科技部補助大專學生研究計畫研究成果報告

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科技部補助

大專學生研究計畫研究成果報告

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計畫：

名稱

以 3D-QSAR 與半合成方法由紅麴色素開發新穎性之黑色素生成抑制劑

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執行計畫學生：溫孟蓉

學生計畫編號： MOST 105-2815-C-041-005-B

研究期間： 105 年 07 月 01 日至 106 年 02 月 28 日止，計 8 個月指導教授：李冠漢

處理方式：本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公

開查詢

執行單位：嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學藥學系(含碩

士班)

中華民國 106 年 03 月 29 日

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真菌如 penicillin, lovastatin 和 cyclosporine 所產生的二次代謝物中，發現許多具有高度價值的成份，可廣泛應用於食品加工和藥物開發中。紅麴菌 Monascus sp 的二次代謝產物中包含了 monacolin K, 橘黴素(citrinin)，和 azaphilone 類色素，其中具有 azaphilone 核心結構的色素表現出高度的生物活性。本計畫透過藥效團的建立和分子模擬等理論計算方式，以 3D-QSAR 的方法從多種 amino acid 和 amino alcohol 衍生物中，選擇出最適合的含氮側鏈，提供後續半合成的方式將含氧的 azaphilone 類色素，轉換為紅麴含氮衍生物的新穎性色素，作為黑色素生成抑制劑，未來可進一步進行調劑與有效性、安全性測試，提供後續藥粧產品的開發。

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貳、研究動機與研究問題

(一) 研究動機

長久以來，膚色較深的人種一直在尋找可以淡化、減少黃色黯沉與局部肝斑及曬斑等問題的治療方式。近年由於消費者對於化粧保養品知識的增長以及健康、環保的考量，化粧品市場的潮流崇尚自然，

人們逐漸捨棄以化學合成物為主成分的化粧品，以天然物質中的有效成分取而代之。

紅麴為我國、日本等亞洲國家使用歷史悠久的真菌，紅麴在發酵過程中，會產生醇、酸、酯與其他酵素水解物質，這些發酵產物，能造成發酵產品的芳香味與甘甜口感，因而成為常用的食品材料。紅麴發酵過程所產生的二次代謝物具有許多有益於人體的活性成分，更成為近年來生技藥粧產業研發重點項目，如：紅麴色素與 monacolin，

可分別用為食用色素與膽固抑制劑。目前的研究與產品開發多集中在食品加工、降膽固醇、降血壓等代謝症候群的應用。

紅麴色素是經衛福部認可的天然色素，由紅麴菌 Monascus sp 生 產，經萃取純化而得。主成分依色澤分為紅麴紅色素、紅麴黃色素、

紅麴紫色素等 3 類，隨著各類色素所佔之比例不同，因而產生由橙色到暗紅色等多樣化之紅麴色素產品系列，是安全性極高的食用色素或食品著色劑(Lin et al, 2008)。¹

表 1 紅麴菌 Monascus sp. 中主要色素的主成份

色素成分

紅色素 Monascorubramine, rubropunctamine 橙色素 Monascorubin, rubropunctatin 黃色素 Ankaflavin, monascin, xanthomonascin A

2014 年 Jo DJ 等人發表了有關於紅麴橙色素的含氮衍生物可抑制黑色素生成的文章，其中提到 glutamic acid 的衍生物對於 melanin-synthesizig pathway 中的 tyrosinase 有 dose-dependent 的抑制效果(Jo et al, 2014)。²由上述對於美白功能性的探討的成果，激發我研究紅麴菌二次代謝物應用於藥粧產品的好奇心。

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(二) 研究問題

O N

COOH

COOH O

O O R

O O

O R

圖 1 紅麴橙色素具 Azaphilone 骨架含氮衍生物的合成

由 Jo DJ 的報導，上圖紅麴色素的 glutamic acid (紅色部分) 衍生物，具有美白潛力。因此，本研究將聚焦於具有 Azaphilone 核心結構的紅麴色素的含氮衍生物與美白功能的探討。

計畫目標與實驗流程如圖 2 在於利用電腦理論計算與模擬方法，找出在理論中最適當的含氮側鏈，未來能半合成出含氮的紅麴橙色素衍生物，亦即新穎性的色素，作為美白化粧品的功能性成分。

圖 2 本研究計畫目標與實驗流程圖

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參、文獻回顧與探討

紅麴菌屬(Monascus spp.)於1884年由法國學者van Tieghem 所建立與命名(Lin et al.,2008)，在分類學上紅麴菌屬於真菌界 (Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、散囊菌目 (Eurotials)、

紅麴菌科 (Monascaceae)。根據近年來研究顯示，紅麴菌可以產生許多有益人類的代謝產物，請見表2 (潘子明，2005)³—

表 2 紅麴菌所產生的高價值代謝物質紅麴菌所產生的高價值代謝產物一、菌體外水解酵素

二、一級代謝產物(不飽和脂肪酸、醇及酯類化合物) 三、二級代謝產物：

1. 色素(紅色、橘色和黃色等) 2. 抗腐敗菌物質(monascidin) 3. 膽固醇合成抑制劑(monacolins) 4. 降血壓物質(GABA)

5. 天然抗氧化劑，如黃酮酚(flavonoids) 6. 降血糖及其他尚待鑑定生理活性物質

除了可產生芳香物質的一次代謝物(也可稱一級代謝物、初級代謝物)外，二次代謝物(也可稱二級代謝物、次級代謝物)近年來亦為研究的焦點。具有生物活性的物質例如monacolins可為膽固醇合成抑制劑、GABA與葡萄糖胺可為降血壓物質、monascidin可抗食物腐敗等，

但許多紅麴菌會產生的橘黴素(citrinin)卻會造成肝腎毒性，使紅麴菌的使用在安全性上產生疑慮。目前經由菌種的鑑定與分析，以及培養條件的調整，發現特定紅麴菌產生橘黴素的產量可以大幅降低，克服此一不良物質形成危害(Chen et al., 2008)⁴。

紅麴色素為紅麴菌中重要的二次代謝物，其為azaphilones類化合物，基本上可分為黃色、橘色、紅色與無色四大類色素(Mostafa &

Abbady, 2014)⁵，有色的三類色素分別為黃色的monascin、ankaflavin；

橘色的 rubropunctatin 、 monascorubrin ；紅色的 rubropunctamine 、 monascorubramine，其化學結構如下所示(Vendruscolo et al., 2015)⁶—

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圖 3 紅麴黃、橙、紅色素的化學結構圖

這些紅麴菌azaphilones類化合物除可做為食用色素，同時被發現具有抗微生物活性、抗氧化功能、可添加製成保健食品用以改善血壓、血糖、血膽固醇的穩定；與本研究相關的文獻中，最重要的是Jo DJ發表於2014的 “Biological evaluation of novel derivatives of the orange pigments from Monascus sp. as inhibitors of melanogenesis”，以紅麴菌橘色色素進行化學修飾後可產生具抗黑色素生成的物質。

而欲將含O的azaphilone類化合物，轉換為含N的衍生物，應可利用1992年 Lin TF與1996年Juzlova P兩個研究團隊所發現紅麴色素的生合成方法，利用紅麴橙色素與相對應的 amino acid 或 amino alcohol，經由半合成方法得到(Lin et al.,1992；Juzlova et al)^7,8。

近年有賴於新科技的發展，電腦強大的運算能力與生物資訊的結合，普遍地應用於藥物開發的領域中，相關的硬體、軟體和應用方法，

本研究計畫指導教授李冠漢於 2003 年回顧了近年來電腦輔助藥物設計的工具和例子 ⁹，也以α-Methylene-γ-butyrolactone 骨架之具抗癌潛力化合物為例，推導出藥效團模型(Lee KH & Huang BR, 2003)¹⁰。 T. Langer 和 R.D Hoffmann 於 2006 年也提到了應用藥效團模型在藥物研究的成功案例 (Langer & Hoffmann, 2006)¹¹，由此可知，透過電腦理論計算和分子模擬進行虛擬的篩選，能節省大量時間與金錢，提高了藥物開發的效率。

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肆、研究方法及步驟

(一) 材料與方法

(1) 圖型工作站： Intel^® Xeon^® CPU W3565@3.20GHz ； RAM 20.0GB；windows 64 位元作業系統

(2) 軟體：BIOVIA (Accelrys) Dicvovery Studio 2.5 (3) 計算模組：

I. ChemBioDraw Ultra 11.0,ChemBio3D Ultra 11.0 II. Molecular Properties Calculation

III. Conformation Generation

IV. Common Feature Pharmacophore Generation V. 3D QSAR Pharmacophore Generation

VI. Ligand Pharmacophore Mapping

(二) 酪胺酸酶抑制劑藥效基團的建立

首先用 ChemBioDraw Ultra 11.0,與 ChemBio3D Ultra 11.0 軟體建構文獻中所有具有 azaphilone 核心結構的含氮衍生物共 30 個。再從中挑選 4 種 amino acid、5 種 amino alcohol 衍生物共 9 個化合物作為 Training set (圖 5)，用於建立藥效團模型，所選化合物的抑制百分率為 11%~41%，最後從所有含氮衍生物中挑選 15 個化合物作為 Test set 用來評估藥效團模型的好壞。

圖 4 本研究計畫實驗流程圖

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Compd.2 抑制活性(%)=25.0% Compd.7 抑制活性(%)=11.0%

圖 5 Training set 結構圖

Training set:具有 azaphilone 核心結構的含氮衍生物及對酪胺酸酶抑制活性的百分率

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在進行藥效團分析之前，以 Calculate Molecular Properties 分析化合物的性質，提供資訊以利後續創建模型使用。而考量到分子與受體結合時的剛性、柔性問題，以及儘可能的涵蓋所有活性區域，使用 Conformation Generation 計算出構型異構物的數量，

以 Best Quality 對 training set 進行構像分析，將 Energy Threshold 限制為 20kcal/mol，是指分子與受體結合時，分子構像能量的最大和最小的差值在 0~20kcal/mol 之間，而構像數目限定在 255 以內。

根據先前 Calculate Molecular Properties 對化合物官能基的分析，顯示氫鍵受體(Hydrogen-bond acceptor, HBA)和疏水中心 (Hydrophobic, HP)藥效團的基本元素，以此選擇作為建構藥效團的參數。先以 Common Feature Pharmacophore Generation 將化合物提供的共同特徵進行疊合，產生最多 10 個藥效團假說 (Hypothesis)作為藥效團初步的評估。

欲得到具可預測性的 QSAR 模型，首要步驟要從已知的 SAR 資料中挑選 training set，而模型的品質好壞與挑選的分子有高度相關性，因此必須謹慎地挑選這些化合物。建立 3D QSAR 藥效團假說所需的 training set 的挑選指引準則包含:

(1) 至少 16 個化合物以確保統計顯著性。

(2) 化合物的活性範圍須涵蓋四個數量級，且每個數量級須由三個化合物表示。

(3) Training set 須包含活性最好和最差的化合物。

(4) 若要選擇兩個具相似活性的化合物，則兩者須在結構上有明顯差異，否則只能挑選兩者中活性較高者。

參考以上的指引準則後，接著使用 3D QSAR Pharmacophore Generation 將一系列分子的生物活性值輸入(參考 Jo DJ 等人於 2014 年發表的報導中，抑制酪胺酸酶表現的百分率作為活性資料)，計算出符合 3D 空間中特定範圍內的構型特徵的 10 個假說，

選取其中相關性最高的假說進行分析，以期產生更精確的藥效團模型。

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伍、實驗結果與討論

Training set 中一系列化合物包含不同類型的 azaphilone 類含氮衍生物，將活性不確定值(activity uncertainty)設置為 3 後建構出九個的藥效團如表 3。九個藥效團中只有一個假說含有四個特徵：三個氫鍵受體(HBA)和一個疏水中心(HP)，其餘有八個都含有三個特徵：七個假說都有兩個氫鍵受體(HBA)和一個疏水中心(HP)；一個假說有一個氫鍵受體(HBA)和兩個疏水中心(HP)。一般來說，理想的藥效團模型的 Hypothesis cost 應盡可能地遠離 null cost 而接近 fix cost。如果與 null cost 之間差值（Δcost）大於 40，說明該藥效團模型在統計學意義上有 75％〜90％的可能反映了客觀的情況，因此被認為是可靠的。得到的 10 個藥效團的 Δcost 都大於 80，而且相關性 Corr.> 0.87，因此這些藥效團都有可能是理想的模型。

表 3 Training set 建立的 9 個藥效團模型

以 3D QSAR Pharmacophore Generation 計算模組建立藥效團模型

Hypothesis Corr. RMS Cost* ΔIdeal Δnull Feature I 0.978495 0.105442 50.0448 0.0529 81.1491 2HBA；1HP II 0.90143 0.186921 50.1493 0.1574 81.2536 2HBA；1HP III 0.897614 0.190498 50.1554 0.1635 81.2597 2HBA；1HP IV 0.880574 0.206202 50.1839 0.192 81.2882 2HBA；1HP V 0.892489 0.206816 50.1862 0.1943 81.2905 2HBA；1HP VI 0.875228 0.208142 50.1869 0.195 81.2912 3HBA；1HP VII 0.895146 0.207358 50.1905 0.1986 81.2948 2HBA；1HP VIII 0.88787 0.211379 50.1949 0.203 81.2992 1HBA；2HP IX 0.871497 0.213141 50.1969 0.205 81.3012 2HBA；1HP

*Total cost for ideal hypothesis=49.9919

*Total cost for null hypothesis=31.1043 ΔIdeal=Total cost-Fixed cost

Δnull=Null cost-(-Total cost)

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最佳的藥效團(Hypothesis I)有最高的 ΔCost、最低的 Error cost、

最低的 RMS 差值和最高的相關係數(0.978)，其特徵包含了兩個氫鍵受體(HBA)、一個疏水中心(HP)(圖 6)。將文獻提供的抑制百分率 (Measured% )與藥效團模型評估所得的估計值(Estimated % )作一線性迴歸直線，得到相關係數 r=0.98，y =1.1449x-3.272 的迴歸直線方程式(圖 7)。

圖 6 Training set 中度抑制活性的化合物(2)和最佳藥效團模型的疊合結果

表 4 最佳藥效團模型對於 Training set 9 個化合物的抑制活性百分率評估結果

Name Fit Value No. of

Conformers Enan Mapping Estimated (%)

Measured

(%) Error 2 5.41 229 + [30 10 20 ] 24.16 25 -1.0 7 5.70 4 + [27 07 20 ] 12.55 11 +1.1 11 5.75 107 + [07 33 29 ] 11.18 15 -1.3 13 5.67 94 + [33 13 23 ] 13.41 13 +1.0 15 5.35 81 + [07 34 28 ] 28.18 29 -1.0 20 5.14 18 + [13 07 26 ] 45.35 41 +1.1 21 5.21 22 + [10 22 31 ] 38.70 38 +1.0 30 5.14 25 + [07 22 29 ] 45.32 40 +1.1 31 5.41 98 + [24 07 20 ] 24.18 26 -1.1

Hydrogen bond acceptor (HBA)

Hydrophobic center (HP)

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圖 7 比較最佳藥效團模型評估 Training set 所得到的抑制活性數值：

Measured Inhibition(%)和 Estimated Inhibition(%) 作線性迴歸得到相關係數 r=0.98 的迴歸直線

在 Training set 中所有高抑制活性的化合物(>38%)皆被預測為高抑制活性；所有中抑制活性化合物(25-35%)都被預測為有抑制活性；而所有無抑制活性(11-23%)都被預測為無抑制活性(表 4)。由此可知，此假說對於 Training set 抑制的活性具有可預測性。而藥效團假說建立的目的不只用來精準地預測 Training set 化合物的活性，還能進一步確認 Test set 是否具有抑制活性的參考。

接著，採用先前的文獻中對酪胺酸酶具抑制活性的化合物共 15 個作為 Test set，以 Ligand Pharmacophore Mapping 模組計算出 Ligand 和最佳藥效團模型(Hypothesis I )的契合程度來評估抑制的活性百分率：抑制活性最高的測試化合物(Comp.25)具有 45.6%的抑制活性，經由藥效團的評估抑制活性為 42.69%；而其他測試化合物 (Comp.8)擁有 23%的抑制活性，經由藥效團評估的抑制活性百分率為 23.26%(表 5)。

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表 5 最佳藥效團模型對於 Test set 15 個化合物的抑制活性百分率評估結果

No. Measured Estimated Error Activity scale

Estimate

scale Fit Value 2 25 24.16 -1.0 ** ** 5.41 4 22 16.98 -1.3 * ** 5.57 6 38 36.51 -1.0 *** *** 5.23

7 11 12.55 1.1 * * 5.70

8 23 23.26 1.0 * ** 5.43 9 17 14.21 -1.2 * * 5.64 10 18 14.69 -1.2 * * 5.63 11 15 11.18 -1.3 * * 5.75 13 13 13.41 1.0 * * 5.67 15 29 28.18 -1.0 ** *** 5.35 19 22 17.55 -1.3 * ** 5.55 24 20 20.67 1.0 * ** 5.48 25 45.6 42.69 -1.1 *** *** 5.17 26 42 39.53 -1.1 *** *** 5.20 31 26 24.18 -1.1 ** *** 5.41

圖 8 比較最佳藥效團模型評估 Test set 所得到的抑制活性數值：

Measured Inhibition(%)和 Estimated Inhibition(%) 作線性迴歸得到相關係數 r=0.98 的迴歸直線

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將文獻提供的抑制百分率(Measured% )與藥效團模型評估所得的估計值(Estimated % )作一線性迴歸直線，得到相關係數 r=0.98，y

= 0.96x - 0.8103 的迴歸直線方程式(圖 8)，從結果得知，具有高度抑制活性的化合物與最佳藥效團(Hypothesis I )契合程度高。Test set 中抑制活性百分率最高的兩個化合物 (Comp.25,26) 與藥效團模型 (Hypothesis I )的疊合如圖 9。由化合物與藥效團對接所得的 Fit value 和 Mapping information 挑選最適合的含氮側鏈，作為未來半合成的指引。

圖 9 Test set 最高抑制活性的兩個化合物(25,26)和最佳藥效團模型的疊合結果 Hydrogen bond acceptor

(HBA)

Hydrogen bond acceptor (HBA)

Hydrophobic center (HP)

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陸、結論

在具 azaphilone 骨架的含氮衍生物中，依照結構特徵與抑制活性百分率挑選出 9 個酪胺酸酶抑制劑作為 Training set，利用 Discovery Studio 2.5 軟體，建立具有兩個氫鍵受體(HBA)和一個疏水中心(HP)的藥效團模型，該模型成功地預測 15 個 Test set 的抑制活性百分率，由此可選出最高抑制活性百分率的兩個測試化合物 (Comp.25,26)為最適合的含氮側鏈，或是能夠藉由資料庫的搜尋，

尋找新的酪胺酸酶抑制劑先導物(lead compounds)，未來可繼續以半合成的方式，把含氧的 azaphilone 類色素轉換為紅麴含氮衍生物的新穎性色素，作為黑色素生成抑制劑，再進一步進行調劑與有效性、

安全性測試，提供後續藥粧產品的開發。

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柒、參考文獻

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