以黴菌及酵母菌共分解木質纖維素生產酒精之研究 潘仕穎、吳芳禎
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摘 要
里氏木霉(Trichoderma reesei, T. reesei)具有完善的纖維素水解酵素系統，然而T. reesei所分泌之胞外酵素β-glucosidase活性 極低，但能與黑麴菌(Aspergillus niger, A. niger)產生協同作用，使纖維素更有效率醣化(saccharification)。而啤酒酵
母(Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae)有不錯酒精發酵能力。硫酸鹽製漿所形成的紙漿，木質素大部分已被去除，具有純 度較高纖維素。本研究利用紙漿散漿配製0.02 g/mL做為醣化基質，在六天培養中，探討單一菌株及混合菌株培養效果，
利用DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)測定不同天數中纖維素水解酵素的活性，並進行葡萄糖和乙醇含量分析。 結果顯示在單 一菌株培養下，T. reesei..在培養第一天時有最佳的纖維酵素活性，分別為exoglucanase (avicelase) 0.45 IU/mL
、endoglucanase (CMCase) 0.59 IU/mL以及filterase 0.21 IU/mL，而T. reesei分泌之胞外酵素β-glucosidase量極低，其活性幾 乎等於零。隨著培養天數的增加，葡萄糖含量逐漸減少，到第六天剩下4.86 mg/mL；而乙醇含量顯著增加到0.85 mg/mL
。S. cerevisiae培養液中亦有少量纖維酵素活性，以exoglucanase活性最大0.15 IU/mL，而β-glucosidase和filterase在培養六天 中活性趨近於零。培養液中葡萄糖含量很少，均無法測得。乙醇含量以第零天的 4.53 g/L最多，而後逐漸下降，到第六天 為3.44 g/L。 T. reesei與A. niger在共同培養第一天，endoglucanase活性最大1.69 IU/mL。exoglucanase、β-glucosidase 與filterase活性最大值分別出現在－exoglucanase 1.50 IU/mL(第零天)、β-glucosidase 1.66 IU/mL(第一天)及filterase 0.35 IU/mL(第三天)。而兩菌共同培養時，葡萄糖含量亦呈減少趨勢，由4.26降至1.47 mg/mL，而第六天乙醇能增加到1.11 g/L
。T. reesei、A. niger以及S. cerevisiae 在六天混合培養下，endoglucanase活性在培養五天時有最大值 1 IU/mL。exoglucanase
、β-glucosidase與filterase活性最大值分別出現在－exoglucanase 0.32 IU/mL(第五天)、β-glucosidase 0.33 IU/mL(第一天) 及filterase 0.26 IU/mL(第二天)。葡萄糖含量以第零天為最多1.93 mg/mL，乙醇含量在第4天增加到3.55 g/L。
關鍵詞 : 乙醇、內切型纖維分解?、外切型纖維分解?、纖維二糖?、木質纖維素 目錄
封面內頁 簽名頁 授權書 iii 中文摘要 iv 英文摘要 vi 誌謝 viii 目錄 ix 圖目錄 xii 表目錄 x封面內頁 簽名頁 授權書 iii 中文摘要 iv 英文摘要 vi 誌謝 viii 目錄 ix 圖目錄 xii 表目錄 xiv 第一章 緒言 1 第二章 文獻回顧 3 第一節 生質能源 3 一、簡介 3 二、生 質能源的種類 4 第二節 生質酒精 6 一、生產方法 6 二、生產原料 6 第三節 木質纖維素 10 一、木質纖維素原料種類 10 二
、紙漿介紹 13 第四節 纖維素分解酵素 17 一、種類 17 二、纖維水解酵素作用機制 21 三、纖維酵素系統水解產物之回饋抑 制 23 第五節 微生物 23 一、具分解纖維素酵素之微生物 23 二、乙醇生產菌 (Saccharomyces cerevisiae) 27 第六節 生質酒精 製程 27 一、目前應用程序 27 第三章 材料與方法 31 第一節 材料 31 一、菌種 31 二、紙漿 31 三、試藥 31 四、儀器設備 32 第二節 方法 32 一、菌液製備 32 二、紙漿製備 33 三、菌量測定 33 四、還原糖測定法 34 五、纖維素分解酵素活性測試 36 六、葡萄糖和乙醇之分析 37 第四章 結果與討論 38 第一節 以單一菌株分解紙漿生產酒精 38 一、以Trichoderma reesei分解 紙漿 38 二、以Saccharomyces cerevisiae分解紙漿 46 第二節 以Trichoderma reesei及Aspergillus niger生產酒精 53 一、酵素系 統活性變化 53 二、菌量變化 53 三、葡萄糖及乙醇含量變化 54 第三節 以Trichoderma reesei、Aspergillus niger
及Saccharomyces cerevisiae混合培養生產酒精 60 一、酵素系統活性變化 60 二、菌量變化 60 三、葡萄糖及乙醇含量變化 61 第四節 單一菌株培養及混合培養時葡萄糖和酒精含量探討 67 一、葡萄糖含量分析 67 二、酒精含量分析 68 第五章 結論 71 參考文獻 73 圖一、典型纖維素轉化酒精製程 9 圖二、纖維素結構 12 圖三、複合纖維酵素體 20 圖四、非結晶和結晶型纖 維素水解作用 22 圖五、發酵單元與酵素水解單元之整合設計 28 圖六、不同基質所釋放之還原糖量 (A1組－T. reesei) 41 圖 七、不同培養天數exocellulase、endoglucanase、β-glucosidase及filterase活性 (A1組－T. reesei) 42 圖八、培養六天後T. reesei 菌量變化 (A1組) 44 圖九、培養液HPLC圖 (A1組－T. reesei) 45 圖十、不同基質所釋放之還原糖量 (A2組－S. cerevisiae)48 圖 十一、不同培養天數exocellulase、endoglucanase、β-glucosidase及filterase活性 (A2組－S. cerevisiae) 49 圖十二、培養六天 後S. cerevisiae菌量變化 (A2組) 51 圖十三、培養液HPLC圖 (A2組－S. cerevisiae) 52 圖十四、不同基質所釋放之還原糖量 (B 組－T. reesei and A. niger) 55 圖十五、不同培養天數exocellulase、endoglucanase、β-glucosidase及filterase活性 (B組－T.
reesei and A. niger) 56 圖十六、培養六天後B組(T. reesei and A. niger)總菌量 58 圖十七、培養液HPLC圖 (B組－T. reesei and A. niger) 59 圖十八、不同基質所釋放之還原糖量 (C組－T. reesei、A. niger and S. cerevisiae) 62 圖十九、不同培養天
數exocellulase、endoglucanase、β-glucosidase及filterase活性 (C組－T. reesei、A. niger and S. cerevisiae) 63 圖二十、培養六天 後C組(T. reesei、A. niger and S. cerevisiae)總菌量 65 圖二十一、培養液HPLC圖 (C組－T. reesei、A. niger and S. cerevisiae) 66 圖二十二、在A1、A2、B及C組中，葡萄糖含量的變化 69 圖二十三、在A1、A2、B及C中，乙醇含量的變化 70 表一、
常見農業與一般廢棄物中纖維素、半纖維素與木質素組成 11 表二、化學紙漿與原木化學成分 16 表三、可分解纖維素之菌 株 26 表四、DNS試劑組成成份 35 表五、T. reesei培養液中菌量、葡萄糖及乙醇含量變化 43 表六、S. cerevisiae培養液中菌 量、葡萄糖及乙醇含量變化 50 表七、T. reesei與A. niger共同培養下菌量、葡萄糖及乙醇含量變化 57 表八、T. reesei、A.
niger和S. cerevisiae共同培養下菌量、葡萄糖及乙醇含量變化 64 參考文獻
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