在 1984 年 Gorton 將 Meldola blue 修飾於石墨片上，發現 Meldola blue

第一章 緒論

1.1 類核黃素之應用研究

電化學偵測器（Electrochemical sensor）是生化感測與臨床檢驗的 利噐之一，而修飾於電極表面的酵素則是所依賴的探測元。由於酵素 的電子傳遞中心（Redox center）多無法與電極直接接觸，因此必須 仰賴電子傳遞媒介（Mediator）協助電子傳遞，不僅可加速電荷傳遞 速率，亦可降低生化物質在電極表面進行氧化還原時的過電壓，有效 提升偵測效率。目前常用的生化感測媒介有：Phenoxazine、

Phenothiazine 與 Phenozine，可與生化物質如菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷 酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，簡稱 NADH）進行電子交換。

(1)

在 1984 年 Gorton 將 Meldola blue 修飾於石墨片上，發現 Meldola blue

（簡稱 MB，Phenoxazine 衍生物）可與 NADH 進行反應：

MB

＋ NADH
[MB

-NADH] 式 1-1 [MB

-NADH]
NAD

+ MBH 式 1-2 MBH
MB

+ 2e

+ H

式 1-3 由於此一結果，他成功藉由上述反應機制與葡萄糖去氫酶對葡萄糖進 行偵測。關於 Phenothiazine 的應用研究，Ye 和 Baldwin 於 1988 年將 Methylene blue 吸附於石墨片上，藉以探討其與肌紅蛋白（Myoglobin）

與血紅素（Hemoglobin）中的 Cofactor 間之交互作用，藉以探討肌紅

蛋白、血紅素儲存與運送氧氣機制

。在 1990 年，Persson 也藉由 3- β-naphthoyl-Toluidine blue O 與 Toluidine blue O 探討其與 NADH 間 的交互作用。

對於 Phenazine 之應用研究，Gorton 也於 1985 年利用 Dip coating

方式將 N-methylphenazinium ion 修飾於電極表面，再結合葡萄糖氧化

酶偵測葡萄糖。

從 1984 年起，Phenoxazine、Phenothiazine 與

Phenozine 這三類結構類似物也逐漸被應用於生化燃料電池中作為電

子傳遞媒介，藉以探討研發新能源。

1.2 NADH 與 NAD

簡介

菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，簡稱 NADH)與其氧化還原，NAD

，是維生素菸鹼酸(Nicotinic acid)的衍 生物，結構式如圖 1-1 所示。在 1937 年，NAD

首度被發現為去氫酶 的輔酶。從 1970 年起，科學家逐步了解 NAD

在生化環境中可媒介 去氫酶進行下述反應

：

A. L-Lactate Pyruvate

B. L-Malate Oxaloacetate

C. Ethanol Aldehyde

D. Glyceraldehyde

3-phosphate 1,3-Diphosphoglyceric acid

L-Lactate dehydrogenase

L-Malate dehydrogenase

Alcohol dehydrogenase

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

1978 年 Tse 和 Kuwana 等人證實：NAD

經由酵素轉化後所生成的產 物與以電化學方法製得的產物相同

。兩年後，Moiroux 和 Elving 指 出：NADH 可以碳電極(glassy carbon)在電位 0.56 V vs. SCE 氧化，但 與理論值差異極大，顯示 NADH 在無酵素環境下，其氧化反應存在 極大的過電壓，因此維生素 C 或尿酸會對 NADH 的氧化造成干擾，

因此也提出修飾電極概念，試圖在電極表面利用電子傳遞媒介以降低

其氧化過電壓。

N N N

N

NH₂

O

H OH

H H

H H

O P O^-

O

N H

O OH OH

H H

H H

O P O^-

O

O

O NH₂

N

O NH₂

R

H H

2e^- 2H⁺

or

N

O NH2

R

H H

NAD⁺

NADH +

圖 1-1 NAD

與 NADH 之結構示意圖。

1.3 分子探針

原子力顯微鏡(Atomic force microscope 簡稱 AFM)係利用奈米尺

度探針以探測樣品表面，雖然如此，未經特殊修飾，多無法辨識所探

測之物種，例如： AFM 可探測線狀或螺旋 DNA 分子的形貌，然而僅

能依據分子大小而呈現相似形貌。在 2004 年，文獻指出

，若將探

針修飾上抗體，可藉由抗體與抗原間之專一性，使探針與修飾有抗原

之表面產生作用力而辨識分子。此一方法之提出，對於細胞組成了解

以及特定藥物合成研發極具啟發性。

1.4 顯微鏡發展史

虎克在 17 世紀利用人類第一部光學顯微鏡(Optical

microscope)，觀察到植物細胞的構造。之後，在電腦與壓電掃描器製 作技術的逐步突破下，共軛焦顯微鏡(Confocal microscope)於焉誕 生，提升了光學顯微鏡在Ｚ軸上的解析度。共軛焦顯微鏡可配合螢光 染色技術，對細胞膜或胞內的分子做定性與定量分析，但其解析度仍 受到 Abbe 障礙(Ernst Abbe, 1840~1905, 解析度為觀測光源波長之半) 的限制只能達到 0.2 µm。為突破此一極限，Ruska 在 1934 年發明了 以電子束為光源的電子顯微鏡(Scanning electron microscope 簡稱 SEM)，可將影像解析度提高至 2 nm。雖然如此，SEM 仍無法看到原 子排列。

到 1980 年初期，掃描式穿隧電流顯微鏡(Scanning tunneling microscopy 簡稱 STM)被發明，可將顯微鏡的解析度提高到原子等 級，但需在真空下始能達到目的。在 1982 年，任職 IBM 的 Binnig 和 Rohrer 利用探針與導體間的穿隧電流作為呈像訊號，使得 STM 可 在一般環境下獲得原子級的解析度。但因 STM 的應用是藉由穿隧電 流，故所分析之樣本必須是導體。目前 STM 已廣泛應用在電化學各 領域的研究，如金屬或導電高分子的電沈積、電極表面的吸附現象、

電極表面的氧化還原、材料的溶解、腐蝕及蝕刻等

。

在 1985 年，Binnig、Quate 和 Gerber 發明了原子力顯微鏡，其原

理是利用一柔軟懸稈探針，藉由其與試片間微小原子力(Van der Waals 力，約為數個 nN)作為呈像訊號，致使非導體也可利用 AFM 觀測其 表面影像。由於 AFM 可在液相、氣相中操作，且樣本不需複雜之前 處理，其應用性比 STM 更具普遍性，可量測軟組織或分子間的力學 特性。上述四種顯微鏡的特性列於表 1-1 中。

表 1-1 四種主要顯微鏡的特性比較。

Resolution

X，Y Resolution

Z Circumstance Pretreatment required Optical

Microscope 0.2 µm 1 µm air，liquid none Confocal

Microscope 170 nm 500 nm air，liquid none SEM 2 nm N/A vacuum Hard,

drying，

coating AFM 0.1 nm 0.01 nm air，liquid，

vacuum none

1.5 AFM 原理

(1)接觸式(Contact mode 簡稱 C mode)

進行 AFM 圖像掃描時，當針尖與樣品表面輕觸，原子間產生微 弱排斥力，(當探針與試片的距離約為數個 Å 時，如 3 Å，兩原子的 電子雲產生互斥現象)，致使探針偏移。此時若將反饋力設為定值，

便可獲得探針掃描各點時的位置變化，從而得到樣品表面形貌的圖 像。

由於探針與樣本是彼此接觸，其影樣解析力最好，適合做原子級 的觀測，但對較軟的樣本(如生物樣本或高分子) ，則須選擇較軟的 懸桿與較小的接觸力，否則會有刮傷樣本之慮。

(2)非接觸式(Noncontact mode 簡稱 NC mode)

非接觸式掃瞄主要利用原子間遠距吸引力─凡得瓦力(探針與試 片的距離約為數十個到數百個 Å)來進行檢測。NC-AFM 操作模式是 對黏附於懸桿上的壓電晶體施予一交變電壓，使懸桿受一力作用產生 一微小振幅擺動，此懸桿的振幅與頻率會隨探針與樣本間的作用力不 同而改變，可透過監測振幅的變化量來得知樣本的表面輪廓。

由於探針並未和樣品實際接觸，因此對於軟性樣品表面所造成刮

傷可大大降低，探針受損的情形也可減少；但由於探針和樣品並未接

觸，因此非接觸模式的呈像術之空間解析度較差，為其主要缺點。

(3)敲擊模式(Tapping mode)

使懸桿上下擺動輕拍於樣本表面，並藉振幅的改變而呈像，由於 受到吸力與斥力的交互作用，也稱為間歇式的接觸式模式

(Intermittent-contact mode)或半接觸模式(Semi-contact mode)。敲擊模 式與非接觸模式的操作方式類似，但探針懸臂振動的振幅較大，而探 針和樣品間的距離也比非接觸式來得大。在掃描過程中，探針會接觸 到樣品表面，其解析度也較非接觸模式的解析度來得高。但此種探針 和樣品的接觸只是輕敲樣品表面，故對樣品表面的刮傷可減到最低，

對於柔軟性較好的試片，如生物樣本，使用敲擊模式觀察表面輪廓

時，可在不損傷試片下，得到較佳的呈像結果，在氣相下可避免樣本

上自然水層的干擾。

1.6 STM 原理

掃描式穿隧顯微鏡是利用量子力學的穿隧效應，即在導電探針與 導電樣品間施加一偏壓，在二者靠近到某一程度距離時，電子越過針 尖和樣品的能量障壁而產生穿隧電流，其中穿隧電流(I)與探針和樣品 間的距離z呈指數關係：

式 1-4 其中ϕ 為位能障礙的高度(Tunneling gap)，與樣品和材料有關;V 為所 施加的電位;Z 為探針與樣本間的距離。當 Z 小於 1 Å 時，I 的變化可 增加約 10 倍，對距離變化非常靈敏，極適合用於小尺寸下的表面量 測。

一般而言，掃描穿隧顯微鏡可依取像方式分為三類：

A.定電流取像法：

定電流取像法(Constant current mode)是令探針持有固定的電流 值，故探針會隨樣品表面起伏而調整其高度。此方法的好處是可容忍 較大的表面高低變化，但由於必須以回饋信號來調整探針位置，因此 掃描速度較慢，容易受低頻雜訊的干擾。

B.定高度取像法：

定高度取像法(Constant high mode)是令探針以固定的設定高

( ( A ( V ) * Z )

I ∝ e ^{− ϕ −} 2

度，直接以穿隧電流值的變化來作為表面呈像依據。特點是可快速掃 描，捕捉表面動態，適合觀察表面起伏較小的樣品，但其弱點為：若 掃描範圍內的樣品表面起伏太大，易損壞探針。

C.電流密度取像法：

由於穿隧電流的大小除了和探針及樣品的間距有關外，也和探針

所在位置的表面電子密度有關。此法結合上述兩種方法，以偏壓調變

為取像變數，即進行掃瞄時，探針與樣品距離設為定值，在每一個掃

瞄點停留數百微秒，改變偏壓大小，紀錄不同電壓下所對應的穿遂電

流，獲得各點電流-電壓分佈圖，屆時再將各點在某固定偏壓下的電

流作圖，即可得到表面電流密度分佈。

1.7 EC-STM 原理

電化學測量中，多以三極式組態，即工作電極(Working electrode)、

輔助電極(Counter electrode)與參考電極(Reference electrode)，對分析 物進行伏安法分析。若利用STM進行臨場電化學測量時，STM的探針 可視為第四電極，其電壓可透過雙電位儀加以控制。在電化學系統 中，探針除有穿隧電流通過之外，同時探針也會感應到充電電流 (Charging current)與法拉第電流(Faradic current)。由於此二電流大於 穿隧電流，因此探針必須適當絕緣，使充電電流與法拉第電流的電流 值降至最低。

A.充電電流：固相電極與液相電解質間存在電雙層（Electrical double layer），因此進行電位掃瞄(Voltage ramp)時，會產生如下電流：

I_c = AC_d dE

dt

式 1-5

其中，A 是探針表面積，C

是電雙層的電容，E 是施加的電位。由於 充電電流幾乎保持定值，故其對穿遂電流之影響遠小於法拉第電流。

B. 法拉第電流：進行 EC STM 測量時，在基材 (即工作電極) 表面 無可避免會發生氧化還原反應，此時所產生的電流即為法拉第電流。

此時，STM 探針與工作電極間的穿遂電流，便無可避免地會受到法

拉第電流的干擾

。因此，必須藉由適當絕緣將法拉第電流降低，始

能獲得清晰影像。

1.8 螢光淬熄

分子受光激發後，可循輻射形式（Radiation） ，如螢光或磷光放射，

將能量釋出，亦可循非輻射形式（Non-radiation），如放熱，將能量釋 出。然而激態分子是具潛力的氧化劑或還原劑，因此若在電子授與者 或接受者存在時，二者間便可發生光誘發電子轉移或是能量轉移反應

(16~21)

，而將激發態分子之能量經由淬熄反應（Quenching）釋出，其

中淬熄反應可能來自於：

I、靜態淬熄(Steady-state quenching)：基態發光團(A)與淬熄劑(Q) 間的反應；

II、激態淬熄(Dynamic quenching)：發光團受激發後(A*)與 Q 間 的反應；

III、靜態與動態淬熄：基態與激態 A 均與 Q 進行反應。

若螢光淬熄涉及機制 I，即：

A hv A* , kA 式1-6

A* A + heat , k

A* A + hv , k

則[A*]是 k

、k

與 k

的函數，其中 k

、k

與 k

分別為 A 吸收光的反

應速率常數、輻射的反應速率常數以及非輻射的反應速率常數，而 K

d[A*]/dt = k

[A] - k

[A*] - k

[A*] = 0 式 1-10 [A*] = k

[A]/(k

+ k

) 式 1-11 假設螢光量子效率(Φ

)與[A*]呈正比關係，即：

Φ

= f[A*]

Φ

= f k

[A]/(k

+ k

) 式 1-12 又因 A 與 complex 須滿足物質守恆：

C

= [A] + [complex] 式 1-13 K = [complex]/{[A][Q]} 式 1-14 [A] = C

/(1 + K[Q]) 式 1-15 所以，Φ

= f k

C

/{(k

+ k

)(1 + K[Q])} 式 1-16 當 [Q] = 0，Φ

存在最大值，Φ

，

Φ

= f k

C

/(k

+ k

) 式 1-16-1 因此

Φ

/Φ

= 1 + K[Q] 式 1-17 在 Steady-sate 狀態下，Φ

與螢光強度（F）成正比，

Φ

/Φ

= F

/F

其中 F

為最大螢光強度，因此，若以(F

/F)對[Q]作圖，即可求得 K 值。

若螢光淬熄涉及機制 II，即：

A hv A* , k

A* A + heat , k_nr A* A + hv' , k_f

A* + Q A + Q + heat , k_q ^式1-18

則根據 steady state approximation：

d[A*]/d t = k

[A] - k

[A*] - k

[A*]- k

[A*][Q] = 0 式 1-19 所以 [A*] = k

[A]/(k

+ k

+ k

[Q]) 式 1-20 因為 Φ = f[A*]

所以 Φ = fk

[A]/(k

+ k

+ k

[Q]) 式 1-21 若無 Q，則Φ存在最大值Φ

Φ

= f k

[A]/(k

+ k

) 式 1-22 因此，Φ

/Φ = 1 + k

[Q]/(k

+ k

)

或 F

/F = 1 + K

[Q] 式 1-23 其中 K

定義為 k

/(k

+ k

)。若以(F

/F)對[Q]作圖，即可求得 K

值。

此外，因 Q 會將 A*的能量轉移成熱能，因此 A*的生命期（τ）會隨 Q 添加而變小。若定義 A*的生命期為(k

+ k

+ k

[Q])的倒數：

τ = (k

+ k

+ k

[Q])

式 1-24 則 τ

= (k

+ k

)

式 1-25

τ

/τ = (k

+ k

+ k

[Q])/(k

+ k

) = 1 + k

[Q]/(k

+ k

)

= 1 + k

τ

[Q] 式 1-26

作圖，不僅可得到與以(F

/F)對[Q]作圖之結果，更可求出 k

以及判辨 否涉及 Dynamic quenching。

若螢光淬熄涉及機制 II 與機制三，即：

A hv A* , k_A

A* A + heat , k_nr A* A + hv' , k_f

A* + Q A + Q + heat

A + Q complex , K

若無 Q 時，螢光強度如式 1-11，

Φ = f[A*] = fk

[A]/(k

+ k

)

根據 steady state approximation 可求得如式 1-20：

[A*] = k

[A]/(k

+ k

+ k

[Q]) 但因為 C

= [A] + [complex]

K = [complex]/{[A][Q]}

即 [A] = C

/(1 + K[Q])

[A*] = k

C

/(k

+ k

+ k

[Q])(1 + K[Q]) 式 1-27 所以 Φ = fk

C

/{(k

+ k

+ k

[Q])(1 + K[Q])} 式 1-28 若無 Q，則Φ趨近最大值Φ

Φ

= fk

C

/(k

+ k

)

Φ

/Φ = (1 + K

[Q])(1 + K[Q])，或

F

/F = (1 + K

[Q])(1 + K[Q]) 式 1-29 依據上式，

F

/F = 1 + (K

+ K)[Q] + K

K[Q]

式 1-30

或 [(F

/F) - 1]/[Q] = (K

+ K) + K

K[Q] 式 1-31

若以[(F

/F) - 1]/[Q]對[Q]作圖，即可求得 K

與 K。

1.9 實驗目的

本論文為「分子探針製備與探討」中的先期研究，計畫探討能否 將核黃素（Flavin）修飾於原子力（Atomic force microscope，AFM）

顯微探針上，藉以觀察葡萄糖去氫酶（Glucose dehydrogenase，GDH）

或儲鐵蛋白（Ferritin）進行能量轉換時，是否涉及形變或分子力變異。

為評估此構想之可行性，我們先將核黃素與其結構類似物（簡稱類核

黃素）修飾於一般大面積電極上，以了解電極有無類核黃素之差異性。