由於黑色素具有某些方面的生理保護作用，例如：吸收紫外光之輻 射能以減緩發炎反應以及減少超氧陰離子（· O2-）之自由基清除作 用等。為顧及黑色素原具之生理保護作用，中草藥在美白方面之科 學研究並不由黑色素細胞之細胞毒性著手。
本研究根據 Dopachrome 法（156），於緩衝溶液種類、乙醇含量 及測定波長稍作調整，將 0.4 M 的 HEPES 緩衝溶液
（N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]，25℃
下 pKa=7.5，pH 範圍 6.8-8.2）以 pH 6.8 的 Sorensen 氏磷酸鹽緩 衝溶液取代；乙醇 50 µl 更改為 25 µl；波長以 450 nm 替代 475 nm，
並加以確效。
1. 吸收波長的選擇
圖二十一、二十為 1 ml 純水、1 ml, 2.5 mM 酪胺酸, 0.9 ml pH 6.8 磷酸緩衝溶液及 0.1 ml, 1000 U/ml 酪胺酸 混合，反應 0 分鐘及 30 分鐘之紫外光光譜圖，30 分鐘後，應有 Dopachrom 生成。圖二十二顯示，於 475 nm 及 450 nm 二處之吸光情形類 似，該區間無尖銳的吸收峰。圖二十三為 60 分鐘內波長 475 nm 及 450 nm 吸光值的比較，隨著反應時間增加，兩種波長下的吸 光值均穩定的上升，同樣都在 50 分鐘左右達到飽和，吸光值變 動很小，圖中顯示達反應平台時，波長 475 nm 及 450 nm 之吸 收分別為 0.17、0.15，均呈現可辨識的吸收。由於 ELISA 分析 儀上所附的濾鏡為 450 nm，用 UV-Vis 測試結果顯示，本實驗以 450 nm 波長進行酪胺酸 活性抑制的測試是可行的。
2. 溫度、時間與吸收度的關係測定
於室溫（25℃）及 37℃的恆溫裝置下，紫外光-可見光光譜儀記 錄 450 nm 下，120 分鐘內的吸光值變化，如圖二十四。圖中所示，
37℃下於 50 分鐘即達反應平頂，而 25℃則於 120 分鐘後尚進行反 應中，故本實驗選擇反應快、時間短的溫度 37℃，作為進行酪胺酸 活性抑制實驗的反應溫度。此外，由標準曲線建立中，發現反應 30 及 50 分鐘時均呈現良好之線性。本研究選擇總反應時間為 30 分 鐘，即可與到達反應平頂（plateau）50 分鐘之效果相等，且更節省 時間。
3. 甲醇對酪胺酸 抑制活性的影響
紫外光-可見光光譜儀設定為 Kinetic 模式，波長 450 nm，每 5 分鐘測定一次，實驗分別於 25℃及 37℃下進行，由 120 分鐘內吸光 值變化，進而計算出反應速率常數 k（abs/t），結果如圖二十五、二 十六。在 25℃與 37℃下，由不同濃度 10%、5%、1%之甲醇與純水 比較，結果顯示含 1%之甲醇與純水對照組，兩者對酪胺酸 抑制活 性的影響並無差異（p＞0.05），而 10%、5%甲醇對酪胺酸 抑制活 性的反應，有抑制的情形。
4. 酪胺酸 濃度的選擇
五種不同濃度的酪胺酸 1000、2000、3000、4000 及 5000 U/ml，37℃下進行酪胺酸-酪胺酸 反應 90 分鐘，結果如圖二十七。
如圖所示，任何一個濃度均可在 60 分鐘達到飽和，因高濃度下干擾 性相對的提高，本研究選擇最小量的酵素濃度，使用其作為酪胺酸 抑制活性測試中之酵素濃度，既不受干擾且不浪費，同樣可達到實驗
圖二十一 酪胺酸與酪胺酸 反應，0 分鐘之紫外光光譜圖
圖二十二 酪胺酸與酪胺酸 反應，30 分鐘之紫外光光譜圖
圖二十三 37℃下，不同波長對酪胺酸 抑制活性吸光度的影響
Time (min)
0 10 20 30 40 50 60 70
Abs (A)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
0.20 λ=450nm λ=475nm
圖二十四 120 分鐘內不同溫度下反應之吸光值比較圖
Time (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Abs (A)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
37 oC 25 oC
圖二十五 25℃不同濃度甲醇對酪胺酸 反應速率影響關係圖
圖二十六 37℃不同濃度甲醇對酪胺酸 反應速率影響關係圖 Methanol concentration (%)
0% 1% 5% 10%
k (abs / t (min))
0.00000 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.00010 0.00012
Methanol concentration (%)
0% 1.00% 5% 10%
k (abs / t (min))
0.00000 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.00010 0.00012 0.00014
圖二十七 37℃時間-吸光值之酵素動力學關係圖
不同濃度的酪胺酸 分別加入含有 37.5 µl 2.5 mM 的酪胺酸、37.5 µl, pH 6.8 的 Sorensen 氏磷酸鹽緩衝溶液、50 µl 純水及 25 µl 乙醇的混 合液，於波長 450 nm 下之測量結果
Time (min)
0 20 40 60 80 100
Abs (A)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
1000 U/ml 2000 U/ml 3000 U/ml 4000 U/ml 5000 U/ml
目的，為最佳的選擇。
5. 酪胺酸 抑制活性標準曲線的建立
以紫外光-可見光吸收光譜法，對 125、250、500、750、1000 U/ml 五種不同濃度之酪胺酸 試樣進行測試三次，測得各濃度及其所對應 的吸光度，經線性回歸分別於反應 30 分鐘及 50 分鐘製得酪胺酸 標準曲線結果如圖二十八、二十九所示。反應 30 分鐘時之線性相關 係數大於 0.999，最高濃度（1000 U/ml）與最低濃度（125 U/ml）
的三次分析之變異係數（CV%）分別為 1.05%與 4.28%，反應 50 分 鐘時之線性相關係數為 0.995，最高濃度與最低濃度之變異係數
（CV%）分別為 0.66%與 4.76%，顯示此標準曲線在酪胺酸 抑制 活性之分析上精密度高，可應用於本研究酪胺酸 抑制活性的測定。
6. 中藥萃取物對酪胺酸 活性抑制的測定
（1）具有抑制酪胺酸 活性的植物及中草藥
維生素 A 酸（Retinoic acid）（190191）在酪胺酸 活性低的淡色皮 膚會增加酪胺酸 的活性，而在酪胺酸 活性高的深色皮膚會降低 酪胺酸 的活性，月桂酸硫酸酯鹽（Sodium Lauryl Sulfate）也有 類似的結果，但沒有維生素 A 酸明顯（190）。
Cabanes 等人（192）研究表皮上的酪胺酸 ，發現香豆酸
（m-Coumaric acid）會與酵素形成化合物，降低酪胺酸 的活性。
從丁香（Syzygium aromaticum Merr. et Perry）與益智仁（Alpinia
oxyphylla Miquel）得到的活性成分丁香酚（Eugenol）及 Yakuchinone
A；從歐甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的匍匐莖得到的 Glabridin；從 肉桂（Cinnaminum cassia B.）的樹皮得到的桂皮醛圖二十八 酪胺酸 反應 30 分鐘之活性標準曲線圖 Methanol concentration (%)
0% 1.00% 5% 10%
Concentration ( U/ml )
0 200 400 600 800 1000 1200
Abs (A)
Concentration ( U/ml )
0 200 400 600 800 1000 1200
Abs (A)
（Cinnamaldehyde）；以及從其他香莢蘭基類（Vanillyl）的化合物 如阿魏酸（Ferulic acid）、薑黃素（Curcumin）、Yakuchinone B 皆 可抑制酪胺酸 的活性（156）。
一些日本當地杏科的植物像日本櫻（Prunus yedoensis）、黃土 樹（P. zippeliana）、扁桃（P. amygdalus）、桃（P. persica）、杏（P.
armeniaca）等，具有抑制酪胺酸 的作用，其中 P. zippeliana 的
葉子同時能有效的抑制 dopachrome 的自動氧化作用（157）。另外，日本桃科植物 Murica rubra 的乾燥葉與樹皮，可抑制黑色素形成過 程中 dopachrome 的自動氧化作用，並且顯示具擬超氧歧化 的活 性（158。
從熊果葉（Arctostaphylos uva-ursi（L.））得到的成分除了熊 果 （Arbutin）外，還有沒食子酸（Ellagic acid）亦會抑制酪胺酸
的活性（160）。石南科（Ericaceae）的植物中除了熊果葉外，A.