACCA...圖一、 五加皮標準品（AC-1）ITS序列與GenBank 之Eleutherococcus koreanus (gi46486714)、E. gracilistylus (gi46486712)序 列差異位置，差異位置以反白表示，序列上方數字位序列位置。
加皮成分，nested PCR產物電泳結果如圖三。製 劑檢體在香加皮專一性引子擴增下有PCR產物形 成，nested PCR產物電泳結果如圖四，將nested PCR產物做定序分析，並與標準序列比對，所得 序列均與香加皮藥材檢體序列相同，顯示5件製劑 檢體均含有香加皮。綜合上述nested PCR及DNA 定序結果，將鑑定結果整合列示於表一，由表一
可看出，在製劑檢體中，均以香加皮取代五加皮 入藥，會發生這樣的情形，可能原因是五加皮取 得來源不易或缺貨，致使廠商使用香加皮作為替 代，或是廠商鑑別藥材之人員鑑別能力不足所 致，若為後者之因素，本局已陸續舉辦多次辨識 易誤用中藥材研習會，期能加強中藥廠人員對藥 材的識別能力，以減少誤用藥材發生的機會。
雖然在藥材檢體上，並未發現有五加皮與香 加皮混淆的情形，但於製劑檢體中，所有五加皮 製劑，不論單方、複方，全部使用香加皮替代五 加皮入藥，顯見雖然市售或查驗登記送驗藥材正 確，不代表製劑入藥所用的藥材也一定正確，中 藥製劑中藥材成分的正確性，亦需要有合適的檢 驗技術加以管理把關。這些製劑檢體中所含的五 加皮成分，難以用傳統的物理性的外觀檢查、切 表一、五加皮製劑鑑定結果
編號 檢體名稱 鑑定結果
EgP1 五加皮粉 Periploca sepium
EgP2 濃縮（香）五加皮 Periploca sepium
EgP3 五加皮 Periploca sepium
Eg1B 五皮飲 Periploca sepium
Eg1C 五皮飲 Periploca sepium
圖四、 利用香加皮專一性引子進行nested PCR之電泳結 果。
Lane 1: 100 bps ladder maker，Lane 2: 五加皮標準 品，Lane 3:香加皮藥材檢體， Lane 4: 單方製劑檢 體EgP1， Lane 5: 單方製劑檢體EgP2， Lane 6: 複 方製劑檢體Eg1B，Lane 7: 複方製劑檢體Eg1C，
Lane 8: blank (no template)。
圖三、 利用五加皮專一性引子進行nested PCR之電泳結 果。
Lane 1: 100 bps ladder maker，Lane 2: 五加皮標準 品，Lane 3:香加皮藥材檢體， Lane 4: 單方製劑檢 體EgP1， Lane 5: 單方製劑檢體EgP2， Lane 6: 複 方製劑檢體Eg1B，Lane 7: 複方製劑檢體Eg1C，
Lane 8: blank (no template)。
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
片及鏡檢等，若為複方製劑，化學方法的鑑定也 會發生困難，因此本研究中所使用的方法，將提 供檢驗中藥製劑成分的一種有力方法。
結 論
香加皮替代五加皮入藥的情形，將有可能使 服用中藥，卻得不到預期的藥效，本研究所建立 的五加皮與香加皮藥材與製劑的鑑定方法，能夠 靈敏與正確地鑑別五加皮製劑中所含的五加皮藥 材成分是否誤用為香加皮，將有助於中藥的管理 與本局的檢驗工作，減少市售藥品有藥材誤用情 況的發生，確保民眾用藥之效能與安全。
參考文獻
Shan, B. E., Fu, X. M., Hua, Z. X., Li, Q., Liang, W., Liu, J., Zhang, H. and Liu, G. 2005. Study on mechanism of the anti-tumor activity of Acantho- panax gracilistylus. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 25(9): 825-828.
Shan, B. E., Zeki, K., Sugiura, T., Yoshida, Y.
and Yamashita, U. 2000. Chinese medicinal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract induces cell cycle arrest of human tumor cells in vitro. Jpn J.
Cancer Res. 91(4): 383-389.
Chen, X. C., Xia, L., Hu, S. and Huang, G. 1996.
Inhibitory effects of Acanthopanax gracilistylus saponins on human platelet aggregation and plate- let factor 4 liberation in vitro. Zhongguo Yao Li Xue Bao 17(6): 523-526.
Tang, X., Ma, Y. and Li, P. 1995. Separation and identification of the anti-inflammatory diterpene from the root cortices of Acanthopanax gracili- stylus W. W. Smith. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 20(4): 231, 253.
Spelman, K., Burns, J., Nichols, D., Winters, N., 1.
2.
3.
4.
5.
Ottersberg, S. and Tenborg, M. 2006. Modulation of cytokine expression by traditional medicines: a review of herbal immunomodulators. Altern Med Rev. 11(2): 128-50.
Shan, B. E., Yoshita, Y., Sugiura, T. and Yamashi- ta, U. 1999. Suppressive effect of Chinese medici- nal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract on human lymphocytes in vitro. Clin Exp Immunol.
118(1): 41-8.
Zhu, Y. N., Zhao, W. M., Yang, Y. F., Liu, Q. F., Zhou, Y., Tian, J., Ni, J., Fu, Y. F., Zhong, X. G., Tang, W., Zhou, R., He, P. L., Li, X. Y. and Zuo, J.
P. 2006. Periplocoside E, an effective compound from Periploca sepium Bge, inhibited T cell acti- vation in vitro and in vivo. J Pharmacol Exp Ther.
316(2): 662-9.
Tokiwa, T., Harada, K., Matsumura, T. and Tuki- yama, T. 2004. Oriental medicinal herb, Periploca sepium, extract inhibits growth and IL-6 produc- tion of human synovial fibroblast-like cells. Biol Pharm Bull. 27(10): 1691-3.
Itokawa, H., Xu, J. P. and Takeya, K. 1998. Stud- ies on chemical constituents of antitumor frac- tion from Periploca sepium. V. Structures of new pregnane glycosides, periplocosides J, K, F and O.
Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 36(11): 4441-6.
Liu, H., Yang, H., Guo, J. H., Pan, G. X., Li, T. X.
and Zhang, L. J. 2006. Determination of periplo- cin in different parts of Periploca sepium. Zhong Yao Cai 29(7): 656-7.
Lu, K. T., Lo, C. F., Chang, H. C. and Lin, J. H.
2005. Identification of Saposhinkoviae Radix in Concentrated Chinese Medicine Preparations by nested PCR and DNA Sequencing Methods. J.
Food and Drug Analysis 13: 219-224.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Identification of Acanthopanacis Cortex in Chinese Medicine Preparations by Nested PCR and DNA
Sequencing Methods
KANG-TSU LU, HAN-YUN CHENG, CHI-FANG LO, HSIEN-CHANG CHANG AND JER-HUEI LIN
Pharmacognosy Division
ABSTRACT
Acanthopanacis Cortex, the dried root cortex of Eleutherococcus gracilistylus, is often adulterated with Periplocae Cortex in market. Periplocae Cortex is the dried root cortex of Periploca sepium and contains toxic chemicals. In this study, we employed the nested PCR followed by DNA sequencing to the identification of Acanthopanacis Cortex in Chinese medicinal preparations. The samples of raw material and preparations were collected from local Chinese pharmacies, and then extracted for total DNA. Two sets of nested PCR primers specific for E. gracilistylus and P. sepium were designed based on the DNA sequences of standard raw materials.
By sequences analysis, five samples of raw materials mirrored those of the standards. All five samples were identified as E. gracilistylus. One nucleotide in the sequence of E. koreanus and two in E. gracilistylus from GenBank are different from that of the standard. In five samples of preparations, integrant of Acanthopanacis Cortex was absent and all samples contained Periplocae Cortex.
Key words: Acanthopanacis Cortex, Periplocae Cortex, nested PCR, DNA sequencing, identification
