貳 貳 貳
貳、 、 、 、研究材料與方法 研究材料與方法 研究材料與方法 研究材料與方法
一、菌種的分離與保存
海洋發光細菌經常生活在海洋動物的身體表面，或者是發光魚 類、頭足類動物的特化發光器官中，故從傳統市場中購入頭足類的透 抽兩隻以期能從中分離出海洋發光細菌；經由外表構造特徵可初步鑑 定出從市場購得之透抽為 Uroteuthis 屬的鎖管類物種﹙圖一﹚。使用 以酒精消毒過的解剖用具，取下透抽體壁的一小塊肌肉以及體腔內的 墨囊，同時刮取部份體腔內的組織液，分別放置於額外加入 3% NaCl
（w/v）的 nutrient agar（3% NaCl NA）培養基上，並擺放至 22°C 恆 溫生長箱中進行隔夜培養。翌日，於暗房中用事先滅菌過的牙籤挑起 發光的菌落，並以三區劃線法將之劃在 3% NaCl NA 培養基上。於 22
°C 進行隔夜培養後，再次於暗房中用事先滅菌過的牙籤挑起發光的單 一菌落，以三區劃線法劃在 3% NaCl NA 培養基上並隔夜培養；如此 重複數次之後，便可分離出純種品系。
將分離出的所有純種細菌品系，接種於含有 3% NaCl（w/v）、
15%甘油的新鮮 nutrient broth（NB）液體培養基中，置於－20°C 冰箱 中保存﹙陳秀娟, 1998﹚。
二、菌種的鑑定
1. 革蘭氏染色與細菌的形態
在載玻片上滴數滴蒸餾水，分別用事先滅菌過的牙籤沾取各發光 細菌品系、金黃色葡萄球菌，以及大腸桿菌的單一菌落，在蒸餾水水 滴中塗佈均勻，待其自然風乾後再在酒精燈上過火數次以固定細菌。
滴上結晶紫染液染 1 分鐘後以蒸餾水沖去結晶紫染液，再以革蘭氏碘
液媒染 1 分鐘後，用蒸餾水將革蘭氏碘液沖去。後再以 95%酒精緩緩 地沖洗，直到沒有紫色從玻片上流失為止；之後以蒸餾水將 95%酒精 洗去。最後以沙黃染 1 分鐘後以蒸餾水沖去沙黃，並用面紙吸乾玻片 上的水分。將完成的玻片標本置於顯微鏡下，滴上油鏡油，以顯微鏡 之油鏡鏡頭觀察。
2. 細菌菌落是否具有顏色（pigment）
挑選三株發光細菌品系以及野生型大腸桿菌的單一菌落，以三區 劃線法將細菌劃在 3% NaCl NA 培養基上，置於 22°C 的恆溫生長箱 中進行隔夜培養。隔日，待培養基表面長出菌落後，以野生型大腸桿 菌的白色菌落作為對照，觀察三株發光細菌品系的菌落顏色為何。
3. 溫度對細菌生長的影響
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，以三區劃線法將細菌劃在 3% NaCl NA 培養基上，分別置入 4°C 冰箱、22°C 恆溫生長箱、35°C 恆溫生長箱，以及 40°C 恆溫生長箱中進行隔夜培養，隔天觀察培養 基上有無菌落生長。
4. 測定細菌水解澱粉的能力
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，以三區劃線法將細菌劃在加 入 0.2%澱粉的（w/v）的 3% NaCl NA 培養基上，置於 22°C 恆溫生長 箱中進行隔夜培養。隔日，待培養基表面長出菌落後，在菌落邊緣的 培養基滴上數滴碘液，並觀察碘液顏色的變化；呈現黃褐色表示培養 基中的澱粉已被利用完畢，呈現藍色則表示培養基中的澱粉無法為細 菌所利用。
5. 測定細菌分解明膠（gelatin）的能力
挑選三株純種發光細菌品系的單一菌落，以三區劃線法將細菌劃 在添加 1%明膠（w/v）的 3% NaCl NA 培養基上，置於 22°C 恆溫生 長箱中進行隔夜培養。隔日，待培養基表面長出菌落後，觀察菌落邊 緣的培養基是否呈現透明狀；若呈透明則表示培養基中所含的明膠已 被細菌分解利用，呈混濁則表示培養基中仍含有明膠。
6. 測定細菌醱酵葡萄糖、乳糖及蔗糖的能力
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，分別接種至含有 3% NaCl
（w/v）、並僅含有葡萄糖、乳糖，或是蔗糖的液體醱酵管培養基中。
將接種完成的培養基置於 22°C 恆溫生長箱中進行隔夜培養後，於次 日觀察培養基的顏色是否發生變化，以及是否出現氣體產生的現象。
7. 測定細菌利用檸檬酸鹽（citrate）的能力
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，以三區劃線法將細菌劃在將 NaCl 含量提高至 3%（w/v）的西蒙氏檸檬酸鹽培養基（Simmon’s citrate agar）上，置於 22°C 恆溫生長箱中進行隔夜培養後，觀察培養基的顏 色變化。
8. 測定細菌分泌脂質酵素（lipase）的能力
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，以三區劃線法將細菌劃在含 有 1% tributyrin（w/v）的 3% NaCl NA 培養基上，置於 22°C 恆溫生 長箱中進行隔夜培養。待培養基表面長出菌落後，觀察菌落邊緣的培 養基是否呈現透明狀；若呈透明則表示細菌具有分泌脂質酵素的能 力，而使得培養基中的 tributyrin 被分解利用，呈混濁則表示培養基 中仍含有 tributyrin。
9. 16S ribosomal RNA 基因序列分析
欲定序 16S rRNA 基因序列，首先必須要以聚合酶連鎖反應
（polymerase chain reaction, PCR）的增幅作用將細菌的 16S rRNA 基 因片段加以增殖。配置聚合酶連鎖反應溶液時，使用對應於 E. coli 16S rRNA 基因序列位置 8-27 與 1492-1515 所設計之引子﹙primer﹚，分 別作為順向﹙forward﹚與反向﹙reverse﹚引子。挑選三株發光細菌品 系的單一菌落，接種於含有 3% NaCl（w/v）的 nutrient broth﹙3% NaCl NB﹚培養基，置於 30°C 恆溫生長箱中以轉速 140 rpm 震盪培養至次 日，抽取 1 µl 菌液，混合 2 µl 10X Taq Buffer、1 µl dNTP、0.4 µl forward primer、0.4 µl reverse primer、0.1 µl Taq DNA polymerase，以及 15.1 µl 無菌水，置於 20 µl 的 PCR 薄壁反應管內，並放入 PCR 儀器中進行 反應。PCR 反應過程的反應條件設置為：前變性反應（pre-denaturation）
94°C、10 分鐘；接下來的 35 個循環依序進行變性反應（denaturation）
94°C、1 分鐘，黏合反應（annealing）52°C、1.5 分鐘，以及延長反應
（extension）72°C、1.5 分鐘；最後一次延長反應則為 72°C、4 分鐘，
之後保存於 4°C 備用。抽取 5 µl 增幅反應後的產物，並以 1.5%電泳 膠、TAE buffer、2 µl 標誌（1 kbp DNA Marker），以及外接 100 V 電壓的電泳槽持續進行 30 分鐘電泳。電泳完成後，以 Ethidium Bromide（EtBr）將電泳膠中的 DNA 光帶染色，並以暗箱與 UV transilluminator 連結照相設備擷取螢光影像。
由螢光影像確定 PCR 所獲得的 DNA 片段長度後，將剩餘的 PCR 產物及少量之 forward primer 以及 reverse primer 一起送交國立臺灣師 範大學生命科學研究所遺傳多樣性實驗室進行定序。序列分析完成 後，將所得之 DNA 序列與美國國家生物科技資訊中心﹙National
Center of Biotechnology Information, NCBI﹚線上資料庫中的序列進行 比對後，以相似度最高的幾筆資料作為菌種的初步鑑定結果。
10. 擴增核糖體 DNA 限制性分析
擴 增 核 糖 體 DNA 限 制 性 分 析 ﹙ Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA ﹚ 是 一 種 將 限 制 性 片 段 長 度 多 型 性
﹙RFLP﹚應用在核糖體 DNA 序列上的方法﹙Wellauer et al., 1974﹚。
當運用在區別及鑑定海洋發光細菌上時，其方法為使用五種限制酵 素：EcoRI、DdeI、HhaI、HinfI，以及 RsaI 去裁切細菌的 16S rRNA 基因，藉由電泳後所獲得的光帶樣式不同而區分出 14 種已知的海洋 發光細菌。由於經由 16S rRNA 基因序列的定序結果，已知本研究中 所 分 離 出 的 三 株 發 光 細 菌 品 系 皆 較 可 能 為 Photobacterium leiognathi。因此在使用ARDRA 此一方法時，首先使用 HhaI 與 RsaI 這兩種限制酵素以將 P. leiognathi 與 P. phosphoreum 之外的可能性排 除；若能使用上述兩種限制酵素將其他可能性排除，則最後再用 EcoRI 便可區分 P. leiognathi 與 P. phosphoreum。
HhaI 限制酵素的反應溶液包含了 3 µl 經由聚合酶連鎖反應的增 幅作用加以增殖的細菌 16S rRNA 基因以及 0.2 µl HhaI、1 µl BSA、1 µl Buffer，並加入無菌水使混合後總體積為 10 µl，將反應液混合於薄 壁小離心管中，並置入 37°C 恆溫生長箱中進行反應至次日；RsaI 與 EcoRI 限制酵素之反應溶液皆以相同比例配置混合。
限制酵素的裁切反應完成後，將所得產物取出 5 µl，並以 1.5%
電泳膠、TAE buffer、2 µl 標誌（100 bp DNA Marker），以及外接 100 V 電壓的電泳槽持續進行 30 分鐘電泳。電泳完成後，以 EtBr 將電泳
膠中的 DNA 光帶染色，並以暗箱與 UV transilluminator 連結照相設 備擷取螢光影像。
11. 細菌內含質體﹙plasmid content﹚分析
分析每一發光細菌品系之內含質體，若細菌帶有質體，則可利用 質體在不同品系之間互相作為探針進行雜合反應，亦為一簡易區別品 系的方法﹙Caccamo et al., 1999﹚。
挑選三株發光細菌品系以及一已知細胞內帶有質體之細菌品系 的單一菌落，分別接種至 3% NaCl NB 液體培養基中，並置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪培養。次日，使用 Gene-SpinTM-V2 Miniprep Purification Kit﹙PROTECH﹚抽取細菌內可能含有的質體，
並將所得產物取出 20 µl，以 1.5%電泳膠、TAE buffer、2 µl 標誌（1 kbp DNA Marker），以及外接 100 V 電壓的電泳槽持續進行 30 分鐘 電泳。電泳完成後，電泳膠以 EtBr 將 DNA 的光帶染色，並經暗箱與 UV transilluminator 連結照相設備擷取螢光影像。
三、發光細菌發光強度的測定
為測定發光細菌的發光強度，本研究使用 Nikon Corporation 所生 產之型號為 D50 的數位單眼相機（Digital Single Lens Reflex, DSLR）
擷取發光細菌所發出的光，並將其轉換為數位訊號後儲存，以利後續 在電腦上以軟體協助定量發光強度。
為能順利使用數位單眼相機擷取發光細菌所發出的光，其過程須 在用瓦楞紙箱建置而成的一個類似暗房功能的暗箱﹙圖二﹚中進行。
首先將瓦楞紙箱折疊成箱型，一端以封箱膠帶進行封口，並以封口端 平放於地面；另一端則因此呈現向上的開口狀，使用封箱膠帶將接縫 處黏合，使其成為一個僅一面開口的長方柱體。將數位相機固定於翻
拍架上一起由開口端置入箱中，並事先於翻拍架底部的置物檯面上以 油性筆標誌出受測樣本的放置位置，以固定受測樣本在數位照片中的 位置。
欲擷取發光細菌所發出的光時，首先以數層黑色塑膠布覆蓋瓦楞 紙箱的開口端，完整覆蓋後，由於相機自拍遙控器所使用的紅外線無 法穿透此暗箱，故須開啟一小縫使操作者的手得以伸入箱中，並以自 拍遙控器對相機下達拍攝指令。遙控自拍指令具有兩秒鐘的緩衝時 間，故操作者在按下自拍遙控器按鈕後，須於兩秒鐘內將手伸出箱 外，並將所開啟之小縫覆蓋完全，以避免漏光的現象發生。待曝光時 間快結束時，操作者須再手持自拍遙控器，經由謹慎開啟、不會造成 漏光現象的小縫，以遙控指令使相機快門關閉，亦即停止當次曝光。
為確認此一設施在捕捉光訊號上的可行性，在使用於正式實驗之前，
已先於暗箱中無光源存在的狀態下重複數次曝光程序，確認此一設備 及操作方法並無漏光的現象發生。
此外，由於三株海洋發光細菌品系在液體培養基中的發光強度差 異甚大，故每一品系的受測樣本在拍攝時的曝光時間並不相同，分別 為：L 品系曝光 15 秒、D 品系曝光 3 分鐘，而 Dalt品系則需曝光 5 分鐘。
四、不同理化因子對於不同細菌品系發光強度的影響 1. 細菌的生長曲線
為利於後續實驗的規劃與施行，首先測定出三株發光細菌品系的 生長曲線，以了解細菌的生長速率與培養時間的關係。
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱中以轉速 140 rpm 震盪
培養。每隔 1 小時便從中取出 500 µl 菌液測定其於 600 nm 光波長下 的吸光度﹙optical density﹚；重複進行至開始培養後第 20 小時為止。
2. 溫度對細菌發光強度的影響
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱中以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液後再加入 5 毫升 預先保溫於 10°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，靜置於 10°C 水浴槽內 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿中，並置於前述之攝影設 施內以數位單眼相機記錄其發光強度。重複上述培養步驟，在離心且 倒除上清液後分別加入 5 毫升預先保溫於 15°C、20°C、25°C、30°C、
35°C，以及 40°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，再分別靜置於 15°C、
20°C、25°C、30°C、35°C，以及 40°C 的水浴槽 30 分鐘後，將所有菌 液倒入 5 公分培養皿中，並置於前述之攝影設施內以數位單眼相機記 錄其發光強度。
3. pH 值對細菌發光強度的影響
將 3% NaCl NB 液體培養基，以 NaOH 及 HCl 分別調配成 pH 值 分別為 5、6、7、8、9 等五種不同 pH 值的培養液。
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液並加入 5 毫升預 先保溫於 20°C 之 pH 值等於 5 的 3% NaCl NB 液體培養基，靜置於 20°C 水浴槽 30 分鐘後，將菌液全部倒入 5 公分培養皿中，並置於前 述之攝影設施內以數位單眼相機記錄其發光強度；其餘 pH 值之液體 培養基的處理程序同上述步驟。
4. 鹽度﹙salinity﹚對細菌發光強度的影響
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱中以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液後再加入 5 毫升 預先保溫於 20°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，靜置於 20°C 水浴槽內 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿中，並置於前述之攝影設 施內以數位單眼相機記錄其發光強度。重複上述培養步驟，於離心且 倒除上清液後加入 5 毫升預先保溫於 20°C，並分別含有 4%、5%、6%、
7%、8% NaCl（w/v）的 NB 液體培養基，再靜置於 20°C 水浴槽內 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿中，並置於前述之攝影設施內 以數位單眼相機記錄其發光強度。
5. 滲透壓對細菌發光強度的影響
在 3% NaCl NB 液體培養基加入蔗糖，並將蔗糖濃度分別調配成 5%、10%、15%（w/v）三種不同濃度。
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液。加入 5 毫升預 先保溫於 20°C、蔗糖濃度為 5%的 3% NaCl NB 液體培養基，靜置於 20°C 水浴槽 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿中，並置於前 述之攝影設施內以數位單眼相機記錄其發光強度；其餘蔗糖濃度的液 體培養基之處理程序亦同上述步驟。
6. 紫外光對細菌發光強度的影響
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪
培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液。加入 5 毫升預 先保溫於 20°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，靜置於 20°C 水浴槽 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿內，並置入 Spectrolinker XL-1000 UV crosslinker﹙Spectronic Corporation﹚中，以紫外光照射 分別給予 2500 J/m2及 5000 J/m2的能量；紫外光照射完畢後儘速將培 養皿置於前述之攝影設施內以數位單眼相機記錄其發光強度。
7. 鋅離子﹙Zn2+﹚濃度對細菌發光強度的影響
分別將 0.33、0.66 g 氯化鋅﹙ZnCl2﹚加入 10 ml 無菌水中以配置 出鋅離子濃度分別為 16、32 g/l 的氯化鋅溶液；配置過程中加入數滴 HCl 以幫助 ZnCl2溶解。
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 含有 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液。加入 5 毫升預 先保溫於 20°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，以及 1 µl 鋅離子濃度為 16 g/l 的氯化鋅溶液；靜置於 20°C 水浴槽 30 分鐘後，將所有菌液倒 入 5 公分培養皿中，並置於前述之攝影設施內以數位單眼相機記錄其 發光強度。重複上述培養與處理步驟，但過程中加入 1 µl 鋅離子濃度 為 32 g/l 的氯化鋅溶液，使得鋅離子最後在受測菌液中的濃度分別為 3.2、6.4 mg/l。
8. 過氧化氫對細菌發光強度的影響
挑選三株發光細菌品系的單一菌落，將細菌接種於 50 ml 的 3%
NaCl NB 液體培養基，置於 30°C 恆溫生長箱內以轉速 140 rpm 震盪 培養 8 小時後，以 2000 g 離心 5 分鐘，倒除上清液。加入 5 毫升預 先保溫於 20°C 的 3% NaCl NB 液體培養基，以及 1 µl 預先配置成 5 M
的Ｈ2O2溶液，使Ｈ2O2最後在菌液中的濃度為 1 mM；靜置於 20°C 水浴槽 30 分鐘後，將所有菌液倒入 5 公分培養皿中，並置於前述之 攝影設施內以數位單眼相機記錄其發光強度。
五、數位訊號的定量
擷取發光細菌所發出的光時，在停止曝光後便可將覆蓋暗箱用的 黑色塑膠布掀開，取出受測樣本並吸取 1 ml 菌液至 1.5 ml 小離心管 中備用。從小離心管中吸取 500 µl 菌液並測試其於 600 nm 光波長下 的吸光度；另吸取 100 µl 菌液進行序列稀釋至 10-7倍，然後取 100 µl 稀釋完成後的菌液均勻塗佈於 3% NaCl NA 培養基上，並置於 30°C 恆溫生長箱中進行隔夜培養；待次日培養基上長出菌落之後，移至暗 房中以肉眼觀察，或是以數位相機於暗箱中進行拍攝，確認為發光細 菌品系之菌落後，計算菌落的數目。
以數位單眼相機拍攝所獲得的數位照片檔案，首先使用 Nikon Capture NX Version 1.1 軟體將原始檔案格式 NEF 以最高品質設定轉 檔成 JPG 檔案格式，以便於後續影像分析軟體之處理。轉檔前之照 片大小為 3024×1998 像素﹙pixels﹚，檔案大小約為 5 百萬位元組
﹙megabytes, MB﹚；轉檔後之照片像素大小不變，檔案大小則因 JPG 檔案格式經過些許壓縮而略為變小。分析數位相機所紀錄之數位訊號 所使用的軟體為 ImageJ programme version 1.32j﹙Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/﹚﹙Tamminen & Virta, 2006﹚。分析時，首先 以 ImageJ 開啟欲分析之 JPG 檔案格式照片，然後以圓形圈選工具在 照片中具有發光訊號處選取直徑為 1300 像素的圓形範圍，接著打開 位於工具列的 Macro 指令集，使用其子指令集中的 Measure RGB 指 令進行發光強度的定量。此一指令可同時獲取該照片中圈選區域的紅
色、綠色，與藍色訊號強度值，而發光強度值則是由紅、綠、藍三色 之訊號強度平均而得。最後把發光強度值、紅色訊號值、綠色訊號值，
以及藍色訊號值除以受測樣本經稀釋培養後所得之菌落數，將所得平 均值定義為各訊號值的「細菌平均訊號值」，並進一步分析比較。
