Magnolol 抑制癌細胞之分子機轉研究
Magnolol 是由中國傳統中藥厚朴中所分離出來含有 hydroxylated biphenyl 化合物的,本研究的目的為探討其抗癌作用及其可能 的作用分子機轉。本研究的結果顯示,雖然在非常低的濃度下 (3-10 mM) Magnolol 對於人類大腸癌細胞 (COLO-205) 及肝癌細 胞 (Hep-G2) 的 DNA 合成及數目增生具有抑制作用,且其抑制作用與 Magnolol 的劑量呈正向相關的方式。然而 Magnolol 的這 些抑制作用則不見於人類的正常細胞如表皮細胞 (keratinocytes) 、纖維母細胞 (fibroblasts) 及人類臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 。 Magnolol 在此濃度下 (3-10 mM) 對這些人類癌細胞並不具毒性。此結果顯示 magnolol 對於癌細胞生長的抑制作用是經由抑制 細胞週期。利用 [3H]thymidine incorporation 及流式細胞儀 (flow cytometry) 的分析,我們發現 magnolol 可抑制癌細胞 DNA 的 合成,且使細胞週期停滯在 G0/G1 期。利用西方點墨法分析 (Western blot analysis) 及酵素測定 (kinase assay) ,我們進一步推測 magnolol 可能是藉由增加抑制細胞週期的調控蛋白 p21Cip1 的表現,而抑制 cylin-CDK 複合物的活性,進而使細胞的週期停滯 於 G0/G1 ,而造成增生的抑制。
當進一步探討 magnolol 引起 p21Cip1 蛋白表現的分子機轉我們發現 magnolol 可造成 COLO-205 細胞內鈣離子濃度上升的現象。
而這些由 magnolol 引發的細胞質內鈣離子增加可引發 protein kinase c (PKC) 蛋白的活化。 PKC 是屬於 serine-threonine 酵素的 家族。以前的報告曾指出 PKC 的活化與大腸癌致癌機轉有關。當進一步探討在 COLO-205 細胞中 PKC 訊息傳導途徑是否參與 magnolol 所引發之 p21Cip1 蛋白表現增加,我們發現在投與 magnolol 前以 PKC 抑制劑 (staurosporine) 對 COLO-205 細胞作預先 處理,可防止因 magnolol 所引發之 p21Cip1 蛋白表現增加。另外,我們也發現以 magnolol 處理 COLO-205 細胞後,可造成 PK Cg 由細胞質轉位至細胞膜,顯示對 PKCg 的活性具有促進作用。此外,根據以下的研究證據,包括 : (a) Extracellular signal-reg ular kinase (ERK) 及 c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 二者皆被 magnolol 所活化以及 (b) 將 COLO-205 細胞以 MEK (mitogen-acti vated protein kinase kinase) 抑制劑 (PD98059) 作預先處理可防止因 magnolol 所引發之 p21Cip1 蛋白表現增加,我們進一步推測 ERK 及 JNK 所調控的訊息傳導路徑皆可能參與了 magnolol 在 COLO-205 細胞中所引發之 p21Cip1 蛋白表現增加的現象。
當我們將 magnolol 的濃度增加至 100 mM 時, 36 小時的處理下 COLO-205 及 Hep-G2 細胞則產生凋亡現象 (apoptosis) ,但人 類正常牙齦纖維母細胞 (fibroblasts) 及臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 對相同的處理則無此反應。接著我們利用 Hep-G2 細胞來當作 探討 magnolol 引發細胞凋亡的分子機轉模式。 100 mM magnolol 處理後在 Hep-G2 細胞內產生了以下的一些變化 : (a) 細胞質 內鈣離子濃度增加, (b) 由粒腺體至細胞質之轉位的細胞色質 c (cytochrome c) 量增加, (c) caspases 3, 8, 9 被活化,及 (d) bcl-2 蛋白的表現被抑制。若以 phospholipase C 抑制劑, 1-[6-[[(17b)-3-methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]amino]hexyl]-1 H-pyrrole-2, 5-dione (U73122) ,或細胞內鈣鰲合劑, 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N'',N''-tetraacetic acid aceto xymethyl ester (BAPTA/AM) ,作預處理,則 magnolol 在 Hep-G2 細胞引發的細胞質內鈣離子增加的量及 caspases 8 與 9 的活 化程度被會被抑制,同時 magnolol 所引發之 Hep-G2 細胞的凋亡現象也有明顯的減少。利用對抗 Fas 的抗體 (ZB-4) 來處理 He p-G2 細胞,則 magnolol 所引發之 caspases 8 活化的程度會受到抑制,同時 Hep-G2 細胞的凋亡現象也有明顯的減少。綜合以上 的發現,我們推測細胞質內鈣離子濃度的增加、細胞色質 c 由粒線體內位移至細胞質、及 Fas 所引發之訊息傳遞途徑等,皆參 予了 magnolol 所引發的 Hep-G2 細胞凋亡之分子機轉。
最後以裸鼠當作動物模式,來測試 magnolol 在生物體內之抗癌作用。首先我們將 COLO-205 細胞植入裸鼠的皮下組織中使之 產生腫瘤,再由裸鼠腹膜腔中每日注射給與 magnolol (100 mg/kg) 。兩個星期的藥物處理後,裸鼠皮下的腫瘤生長受到明顯的 抑制,抑制效果高達 85 % 。在這些生長受抑制的腫瘤組織中,可觀察到 p21Cip1 蛋白表現量增加,以及細胞凋亡的現象。重 要的是,如此的藥物處理並未對裸鼠產生明顯的毒性反應。綜合以上的研究結果,我們首次證實了 magnolol 在活體外及活體 內皆具有抑制腫瘤細胞生長的能力,也闡述了其可能的作用分子機轉。