植物致病真菌的效果(1,2)，在醫學研究上，石菖蒲 有抑制黑色素形成(3)、抗癲癇(4)及抑制抗藥病菌抗 藥性(5)的效果。
因石菖蒲的藥材基原有Acorus gramineus 及Acorus tatarinowii兩種，本研究將以兩種植 物的ITS相同序列部分設計2對引子，供Nested PCR使用，擴增植物核醣體基因的ITS (internal transcribed spacer)序列作為鑑別標記，比對 GenBank上之序列資料，作為鑑定結果。研究結 果將建立中藥製劑中石菖蒲的鑑定方法，作為中 藥材、中藥製劑管理的依據。
材料與方法
一、材料㈠檢體
1. 藥材：共2件，為石菖蒲參考藥材。
2. 製劑：共12件，單方製劑檢體2件，10件複 方製劑。
㈡試藥
前 言
中華中藥典記載本品為天南星科Araceae植 物石菖蒲Acorus gramineus Soland.之乾燥根莖，
而《中華人民共和國藥典》2005版一部記載本品 為為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tata- rinowii Schott.的乾燥根莖。主產於四川、浙江、
江蘇等地。秋、冬二季採挖，除去葉、鬚根及泥 砂，曬乾或鮮用。
石 菖 蒲 藥 用 之 記 載 ， 始 見 於 《 神 農 本 草 經》，列為上品，其藥效在《本經》上記載：
「主風寒濕痺，咳逆上氣，開心孔，補五臟，明 耳目，出音聲。久服經身，不忘，不迷惑、延 年。」在《本草綱目》記載：「治中惡卒死，竄 忤癲，下血崩中，安胎漏，散癰腫。」另外在
《本草從新》上有：「辛苦而溫，芳香而散，開 心孔，利九竅，明耳目，發聲音，去濕除風，逐 痰消積，開胃寬中，療噤口毒痢。」的敘述。現 代研究上，石菖蒲萃取物可以用在農業上，有抗
利用 Nested PCR-DNA定序方法鑑定中藥製劑中 石菖蒲藥材成分
呂康祖 徐曉玫 羅吉方 林哲輝
第三組摘 要
石菖蒲藥材基原在中華中藥典記載為Acorus gramineus Soland.之乾燥根莖，而《中華人 民共和國藥典》2005版一部記載本品為Acorus tatarinowii Schott.的乾燥根莖，因此本研究 是以Acorus gramineus及Acorus tatarinowii的ITS (internal transcribed spacer)序列設計引子，
用以鑑定市售石菖蒲中藥製劑中所含石菖蒲成分。檢體以擴增ITS1-5.8S RNA- ITS2序列所 設計的引子進行Nested PCR後，無法有DNA片段形成。另重新設計引子，改以僅擴增檢體 ITS2片段，經Nested PCR之後，能夠獲得DNA片段產物，將產物定序並分析比對DNA序 列，可以獲得鑑定結果。結果顯示，12件市售石菖蒲中藥製劑檢體中，10件檢體檢出石菖 蒲成分為Acorus gramineus，1件檢出為Acorus tatarinowii，而有1件未能檢出石菖蒲成分。
關鍵詞：石菖蒲、Nested PCR、DNA定序、鑑定
1. 一般化學藥品：購自Sigma (Sigma, St.
Louis, MO, U.S.A.)、Merck (Merck, Darm- stadt, Germany)、Amresco (Ohio, U.S.A.)。
2. PCR純化套組：GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit購自GE Healthcare (Buckinghamshire, UK)。
3. DNA聚合反應試劑：PCR Master Mix 5X (Taq polymerase 1.25U，dNTP 200 µM，
reaction buffer)購自GeneMark (Bio Basic, Canada)。
4. 引子：購自百力(臺灣)，確認參考藥材序 列時以普遍性引子(universal primer) 18F1 (5’-GTGA ACCTGCGGAAGGATC-3’)、
28R (5’-CCGCCTG ACCTGRGGTC-3’, R= A/G)。擴增石菖蒲ITS2序列設計之引 子為PCR時用AgR (5'-AGGCATCCGAC- GCCRGAG-3')、AgIF1 (5'-GAGACCCAT CGGGTCGAG-3')，Nested PCR用AgR1 (5'-AGGGACTCTGCCTCTCAG-3')及 AgIF2(5'-TCA CGCCTTCCGTCGCTC-3')。
5. 瓊脂膠體：Agarose B Low EEO購自Gene Mark (Bio Basic, Canada)。
6. 100 bps ladder marker及6倍載入膠片緩衝 液：GeneMark (Bio Basic, Canada)。
㈢器材
1. 迷你電泳槽及鑄膠器(Mupid II, Cosmo Bio, Chuo-Ku, Tokyo, Japan)。
2. 聚合酶連鎖反應器(Gradient Palm-cycler, Corbett Research Co., Australia and Astec PC320, Astec株式會社, Japan)。
3. 影像系統(ImageQuant 300, GE Healthcare, UK)。
二、方法
㈠DNA萃取與純化
DNA萃取與純化方法是依照本局已發表的論 文“Identification of Saposhinkoviae Radix in Concentrated Chinese Medicine Preparations by Nested PCR and DNA Sequencing Methods”
(4)的方法進行，將檢體藥材及製劑檢體磨碎
或切碎，稱取100 mg置於2 mL微量離心管中 搗碎，加入1 mL之lysis buffer (100 mM Tris- HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% N-lauroyl sarcosine sodium salt, and 1 mg/mL proteinase K)，56°C水浴1小時。加入與溶液等體積之 phenol：chloroform：isoamyl alcohol (25 : 24 : 1; v/v/v)，混合萃取，以12000 × g離心5分 鐘。離心後取水層，加入65°C預熱的CTAB- NaCl溶液(10% hexadecyltrimethylammonium bromide in 0.7 M NaCl)，使CTAB濃度大於 1%，加入NaCl溶液使濃度大於0.7 M，混 合後置於65°C水浴15分鐘，加入等體積之 chloroform： isoamyl alcohol (24 : 1; v/v)，混 合萃取，以12000 × g離心5分鐘。離心後取 水層，加入0.7倍體積之isopropanol及1/10倍 體積之3 M sodium acetate(aq)，以12000 × g離 心5分鐘。離心後倒去上清液，使沉澱物風乾 後，加入50 - 100 µL之無菌水溶解。以PCR純 化套組純化檢體DNA後，DNA溶液供PCR與 Nested PCR之用。
㈡PCR與Nested PCR
標準藥材以2 µL DNA溶液作模板，25 µM primer 18F1、28R 各0.5 µL進行PCR，條件 為94°C/30 sec，58°C/30 sec，72°C/30 sec共 40 cycles。以GenBank石菖蒲ITS2序列設計 之引子時，取4 µL DNA溶液作模板，25 µM primer AgR、AgIF1各0.5 µL進行PCR，條件 為94°C/30 sec，56°C/30 sec，72°C/30 sec共30 cycles。取第一次PCR產物取2 µL作模板，25 µM primer AgR1、AgIF2各0.5 µL進行Nested PCR，條件為94°C/30 sec，58°C/30 sec，72
°C/30 sec共30 cycles。
㈢電泳與定序分析
取PCR產物5 µL，與6倍載入膠片緩衝液1 µL 混合，置入1.8 %瓊脂膠體，在電泳槽(+)極 端加入0.5 µL 10 mg/mL ethidium bromide後，
進行電泳，電泳條件100V、30分鐘，以影 像系統觀察，確認PCR結果，並拍攝影像。
PCR結果確認後，委託明欣(台北，台灣)進行 DNA定序，將定序結果與美國國家衛生院之
GenBank資料庫進行序列比對，得到鑑定結 果。
結果與討論
自大陸收集石菖蒲藥材兩件參考藥材，標示 為Acorus gramieus及Acorus tatarinowii，分別為 中華中藥典與中華人民共和國藥典的所規定之石 菖蒲藥材，將藥材抽出DNA後，以普遍性引子 18F1、28R做PCR擴增ITS片段並做定序分析，這 兩件參考藥材所得的ITS序列不相同，與GenBank 上收載之ITS序列比對，序列相似度分別為參考 藥材Acorus gramieus與GenBank accession No.:
GI 62903191 Acorus gramineus 僅88%，參考藥 材Acorus tatarinowii與GenBank accession No.: GI 62903193 Acorus tatarinowii僅92%，但仍嘗試依 據此兩種參考藥材之序列分別設計不同的引子，
對石菖蒲製劑做檢測，在製劑檢體中，以Acorus gramieus參考藥材所設計的引子，在製劑檢體 中，得不到理想的結果，而以Acorus tatarinowii參 考藥材所設計的引子，Nested PCR後，僅有少數 檢體有DNA片段形成。
石菖蒲成份無法由製劑檢體檢出，有可能 是 參 考 藥 材 基 原 有 疑 問 ， 需 要 再 確 認 ， 而 以 GenBank兩種石菖蒲（GI 62903191 Acorus gra- mineus 與GI 62903193 Acorus tatarinowii）的ITS1- 5.8S RNA- ITS2序列所設計的引子，對製劑檢體 進行Nested PCR後，仍然無法有DNA片段形成。
在製劑檢體中，也可能因為藥材本身性質影 響，如藥材質地較軟，較易在製劑製作的熬煮過 程破壞，因此導致藥材DNA斷裂太過，如以ITS1- 5.8S RNA- ITS2序列約600 bps長度的DNA作為 PCR模板，將不易有PCR產物擴增出來。因此嘗 試僅選取前述GenBank中兩種石菖蒲的ITS2序列 設計引子，再進行Nested PCR，終於獲致結果，
Nested PCR結果電泳如圖一所示。
Nested PCR產物大小約160 bps，再將其定序 並分析序列，製劑檢體序列可分為兩種，第一種 是檢體Ag1A定序所得序列，序列長度159 bps，
再與GenBank資料庫比對，與accession No.: GI 62903193的Acorus tatarinowii僅有1個base的差 異，Ag1A序列及與GI 62903193序列差異位置，
列示於圖二。除Ag1A外，其餘檢體序列均相同，
歸類為第二種序列，序列長度161 bps，上載至 GenBank進行比對，與GI 62903191 Acorus gra- mineus 的序列一致，以檢體Ag1D定序所得序列為 代表，將序列列示如圖三。
所有製劑檢體的鑑定結果表列於表一，由 表一中可以看出，多數檢體所含的石菖蒲基原 仍是Acorus gramieus，只有一件Ag1A是Acorus tatarinowii，而另有1件檢體Ag2D在本次研究中，
未能檢出石菖蒲成分，因Ag2D與另外二個可檢 出的檢體Ag2A、Ag2B皆是天王補心丹，所含藥 材成分相同，應不會是因為成分含有抑制PCR進 行的化學成分所致，而該檢體所含之人參成分，
圖二、 石菖蒲製劑檢體 Ag1A 定序所得 ITS2 序列 ( 序 列長度159 bps)，反白標示部分為和 GenBank GI 62903193 Acorus tatarinowii 差異位置
CACGCCTTCC GTCGCTCCGC GGCATCATCC CCGCCCGATG GAGGGGATCG TCCCGGATGC GGATGCTGGC CCTCCGTTCC CCGTGGGCGG TCGGCTGAAA CCCAAGGTCC GCTGCGGGTC GCGGCACGGC ATTGCGGTGG GCTGAGAGGC AGAGTCCCT
圖一、 以 GenBank 石菖蒲 ITS2 序列設計引子之 Nested PCR 結果電泳 Lane 1: 100 bps ladder maker, Lane 2:
AgA, Lane 3: AgB, Lane 4: Ag1A, Lane 5: Ag1D, Lane 6:
Ag2B, Lane 7: Ad3A, Lane 8: blank (no template)
1 2 3 4 5 6 7 8
可經PCR檢出人參之DNA，亦排除為抽取之DNA 品質不良因素所致，因此推論未檢出之原因可能 有二，一是引子設計是依據A. gramieus及A. tata- rinowii序列，如果Ag2D所含為其他Acorus同屬植 物，則可能無法檢出，二是Ag2D不含有石菖蒲。
由研究結果可以看出，雖然目前檢體中，
含有石菖蒲藥材的製劑仍使用Acorus gramieus為 主，由於中華中藥典與中華人民共和國藥典記載 石菖蒲基原不同，而國內所使用藥材多自大陸進 口，未來產地因應中華人民共和國藥典的規定，
Acorus gramieus的產量可能減少，而取而代之將 是以Acorus tatarinowii為主，是否將中華人民共和
國藥典所載之Acorus tatarinowii列入中華中藥典規 範，應多加思考。
結 論
縮短Nested PCR擴增的DNA片段長度，僅對 ITS1或ITS2擴增，有利於提高實驗的敏感度，解 決藥材DNA在製劑製作過程，DNA太過斷裂，而 無法增測的問題。本研究中所使用鑑別石菖蒲的 方法，提供檢驗中藥製劑成分的一種有力方法，
更提高Nested PCR與DNA定序方法鑑定中藥製劑 的可應用性。
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1.
2.
3.
4.
5.
6.
表一、石菖蒲製劑中石菖蒲成份鑑定結果
藥劑名 鑑定結果
AgA 石菖蒲 Acorus gramineus AgB 石菖蒲 Acorus gramineus Ag1A 還少丹 Acorus tatarinowii (-1) 1 Ag1B 還少丹 Acorus gramineus
Ag1D 還少丹 Acorus gramineus
Ag2A 天王補心丹 Acorus gramineus Ag2B 天王補心丹 Acorus gramineus
Ag2D 天王補心丹 - - 2.
Ag3A 定志丸 Acorus gramineus
Ag4A 桑螵蛸散 Acorus gramineus
Ag4B 桑螵蛸散 Acorus gramineus
Ag4D 桑螵蛸散 Acorus gramineus
1 括號內數字表示檢體DNA序列與GenBank序列資料差異的 base數
2“ --“表未能檢出
TCACGCCTTC CGTCGCTCCG CGGCATGATC CCCCGCCCGA TGGCGGGGAT CGTCCCGGAT GCGGATGCTG GCCCTCCGTT CCCCGTGGGC GGTCGGCTGA AACCCAAGGT CCGCTGCGGG TCGCGGCACG GCATTGCGGT GGGCTGAGAG GCAGAGTCCC T
圖三、 石菖蒲製劑檢體 Ag1D 定序所得 ITS2 序列 ( 序 列長度161 bps)，和 GenBank GI 62903191 Acorus gramineus 序列一致
Identification of Acori Graminei Rhizoma in Chinese Medicine Preparations by Nested PCR and DNA
Sequencing Methods
KANG-TSU LU, HSIAO-MEI HSU, CHI-FANG LO AND JER-HUEI LIN
Pharmacognosy Division
ABSTRACT
As recorded in Pharmacopoeia of Chinese Medicine, Acori Graminei Rhizoma is the dried rhizome of Acorus gramineus Soland. But Acori Graminei Rhizoma is the dried rhizome of A. tatarinowii Schott. in Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. In this study, Nested PCR was employed with two specific primer sets based on the DNA sequences of ITS (internal transcribed spacer) of A. gramineus and A. tatarinowii from GenBank, followed by DNA sequencing analysis for the identification of Acori Graminei Rhizoma in sample preparations. DNA of ITS1-5.8S RNA-ITS2 region couldn't be amplified with the primer sets from the extracted total DNA at first. We thus redesigned another primer sets targeted to ITS2 region and obtained the amplicon by nested PCR. The amplicon was sequenced and compared with GenBank database to check which Acori Graminei Rhizoma is in samples. The results showed that ten of twelve samples were identified as Acorus gramineus, one as Acorus tatarinowii and one without contented Acori Graminei Rhizoma.
Key words: Acori Graminei Rhizoma, nested PCR, DNA sequencing, idetification
