中藥美白化妝品其安全,品質與療效之評估; The safety and quality studies of Chinese herbs and their in vivo evaluations of whitening effect on human subjects

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(1)壹、緒. 言. 第一章皮膚與黑色素一、皮膚的構造：皮膚總面積大約是 1.6-2.0 平方公尺 1 ，皮膚包覆著我們的身體，（）. （2,3）. 可以防止外來的各種刺激、傷害而發揮保護人體的功用. 。. 皮膚的層次（Layers of the skin）1,2,3,4 （. ）. 皮膚由外而內大致分為表皮、真皮和皮下組織三層，另外有一些附屬器官，如毛髮、指甲、皮膚腺體（汗腺、皮脂腺）等存在。. 表皮（Epidermis）表皮可分為兩大層，角層（表皮的最終排泄物）及 Malpighi 氏層（活的表皮），是皮膚最表淺的一層，其平均厚度大約 0.1~0.3 mm （4）. 。表皮由上而下依次可以分為：角質層（stratum corneum）、透明. 層（lucid layer）、顆粒層（stratum granulosum）、棘皮層（stratum （5） spinosum）與基底層（stratum basale）（圖一）。（1,6）表皮包括了三種完全不同的細胞（圖二），角素形成細胞. （Keratinocytes）、黑色素細胞及朗格罕氏細胞（Langerhans cells）。. 角素形成細胞：能產生角素，負責表皮許多保護的功能，是構成表皮主要的部分。角素形成細胞由基底層轉移到表層時，會漸漸變為扁平狀，胞橋小體（desmosomes）在細胞間的接連也扮演一個重要的角色。角素. - 83 -.

(2) 形成細胞主要是形成皮膚最外層的角質層，是表皮的排泄產物，通常是死的角素細胞。角質層的細胞由含硫較少的纖維蛋白及含硫較多的非結晶型蛋白質（amorphous protein）所組成，是所有纖維蛋白質中最強韌的構造之一，雖然它很薄，但保護能力卻是很強的。. 黑色素細胞：產生黑色素，吸收可見光與紫外光，作為保護的色素。黑色素細胞位於基底細胞層、毛囊、腦膜及眼睛的脈絡膜層，是由胎兒的神經脊（neural crest）分化而成，黑色素在此細胞中形成。. 朗格罕氏細胞：負責吞噬作用，且在表皮與局部淋巴結間的抗原（antigen）運送中，扮演一個與免疫有關的重要角色。. 二、皮膚的生理功能皮膚是人體最外的一層組織，其主要功能有保護、調節體溫、分泌、吸收、排泄代謝、感覺及參與免疫及反應等作用，它的正常功能對於身體的健康至關重要，身體的異常情況也可以由皮膚反映出來（1,2,9）. 。. （一）保護作用皮膚參與全身的防禦性反射機制，防止機械性和化學刺激以及光、電、熱及微生物等各種環境因子的侵襲。例如表皮角層柔韌而緻密，真皮層韌的纖維組織使皮膚有抗拉性及彈性，皮下脂肪富有彈. - 84 -.

(3) 角質層透明層朗格罕氏細胞黑色素細胞. 顆粒層. 棘皮層. 基底層. 圖一表皮的組成（6）. - 85 -.

(4) （a）. （b）. （c）. 圖二表皮的三種不同的細胞（4）（a）角素形成細胞（b）朗格罕氏細胞（c）黑色素細胞. - 86 -.

(5) 性，能減輕或抵消外界的衝擊。由皮脂腺分泌的皮脂，能使皮膚滋潤，避免角質層的乾燥皺裂，還能防止皮膚內的水分過度蒸發和體外水分的向內滲透。由於皮膚表面偏酸性（pH 5.5-7.0）以及表皮皮質層的緻密堅韌，不僅能阻止致病菌侵入體內，還使附著於角質層上的致病菌隨著角質自然脫落而離開體表，同時皮脂腺及汗腺分泌物在角質層上構成一層防菌抑菌乳化膜，它所含的乳酸、脂肪酸及碳酸性液體可以抑制微生物的繁殖生長。角質層細胞排列緊密，且不易傳熱和導電。此外，皮膚中的黑色素能吸收紫外線而避免光線對皮膚傷害。. （二）分泌和排泄作用人體皮膚的汗腺和皮脂腺具有分泌和排泄功能。如在高溫環境中，身體可通過發汗散熱。由於皮膚表面偏酸性以及表皮皮質層的緻密堅韌，能阻止致病菌侵入體內，排除代謝物。皮脂腺具有油脂、脂肪酸、蛋白質及少量膽固醇，其分泌量於青春期達高峰，其後逐漸減少，因性激素的影響，皮脂與汗液乳化後在體表形成乳化膜，可使角質層柔軟、潤澤肌膚，可防止微生物、某些化學品及水分侵入皮膚，皮脂分解後脂肪酸還能抑制細菌的生長與繁殖。. （三）吸收作用皮膚雖然有屏障作用，能防止水分及某些化學物質進入體內，但皮膚並非是絕對嚴密而不滲透的組織，仍有一些物質可以被皮膚選擇性地吸收，一般而言，其吸收量不僅與皮膚表面特徵有關，同時也與其吸收部位、皮膚的含水量、環境的溫度、產生吸收現象的物質之理化性質等等有密切相關。皮膚表面的乳化膜是由油脂類和乳酸類等成. - 87 -.

(6) 分（如氨基酸、尿素、尿酸、乳酸、氨、脂肪酸、固醇類、磷脂）構（M-1）. 成. ，加上位於角質層與顆粒層、表皮與真皮之間的雙重基膜等天. 然屏障，所以一般物質即使透過角層，也難以進入真皮及體內。水溶性物質，難以透過皮膚而被吸收，而脂溶性物質如維生素 A、D、K 及激素、油脂等，則較易被吸收，從美容品的劑型上看，軟膏、面膜要比水劑、粉劑吸收要好得多。但值得提醒的是，某些皮膚病的發生以及在表皮炎症和損傷的情況下，會降低皮膚的屏障作用而增加皮膚的吸收. （2 ）. 。此外，塗抹外用美容藥品後，以塑膠薄膜覆蓋或濕敷法，. 可使皮膚中含水量增加，有利藥品於皮膚上的吸收。. （四）代謝作用皮膚除儲藏大量的水分和脂肪外，還有蛋白質、醣類、維生素、無機鹽類，這些物質都參與整個身體的代謝，所以，當身體有代謝的障礙時，會導致功能減退或皮膚病的發生；相對的，皮膚的代謝發生障礙時，也會影響身體的代謝。皮膚中的水分主要集中在表皮和真皮中，約佔 70%左右，是整個身體儲藏水分的重要器官，約佔人體水分的 18-20%。因此，對整體的水分也具有調節作用。當身體脫水時，皮膚中大約有 5-7%的水分進行血循環以補充其水量，皮膚也是鹽類的主要儲存庫，在各種無機鹽中，氯化鈉含量最多，此外，皮膚中的鉀、鈣、鎂、銅、磷等均參與皮膚中生物新陳代謝過程。皮膚還是血醣的儲存庫。當體內血醣增高時，大量的血醣就進入皮膚，如果血醣減少，皮膚中的血醣就迅速地釋放入血液。皮下組織是人類主要的脂肪儲存中心。在營養缺乏時，表皮內的. - 88 -.

(7) 7-脫氫膽固醇（7-dehydrocholesterol）經紫外線照射後能轉為維生素 D。皮膚中的各種組織的主要成分是蛋白質，如白蛋白、球蛋白、膠原蛋白、彈力硬蛋白、角蛋白等，同時皮膚在蛋白質代謝過程中，生成之化合物如尿素、肌酸、胺基酸、脂肪. 、磷酸等蛋白。. （五）感覺作用皮膚內含有豐富的神經纖維網及各種神經末稍，其中亦含有感受器，如觸感小體（Messner’s corpuscles）及環層小體（Pacini’s corpuscles），能將外界刺激引起的神經衝動傳入大腦皮質後而產生痛、癢、麻、冷、熱等各種感覺。在日常生活中，人體皮膚極易受到外傷、細菌感染或炎症、溫度變化、日光照射等因素的傷害，過度刺激會使皮膚感覺喪失以及皮膚老化。. （六）調節體溫作用正常的體溫對維持身體生理功能非常重要。在中樞神經系統的控制下，健康人的體溫保持一定。當外界氣溫升高時，皮膚毛細血管擴張度增加，由身體內部流入皮膚的血液增多，散熱量加速，使體溫不致於過度升高。當外界溫度降低，皮膚中毛細血管收縮，微循環血流量減少，散熱量減低，以防止熱量散放過多及體溫過度降低。. （七）免疫作用皮膚是人體重要的免疫器官。皮膚免疫可分為特異性和非特異性免疫兩種。特異性免疫是指皮膚能抵抗各種抗原，如細菌、異物、生物毒素、異體的組織細胞等侵襲時將產生免疫反應。其中，參與體液 - 89 -.

(8) 免疫反應的活性物質主要是存在於血漿及體液中的免疫球蛋白抗體（immun globulin，lg），及少量的補體（complement），參與細胞免疫反應的活性物質有多種，如巨噬細胞活化因子（macrophage activating factor）、巨噬細胞集聚因子（macrophage aggregating factor）、游走抑制因子（migration inhibitory factor）、趨化因子（chemotactic factor）、干擾素（interferon）、淋巴毒素（lymphotoxin）等。非特異性免疫在個體出生時就具備，又稱天然免疫，初步與外來異物接觸即可發生反應，如皮膚及粘膜。當皮膚血液中的吞噬細胞、溶菌減退或在病理情況下，就會引起感染、炎症、紅腫以及各種皮膚疾病。. 三、皮膚的顏色 Toda 等人於 1972 年表示（7），不同人種的一般膚色取決於下列幾個因素： a.皮膚表面的反射係數 b.表皮及真皮的吸收係數 c.表皮及真皮的散射係數 d.皮膚不同層的厚度（角層、表皮和真皮） e.吸收紫外光和可見光之組成成分的含量（角素、彈力蛋白、膠原蛋白、位於黑素顆粒和巨噬細胞裡的黑色素、核酸、類胡蘿蔔素、血紅素和脂質） f.表皮黑素顆粒（melanosome）分佈的數目、大小、形狀和型態。不同種族間之黑色素細胞（melanocyte）的數目並無差別。人類皮膚的顏色大部分導因於黑色素的含量，目前對於皮膚顏色. - 90 -.

(9) 的控制取決於外在化學物質的作用，能使黑色素生成酪胺酸（tyrosinase）量的增加或降低. （8）. 。皮膚的顏色並不是只靠黑色素來. 決定，身體內黑色素及氧化和還原的血紅素同時構成了正常的膚色。（2）. 在血液供應差，性腺機能減退時，會使膚色看起來較淺. 。. 在顯微鏡下觀察正常人的黑色素，必須在黑色素的色素顆粒隨著角素細胞到皮膚表面後才觀察得到。當黑色素細胞位於色素顆粒間的表皮層-真皮層交界面時，不能表現出皮膚”棕色”的顏色。黑色素是一（8）. 種保護色素，可過濾對角素細胞的細胞核有害的紫外光照射. 。. 四、人體色素形成的調節因子皮膚的色素是一種遺傳特徵，屬於種族性而非個體性的特徵。文化白種人上偏好如深色曬黑的皮膚（像）或東方人偏好較淡的膚色。曝曬於陽光下所造成的光致癌性（photocarcinogenic）、光老化（photoaging）及黑色素在光保護（photoprotection）的研究越來越清楚，導致在人體色素調節上，越來越有興趣（10）。已知皮膚的黑色素可減少穿透表皮層的紫外線總量，及抑制因光誘導產生 DNA 損傷的活性氧自由基（11,12,13）。許多皮膚的研究表示，罹患皮膚癌的機率在膚色較淡的人種要比深色皮膚的人種高（14,15）。. （一）色素的組成與紫外光的反應曬黑（tanning）是曝曬於陽光下的一種明顯反應，就。然而這種反應因個人的色素表型而有所不同。type I or II的皮膚會曬傷但較不. - 91 -.

(10) 會變黑，膚色深的人（type IV-VI）則是曬黑但較不易曬傷。Fitzpatrick 之皮膚表型分為六類，包括膚色較淡的 type I-III及膚色較暗的 type （16）. IV-VI，表一為 Fitzpatrick 之皮膚表型分類. 。. 色素的反應決定在皮膚上構成黑色素的物質，尤其是刺激黑色素形成所造成的延遲性變黑反應（delayed tanning response）16 。這（. ）. 個反應，受因紫外線照射而導致產量增加的多種因荷爾蒙影響。此外，已證實酪胺酸（一種抑制黑色素形成的酵素）的活性，直接與皮膚色素形成及黑色素含量有關。於黑色素細胞中，深色皮膚酪胺酸含量比淺膚色的高. （18,19）. 。. 表一 Fitzpatrick 之皮膚表型分類（Fitzpatrick’s classification）皮膚表型. 顏. 色. 特徵. Type I. 白. 總是曬傷，從不曬黑. Type II. 白. 通常曬傷，較難曬黑. Type III. 白. 有時輕微曬傷，有時曬黑. Type IV. 中等棕色. 少曬傷，常常曬黑. Type V. 深棕色. 非常少曬傷，總是曬黑. Type VI. 黑. 從不曬傷，總是曬黑. 曬太陽會使膚色變深，與未曝曬前皮膚相比之下，長期曝曬於陽光下的皮膚，其黑色素細胞中 DOPA 被活化的數目明顯的高了許多（20）. 。 Friedman 等人認為（21），人體黑色素細胞經紫外線照射後有直. 接的反應，這些對模擬紫外線光照有反應的細胞，隨著光照的增加，細胞的增殖下降而色素的形成增加。Libow 等人研究表示（22），對紫外線有反應的黑色素細胞，在細胞增殖及黑色素形成上都會增加。由. - 92 -.

(11) 於兩種不一樣的反應，發現對細胞照射紫外線（波長 290-320 nm）不會造成細胞死亡，由於合成有絲分裂成分的 G2 期被制止而使黑色素細胞增殖受抑制，而且照射紫外線使酪胺酸. 活性與黑色素含量增. 加，在不同皮膚類型的黑色素細胞是沒有差別的。Musk 等人指出（23）. ，黑色素含量低的人在模擬日光照及紫外線下，黑色素瘤細胞殺（24）. 死的敏感度較含量多的高，Yohn 等人. 也發現，白人的黑色素細. 胞對於紫外線造成的 DNA 受損比其他人種敏感。. （二）紫外光對表皮形成因子（Epidermally Synthesized Factors）的誘導許多證據顯示於曝曬於紫外線下，會刺激表皮細胞合成荷爾蒙（hormones）、細胞動素（cytokines）及生長因子（growth factors）。紫外線誘導角素形成細胞、合成間白素-1（interleukin-1，IL-1）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α），而 TNF-α對角素形成細胞的傷害上（例如：凋亡，apoptotic），扮演重要的角色（25-28）。培養人類黑色素細胞時也會合成 IL-1α及 IL-1β（29）。發現用紫外線照射時，會提高角素細胞形成纖維母細胞成長因子（basic fibroblast growth factor）（30）。較新的研究顯示，紫外線照射角素形成細胞，會增加內皮細胞素（endothelin-1，ET-1）及促黑色素細胞激素（melanotropins），尤其是黑色素細胞刺激荷爾蒙（α-melanocyte stimulating hormone，α-melanotropin，α-MSH）和促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的合成（31-34）。所有的因子都顯示會影響體外試驗人體黑色素細胞的增殖和/或新生。基於這些發現，可知人體黑色素細胞對光照的反應是直接的，而對紫外線誘導副分泌素（paracrine）、自泌素（autocrine）及內分泌素（endocrine） - 93 -.

(12) 的反應是間接的（如：圖三）。. （三）人體黑色素細胞的荷爾蒙調節 1. 固醇類荷爾蒙的角色許多報告顯示黑色素瘤細胞對許多荷爾蒙有反應，包括固醇類荷爾蒙的雌性激素（estrogen）、醣皮質固醇（glucocorticoids）、維生素 A 類（retinoids）、前列腺素（prostaglandins）及黑色素細胞刺激荷爾蒙（α-MSH）35-43 。另外維生素 D3（cholecalciferol）的形成源（. ）. 於皮膚曝露在陽光下。維生素 D3 水解代謝產物，可調節 UV 光照後的黑色素生成反應（44,45）。人體黑色素細胞對維生素 D3 有特殊的接受器，而且黑色素細胞對 1,25 (OH) 2 維生素 D3 有降低酪胺酸活性的反應（10）。證據顯示性腺激素如：雄性素（androgens）和雌性素（estrogens），影響皮膚色素的沉著已有很長一段時間（46,47），此荷爾蒙會使乳頭（areola）和生殖器（genitalia）的顏色變深，即使局部使用也一樣（48）。女性在懷孕期間，性腺荷爾蒙的改變與其膚色變深有關，像是黑皮病（melasma）；男性去睪丸者，在陽光照射後並不太會適當的曬黑，但給予男性荷爾蒙則可變黑（2,49）。. 2. 發炎介質（inflammatory mediators）的作用臨床觀察發現，發炎後的造成高度黑色素沉著（post-inflammatory hyperpigmentation）的現象，與免疫發炎介質相關（50）。已經證實免疫發炎細胞動素 IL-1α，IL-1β，IL-6 與 TNF-α對培養的人體黑色素細胞的影響（51）。這四種細胞動素造成了與劑量相關的作用，會降低細胞增殖和降低酪胺酸. 活性，並伴隨著減少酪胺酸、TRP-1 和 - 94 -.

(13) TRP-2 的量. （52）. 。之後發表了人體黑色素細胞合成 IL-1α和 IL-1β，推. 測這些已知由其他表皮細胞合成的細胞動素，可能與自泌素、副分泌腺般調節黑色素細胞的功能相似. （29）. 。. 二十烯酸（eicosanoids）是另一群發炎物質，其主要來源是花生酸（arachidonic acid），一種二十碳不飽和脂肪酸，基本的二十烯酸是前列腺素（prostaglandins，PGs），另外也產生血小板凝集素（thromboxane，TX）及白三烯（leukotrienes，LT）。PGs 是環氧化（cyclooxygenase）路徑下的產物，能有效抑制人類黑色素腫瘤的（37,40）. 生長. 。經紫外線照射後發現皮膚的 PGD2，E2，F2α有增加的情. （53,54）. 形. 。PGs 影響鼠類黑斑中黑色素細胞的黑色素生成，PGE1 和. E2 是有效的刺激者，PGA1 和 PGD2 是強力的抑制者（55）。. 3. 纖維母細胞成長因子的角色 bFGF 為正常人體黑色素細胞的絲狀物（mitogen）和刺激人體黑色素細胞成長的自泌素（56,57）。Halaban 等人表示（57），bFGF 是在紫外線的照射下，由角素形成細胞合成，而且 bFGF 是人體黑色素細胞在有絲分裂中所產生。. 4. 內皮細胞素與黑色素細胞之關係 Imokawa 等人於 1992 年（31）及 Yohn 等人於 1993 年（34）證實了 ET-1 是由人體黑色素細胞所產生，Imokawa 等人（58）又提出照射紫外光或給予 IL-1 會提高 ET-1 的產生，而且 ET-1 影響黑色素細胞的有絲分裂。它們也表示（59），利用受體結合的方法實驗時，ET-1 對人體黑色素細胞有專一性的接受器（specific receptor），會刺激黑色素形成。近年來報告指出，ET-1 會增加酪胺酸 - 95 -. 及 TRP-1 這兩個與黑.

(14) 色素形成相關之酵素的表現。. 5. 促黑色素細胞激素的角色已知促黑色素細胞激素，特別是α-和β-MSH，對於脊椎動物皮（60）. 膚，包括哺乳類，的黑色素形成有作用 1964 年指出. 。Lerner 與 McGuire 於. （61 ）. ，對人體注射高濃度的α-MSH 和β-MSH 或 ACTH，（62）. 結果會使皮膚變黑。Levine 等人（1991）證實. ，注射α-MSH 的. 類似物，名為[Nle4,D-Phe7]-α-MSH，會導致黑色素形成增加，尤其是在照射陽光後更為明顯。. 五、黑色素的形成受紫外線照射會導致皮膚癌，表皮的黑色素使皮膚不受到紫外線輻射的壞影響。黑種人中皮膚癌很少，他們似乎較能忍受化學及物理傷害。黑色素只由黑色素細胞製造（圖四），這些細胞散置於表皮的基底細胞之間。毛髮的色素是由毛囊球中的黑色素細胞所衍生。瘢痕處無黑色素細胞，故不會有顏色（2）。表皮黑色素生成及代謝的形態如圖四所示，黑素顆粒由黑色素細胞合成後，經由兩種主要的途徑進行轉移（圖五），一是向上轉移（upward transfer）至角素細胞，進入表皮層，最後隨著皮膚剝落；另一種為向下轉移（downward transfer）到真皮內而被黑色素吞噬細胞（melanophage or. - 96 -.

(15) 圖三人體黑色素細胞經光照與荷爾蒙調節因子之簡圖（10） KC：角素形成細胞 MC：黑色素細胞 Paracrine：副分泌素 Endocrine：內分泌素. - 97 -.

(16) melanophores）所吞噬，較不常見，且僅發生在某些狀態下（像是炎症反應）10 。在轉移的惡性黑色素瘤，皮膚可能會變深色，這是由（. ）. （2）. 於大量的黑素顆粒沉積在真皮的黑色素吞噬細胞內所致. 。. （一）黑色素細胞的分佈黑色素細胞由神經細胞分化的，從胎兒早期的神經脊（neural crest）長出，經真皮而最後進入基底細胞之間。黑色素細胞由長而分支的管狀突，稱為樹狀突（dendrites），這些突起在表皮細胞中穿梭並充滿黑素顆粒。這些樹狀突向章魚般將角素形成細胞包圍起來且將黑色素「注入」這些細胞。在角化過程中，當基底細胞向外移動（圖六），這些顆粒將散開且被分解成細的粒子（2,8）。黑色素細胞的密度並非在任何部位的表皮都一樣（2,8），也並非每個細胞的活動力（activity）都一樣，紫外線可照射到的部位密度會增加，但無性別上的差異（圖七）（8）。人類約有 20 億個黑色素細胞，平均每平方公厘有 1500 個（63），通常位於皮膚基底層、頭髮毛囊、軟腦膜和眼睛脈絡膜中都有黑色素細胞存在（4）。黑色素細胞在人一生中大約會減少 10%，所以老年人的皮膚較白也較易受陽光傷害（8）。各種族之間，黑色素細胞數目並無差別，皮膚顏色較深的種族並非含有較多的黑色素細胞。黑種人的黑色素細胞比白種人（Caucasian）的大，所含的黑色素也比較多，合成黑色素的器官很發達，所以可產生大且成熟的黑色素顆粒，這是黑人較黑的原因。不同種族間皮膚顏色不同，是因為（1）黑色素細胞之黑色素生成的活動力、（2）黑素顆粒的數目、大小、（3）黑色素沉積到黑素顆粒的型式以及（4）成熟的黑素顆粒對周圍的角素形成細胞的貢獻（17），而不是因為黑色素細胞數目不同。. - 98 -.

(17) （64）. Fitzpatrick 等人發表. ，在黑色素細胞與角質細胞間有很特殊的. 功能與構造，即每個表皮黑色素細胞，會分泌黑色素顆粒進入周圍的角素形成細胞，此黑色素與一群鄰近角素形成細胞（約 36 個）的配對，稱為”表皮黑色素單位（epidermal melanin unit）”。Breathnach 於 1980 年將此親密的關係稱為”表皮共生（epidermal symbionts）” （65）. 。當黑素顆粒轉移至表皮的角素形成細胞後，會受到膜的包圍而. 聚集在一起，這些構造稱為”黑色素顆粒複合物（melanosome complex）”. （8）. 。. （二）酪胺酸酪胺酸. 的性質是一個熟知的單氧化（monooxygenase），它在. phenol 氧化成 benzoquinone 的過程中扮演催化的角色（66）。在黑色素形成過程中，酪胺酸. 催化酪胺酸變成. 3,4-dihydroxyphenylalanine（dopa）的氫氧化反應與 dopa 變為 dopaquinone 的氧化反應（67,68）。它是一種具有兩種鍵結位置的立體異構. （67,72）. ，也是一種含銅的氧化. ，活性中心位於結構中成對的. 銅離子（69-71）。以不同來源所得到的酪胺酸，包括人類表皮及 B-16 老鼠的黑色素瘤細胞，表現出三個特性：（a）它具有對 cresolase 的酵素活性上之延遲性，（b）對於 dopa 作為必要的共同因子（cofactor），（c）抑制過量酪胺酸導致的 cresolase 活性（67）。酪胺酸. 由黑色素細胞的核醣體所合成，在粗內質網中發現，它. 是利用細胞質或平滑內質網轉移到高基氏體內的特定位置上，然後再分裂釋放至黑色素細胞的細胞質中，成為黑色素顆粒的前驅物，酪胺酸. 與其他酵素一樣，合成時，最初為四疊體不活化型態之酵素前驅. - 99 -.

(18) 11. 1. 10. 9 角素形成細胞 8. 2 黑色素顆粒. 7. 6. 3. 5 黑色素細胞. 圖四表皮黑色素生成及代謝的形態圖（8） 1.黑色素母細胞（melanoblasts）的轉移 7.黑素顆粒的形成 2.黑色素母細胞分化成為黑色素細胞 8.黑素顆粒的黑化 3.黑色素細胞進行有絲分裂 9.黑素顆粒的轉移 4.酪胺酸（tyrosinase）的合成 10.黑素顆粒的退化 5.黑素顆粒（melanosome）基質合成 11.黑色素隨著角質 6.酪胺酸的傳送層剝落而移除 - 100 -. 4.

(19) 向上轉移. 向下轉移. 圖五黑素顆粒兩種主要進行轉移的途徑（10）. - 101 -.

(20) 黑素顆粒形成的階段高基氏體. 平滑內質網. 粒線體. 顆粒內質網. 圖六黑色素細胞之結構圖（8）. - 102 -.

(21) 頭頸. 上肢軀幹. 包皮手指下肢. 陰囊. 腳背. 腳底. 圖七黑色素細胞在人體分佈的密度依部位不同而有差別（8）（mean number / mm2 ± S.E.）. - 103 -.

(22) （73）. 物。McGuire 等人. 在對青蛙表皮的研究報告中指出，酪胺酸. 活. 化的過程，發生在由高基氏體上分裂、釋放至黑色素細胞的細胞質，成為黑色素顆粒的前驅物以前。Mishima 與 Imokawa. （74）. 對於 B16. 老鼠黑色素細胞瘤的研究中證實，在形成黑色素顆粒的前驅物之前，將酪胺酸. 活化，此步驟對於黑色素的生成過程來說是必需的。. 皮膚純化出的酪胺酸. 在性質上與其他天然的酪胺酸有所不. 同。它具有高度的專一活性，每毫克蛋白質每分鐘形成 228 nmol 的 dopa，蕈類中的酪胺酸. ，其活性會受到多巴胺（dopa）的影響，. 亦會被過量的酪胺酸抑制。而人體的酪胺酸，活性不會受到多巴胺影響，也不會被過量的酪胺酸抑制. （67,75）. 。. （三）黑色素的形成機轉黑色素的形成是一種有過程需要：酪胺酸、酪胺酸. 參與作用的過程（圖八）。這個生化及氧分子。酪胺酸將酪胺酸氧化成. dihydroxyphenylalanine（即 dopa）。然後 dopa 轉變為 dopachrome，再形成 indoles，最後成黑色素（2）。其中 tyrosinase 催化 dopa 變成 dopachrome 是速率限制步驟，而 dopachrome 經由自動氧化反應轉變為 melanin。黑化是一種簡單的皮膚黑色素形成的過程，頭髮、眼睛、皮膚的顏色亦為黑色素所造成，通常黑化的過程在黑色素細胞中進行，此細胞中含有黑色素顆粒的橢圓形胞器（organelles），此胞器中具有產生黑色素所需的物質（8,72）。黑色素結構緊密、不溶的高分子量聚合物，而且總是與蛋白質結合（8）。黑色素依構造可分為真黑色素（eumelanins）、嗜黑色素（pheomelanins）和異黑色素（allomelanins）。哺乳類的黑色素由 - 104 -.

(23) eumelanons 和 pheomelanins 兩種化學成分，依不同比例組成。 allomelanins 則存在於細菌與黴菌中. （63）. 。. Eumelanons（圖九）含氮元素，為黑色或褐色的色素蛋白質，幾乎不溶於所有溶媒。酪胺酸經由 dopaquinone 產生 5,6-dihydroxyindoles（DHI），DHI 經氧化與聚合作用產生了 eumelanins。Eumelanins 於人體中表現在深色的頭髮、眼睛、內耳、黏膜和黑色素瘤細胞等處。脊椎動物中的以鳥類較常發現（75）. eumelanins，而爬蟲類、兩棲類和魚類較少有 eumelanins. 。. Pheomelanins（圖十）含硫元素，為黃-淡紅色的色素蛋白質，可溶於鹼，主要亦由酪胺酸衍生而來，由酪胺酸-黑色素路徑的中間產物（dopaquinone）與 cysteine 結合，形成 5-S-cysteinyl dopa。 Cysteinyl dopas 經 oxidative cyclization 產生 1,4-benzothiazine。黃色色素蛋白是由 1,4-benzothiazine 組成，於哺乳類的毛髮（如：天竺鼠、牛、山羊、馬、鹿和人類的紅頭髮等）和鳥類的羽毛（雞、雉和鷓鴣等）中含量較高（10）。. （四）影響黑色素生成的因素 1. 酪胺酸. 活性的抑制. （1）金屬與酪胺酸. 活性的關係. Seiji 等人於 1963 年發表，黑素顆粒中具有許多種離子，特別是銅，其中，銅在酪胺酸內作為一修補群，其他離子並無明顯生物學上的特性，推測可能是當作一種微弱酸性的陽離子交換劑，進而影響黑色素性質（8）。Jara 等人（76）也發現 Zn（II）會抑制酪胺酸. 的氫氧化作. 用（hydroxylation），而 Ni（II）與 Co（II）卻會促進酪胺酸 - 105 -.

(24) 圖八黑色素細胞中之 Eumelanogenesis 及 Pheomelaongenesis 之示意圖（10）. - 106 -.

(25) 圖九 DHI 與 DHICA 變成為 eumelanin 前的早期結構（oligomers）10 （. 圖十 5-S-cysteinyldopa 變為 pheomelanin 前的早期結構（oligomers）（10） - 107 -. ）.

(26) 的氫氧化作用。酪胺酸. （69-71）. 為一種含銅的單氧化. ，銅離子為活性中. 心，故可與銅結合或競爭結合的物質就可以抑制酵素的活性（68）. （77 ）. 。如：鉛丹、汞鹽與銅離子競爭. 銅離子結合 6Mo7O24. 。-CO、-CN、-SH 可與. （78,79）. 。鉬酸銨（Ammoniun molybdate，（NH4）. 4H2O）78 、皮膚內之硫氫基（Sulfhydryl） 2 、麩硫胺（. ）. （）. 酸（Glutathione）80 及化妝品中作為美白原料的麴酸（. （81）. ）. 都會. 與銅結合而抑制酵素活性。. （2）酪胺酸. 抑制劑對酪胺酸活性的影響. 酪胺酸為黑色素形成所需的基本物質，酪胺酸存在使其無法與酪胺酸. 抑制劑之. 反應，生成黑色素。酪胺酸與酪胺. 結合的活性位置有三個（82）：（1）活性中心的銅，（2）酪. 酸. 胺酸上負價的α-COOH 與酪胺酸上正價的胺基酸（離胺酸、精胺酸、組織胺酸）殘基間的離子對，（3）酪胺酸上正價的α-胺基與酪胺酸. 上負價的胺基酸（麩胺酸或天門冬胺. 酸）殘基間的離子對。以對苯二酚（Hydroquinone）、熊果（arbutin）作為酪胺酸競爭酪胺酸. 的反應介質，其功能就如與酪胺酸. 的活性位置（81,83）。Diphenol、4-甲基兒茶酚. （4-methyl-catechol）等 Dopa 類似物會與 Dopa 競爭酪胺酸上的活性位置而降低酵素活性（84）。另外，杜鵑花酸（Azelaic acid）上的單甲基脂類亦會與酪胺酸競爭酵素上的活性位置（82）. 。. 2. 還原劑對黑色素生成的影響. - 108 -.

(27) 維生素 C（L-ascrobic acid）為一還原劑，具有抗氧化的能力，可將 Dopaquinone 還原成 Dopa 而抑制黑色素形成，或將深色的（9）. 氧化型黑色素還原成淡色的還原型黑色素. ，化妝品中亦用來作. 為美白。其他能與 Dopaquinone 形成安定的化合物亦能影響黑色素之生成，如：他巴坐（Methimazole）、半胱胺酸（Cysteine）、離胺酸（Lysine）、N-methyl-2-Mercaptoimidazole、丙硫氧嘧啶（6-Propylthiouracil）、麥角硫因（Ergothioneine）、硫氧嘧啶（85-87）. （2-Thiouracil）等. 。. 3. 促進表皮內黑色素的排除正常的表皮細胞由基底層生成至角質層死亡脫落需要約三至四星期的時間（2,63）。凡能幫助角質脫落、促進表皮細胞代謝的物質，皆可增加表皮黑色素排除的速度，如果酸（88）等。. （五）抑制黑色素形成的機轉故依目前所知，防止黑色素形成的方法，計有下列四種： 1. 降低 tyrosinase 的活性、抑制 tyrosinase 的合成，或使用 tyrosinase 的拮抗劑。 2. 降低黑色素細胞的功能，使用具有細胞毒性（cytotoxic）的物質，來減少黑色素細胞的增殖或使其不能產生黑色素。 3. 減少或防止 dopa 的自動氧化（autooxidation）。 4. 抑制皮膚的發炎反應，如紫外光刺激後導致的紅腫。. - 109 -.

(28) 第二章自由基、抗氧化與美白一、自由基與活性氧（一）自由基與活性氧的定義及種類自由基醫學的開始於 1969 年由 McCord 和 Fridovich 成功自牛紅血球細胞中分離出超氧歧化. Superoxide Dismutase（SOD）89 ，（. ）. 自此自由基研究在醫學扮演一重要角色。生物體在正常代謝過程中會形成自由基（free radical）與活性氧（reactive oxygen species），當體內的自由基與活性氧過量時，則易與細胞膜上之多元不飽和脂肪酸作用，而引發脂質過氧化（lipid peroxidation）的作用，造成膜傷害及擾亂許多代謝途徑，導致人類許多疾病的發生（90-94）。自由基乃是指具有一個或多個不成對電子的原子或分子（95），可依其未成對電子所在位置區分成以碳、氧、氮或硫為中心之自由基（96）。大部分自由基具有高度之反應性，處於較不穩定的狀態，會與非自由基反應而產生新的自由基以形成連鎖反應（chain reaction）。活性氧是指反應性較三重態氧強的含氧分子。大氣中是以較安定的三重態氧（triplet oxygen，3O2）存在，此氧分子可經由電子轉移及能量轉移兩種反應途徑而活化（97）。前者包括氧分子連續接受電子所形成的一系列中間產物及反應物，如超氧陰離子、過氧化氫及脂質過氧化自由基。後者則指由基態之三重態氧吸收能量激發為單重態氧（singlet oxygen，1O2）。活性氧中有些也是自由基，這些含氧之自由基亦稱為氧自由基（oxyradicals）。氧自由基與其他非自由基活性（98,99）氧合稱為反應性氧分子群（reactive oxygen species，ROS）。（100）自由基與活性氧的種類很多（表二及表三），大部分的自由基. - 110 -.

(29) 與活性氧處於較不穩定的狀態，大多是瞬間產生，半衰期很短. （101 ）. ，. 反應性較非自由基分子高，易與其它分子發生反應，對人體有重大影響的可歸納為五種. （102）. （圖十一）：. 1. 超氧化物自由基 (Superoxide anion radical) ：· O2通常是最先也是最常產生的自由基，體內的吞噬細胞及粒線體中的電子傳遞鏈等均會產生超氧化自由基。雖然其半衰期極短，可是自由基會造成連鎖反應，而接著產生的二級產物、三級產物等，即會造成傷害。人體內含有 Mn-SOD、CuZn-SOD 可有效轉換· O2-成為 H2O2，再由過氧化氫. (Catalase) 或麩氨基硫過氧化. (Glutathione. peroxidase) 加以轉化為無害物質，如 H2O 等。. 2. 過氧化氫 (Hydrogen peroxide) ：H2O2 除了由 SOD 作用轉化而來之外，體內 H2O2 也可能來自吞噬細胞的吞噬作用、醯基的β-氧化作用 (beta-oxidation of fatty acyl CoA) 及其他氧化還原循環反應 (redox cycle) 。過氧化氫對細胞的傷害性較大，因其能通過細胞膜和體內轉運中的鐵和銅 (transition ions) 發生 Fenton 反應（103）而產生破壞性極大的羥基自由基 (· OH) 。 Fe2+ + H2O2. Fe3+ + ⋅OH + OH. 過氧化氫可活化 myoglobin、hemoglobin 及 heme protein，使之成為高氧化態的含鐵化合物 Fe（IV）或 Fe（V），而這些化合物會促使細胞內的脂質過氧化或引發膜上之脂質過氧化。. - 111 -.

(30) 3. 羥基自由基 ( Hydroxyl radical) ：· OH 羥基自由基可以說是最活躍的自由基之一，除了上述自由基轉換造成之外，照射 X-ray 也會產生大量· OH。它主要會造成體內脂質過氧化而破壞細胞，而且會和醣類、氨基酸、磷脂質、核醣體、有機酸等任何生物體內物質反應。近年來研究指出，多元不飽和脂肪酸（PUFA）的過氧化作用和羥基自由基有很密切的關係，一般認為一個· OH 會因連鎖反應造成上百個 PUFA 的過氧化。. 4. 單重線態氧 (Singlet oxygen) ：1O2 是體內穩定的氧受紫外線照射後會大量產生不穩定的物質，單重態氧極易與氫反應，直接攻擊不飽和脂肪酸，造成自由基物或脂質氧化。. 5. 過氧化脂質 (Lipid hydroperoxide) ：LOOH 過氧化脂質可以說是許多自由基物反應後的產物，而且多半發生在細胞膜上的多元不飽和脂肪酸。過氧化脂質可以再斷裂成其他自由基物形成有害的醛類、鹼類或其他產物。過氧化脂質或其他產物會直接和蛋白質、酵素、核酸作用，導致細胞甚至器官的變性或死亡。. （二）活性氧與自由基的來源近年來有許多研究報告指出，自由基在癌症、心血管疾病及老化上，均扮演極重要的角色（95,104），而人體在代謝過程中亦會產生活性氧與自由基，在正常狀態下，生體之抗氧化系統會與自由基對抗取得一個平衡，以維持生體正常生理，唯當此平衡遭到破壞時，活性氧與自由基就會攻擊細胞組織、細胞膜及危害基因物質，造成細胞變異、 - 112 -.

(31) 傷害，甚至死亡，而此平衡之破壞害，日積月累不斷形成與累積，亦可能導致多種疾病之發生. （105）. 。. 活性氧與自由基之來源可分為內生性與外生性二部分。在內生性方面，生物系統於好氧之條件下，有兩種方式可產生活性氧與自由基 (106). 。. 1. 偶發性之產生生體行好氧性呼吸時，氧分子經一連串步驟由粒線體電子傳遞鏈、微粒體、細胞色素 P-450 或其他酵素系統，接受四個氫原子或四個電子而還原成水，在電子轉移之過程中，會依序產生超氧陰離子（· O2-）、過氧化氫（H2O2）及氫氧自由基（· OH），而較複雜之生合成或代謝過程中，亦會產生其他之自由基（107）。. 2. 需要性之合成人體會因活化細胞或殺死一些細菌之需要而產生活性氧，如白血球在活化時會產生· O2-、H2O2 與 HOCI 活性氧，此類自由基在殺死侵入人體之病菌上扮演重要之角色. (108-110). ，另外像淋巴細胞（111）、纖維. 細胞（112）、血管內皮細胞（113）亦會產生·O2-。此外，人體內的某些氧化酵素之代謝，也會產生 H2O2 ，如 Glycolat oxidese、Xanthine oxidese 及以 D-amino acid oxidase (114) ，而生物體罹患疾病時，亦會產生許多之活性氧與自由基（104）。. - 113 -.

(32) 表二活性氧之分類. （100）. 自由基. 非自由基. · O2-. superoxide. H2O2. Hydergen peroxide. · OH. Hydroxyl radical. 1. Singlet oxygen. · HO2. Hydroperoxyl radical. LOOH. Lipid hydroperoxide. ·L. Lipid radical. Fe=O. Iron-oxygen complexes. · LO2. Lipid peroxyl radical. HOCl. Hypochlorite. · LO. Lipid alkoxyl radical. · NO2. Nitrogin dioxide. · NO. Nitric oxide. · RS. Thiyl radical. ·P. Protein radical. O2. - 114 -.

(33) 表三活性氧的產生方式. （100）. 活性氧的種類. 產生方式. 氧經由催化或不經由催化得到一超氧自由基（Hydroperoxyl radical）個電子反應 · O2（· HO2） O2+e→· O2- ↔· HO2 (pK=4.8). 氫氧自由基，· OH. 水的自由基化；氫過氧化物經由金屬催化分解；超氧化物和 NO 產生作用 H+ NO+· O2-→ONOO- →· OH+ NO2. Alkoxyl 和 peroxyl radicals • LO LO2•. 氫過氧化物經由金屬催化分解. 過氧化氫，H2O2. 超氧的岐化反應；糖的氧化. 鐵氧複合物，Fe=O. 血紅素；肌紅蛋白等等….. 單重態氧， O2. 光敏感的氧化反應；兩個過氧基分子產生的作用；亞氯和過氧化氫產生作用. 脂質和蛋白質的氫過氧化物. 脂質和蛋白質的氧化. 二氧化氮自由基，NO2•. 過氧基和 NO 作用；空氣污染和抽煙. 氧化氮自由基，· NO. 氧化氮合成；亞硝基硫醇；空氣污染. Thiyl radical，· RS•. 硫醇化合物失去丟掉一個氫原子. 蛋白質自由基. 蛋白質失去丟掉一個氫原子. 1. - 115 -.

(34) 圖十一氧分子之氧化還原及激發狀態（102）. - 116 -.

(35) 外在環境中自由基之來源包括空氣污染、化學藥劑、香煙、煙霧、紫外光照射及農藥等. （115）. 。對人體損傷最大的空氣污染源是二氧化氮. （NO2）和臭氧（ozone）116 。臭氧會與不飽和脂肪酸（PUFA）反（. ）. 應產生自由基，再形成臭氧群及誘導脂質的自動氧化。高能量之幅射線會引起人體傷害，因人體含水約百分之七十，而輻射線會將水解離成氫原子、氫氧自由基、氧分子及過氧化氫等，造成細胞的損傷。煙草經燃燒後，產生多環芳香羥（polyaromatic hydrocarbon，PAH）、一氧化氮（NO）、NO2 及過氧化物自由基。一氧化氮與二氧化氮亦會與過氧化氫作用，形成氫氧自由基，其會攻擊肺部組織，使之失去彈性且引起水腫，如圖十二，亦會引起動脈粥狀硬化、心臟病及腦中風（119）. 。食品之調理方法如不當，亦會使人體在食入該食品後，在體內產. 生自由基，如肉類經火烤、油炸、炭烤時會產生 PAH，其一旦進入體內經代謝後會形成自由基，如由 Cytochrome P-450 與 Fe3+結合之酵素作用，PAH 會被氧化成陽離子自由基（Cation radicals），再進而與各種親核物（nucleophiles）作用，當其與 DNA 結合時，即會引起突變或導致癌症之形成（120）。日常生活中許多化學物質若誤攝入體內時，也會造成自由基的產生。如常用的除草劑 paraquat 及 diquat 經氧化還原後會產生· O2（121）. ，而四氯化碳在體內代謝也會產生多種自由基（122），且會誘發急. 性肝細胞毒性（123）。. （三）活性氧與自由基對生物體損傷作用的機制當生體曝露於活性氧和自由基之環境下時，自由基會直接或間接的攻擊生物分子而造成傷害。細胞膜脂質上之不飽和鍵結是自由基作用的主要目標，而其它如蛋白質、DNA、RNA、酵素等亦是活性氧 - 117 -.

(36) 與自由基之攻擊標的。此外，過量之活性氧所產生氧化之逆境（93）. （oxidative stress）亦會導致細胞傷害及死亡影響如圖十三所示. 。自由基對細胞的. （124）. 。. 由於自由基的發生及作用是連續的動作，一個自由基的產生，將引發另一個新的自由基產生。此新生成的自由基會繼續和周圍的分子反應，產生更多的自由基。雖然自由基的半衰期極短，但因反應性大且自由基形成的氧化反應對生物體會導致嚴重的生理衰老和病理性變化，仍有可能造成細胞的損傷、對蛋白質和. 的損害及對核酸和染. 色體的破壞，導致器官及身體極大的傷害。活性氧與自由基對生物體之脂質過氧化作用及對蛋白質分子、核酸分子之氧化傷害機制概述如下： 1. 對脂質之過氧化作用不飽和脂肪酸較飽和脂肪酸更易受到自由基之攻擊，細胞膜上磷脂質之不飽和雙鍵位置即為容易受到自由基攻擊之所在，例如，氫氧自由基之過量產生會引起脂質過氧化作用，膜上脂質和蛋白質遭到破壞而引起動脈粥狀硬化，該氧化作用亦會使 ATPase 等酵素之活性改變，而離子通過率也隨之改變。多元不飽和脂肪酸受到自由基攻擊後會形成脂質自由基，而且氧會與這些自由基反應而形成過氧化自由基（peroxyl radicals）及氫過氧化物（hydroperoxide），這些化合物會繼續進行連鎖反應而導致膜的損壞（125）。四氯化碳也會導致肝臟微粒體（microsome）的氧化而形成丙二醛（malondialdehyde，MDA）（126）. ，此為脂質過氧化之二級產物，會與蛋白質、氨基酸和 DNA 反. 應，並與老化、致突變（mutagenesis）和致癌（carcinogenesis）有關連（127）。. - 118 -.

(37) 煙霧及紫外線形成臭氧（Ozone formation from. 肺部的反應（Pulmonary responses）. Smog and UV radiation）. 肺功能損傷減少肺容積增加呼吸道阻力增加表皮滲透性發炎支氣管再活化. 增加呼吸病症及呼吸道感染的敏感性黏液鼻炎慢性咳嗽. 圖十二吸入空氣污染源對呼吸道功能的影響（118）. - 119 -.

(38) 2. 對蛋白質分子氧化傷害. 於氧化狀態下，蛋白質之胺基酸殘基會受到多種氧化修飾，許多活性氧和自由基藉氧化蛋白質的-SH 基而改變其結構與功能性，如眼球水晶體穿透度之喪失. （128 ）. ，而氫氧自由基亦會攻擊胺基酸殘基，此. 外，蛋白質與過渡金屬鍵結時，亦會加速形成。脂肪酸氧化產生之氧化烷基 (alkoxyl) 和過氧化自由基會與蛋白質反應，形成脂質-蛋白質自由基，其後又會導致蛋白質之交聯（cross-linking）和聚合化（polymeration）反應，如胱胺酸和組胺酸之側鏈即可經自由基之誘（129）. 導形成蛋白質自由基而發生此二反應. 。. 3. 對核酸分子的氧化傷害. 活性氧與自由基亦會攻擊核酸分子，而造成 DNA 股之斷裂、 DNA 鹽基的修飾及交聯、DNA 鹽基與蛋白質結合及 DNA 斷股等傷害（130）。氫氧自由基攻擊 DNA 鹼基的產物（131），如圖十四所示，DNA 的胸腺嘧啶（thymine）殘基受到氫氧自由基攻擊時會形成 thymine glycol 或是 5-hydroxymethyluracil，而鳥糞呤（guanine）殘基受到氫氧自由基攻擊時會形成 8-hydroxyguanine。8-hydroxyguanine 在 DNA 複製時會導致鹽基 G-T 不正確之配對（132），並與致突變（131）及致癌作用有密切關係（133）。而 thymine glycol 的形成會阻斷 DNA 複製的進行（132），氫氧自由基導致 DNA 單股或雙股斷裂對於細胞的傷害非常重要，尤其是雙股 DNA 斷裂並無法由細胞修復。氫氧自由基也可以攻擊核膜上的脂質，並產生過氧化基（peroxyl）和氧化烷基（alkoxyl）自由基，反過來再與 DNA 反應。由於 H2O2 有較長的半衰期，因此在細胞中可以越過細胞膜穿透至細胞核，並與 DNA 上的鐵及銅離子反應，形成氫氧自由基，進一步攻擊 DNA 造成位置特異性之單股斷裂和鹽基修飾，如圖十五。 - 120 -.

(39) （四）氧化之逆境不論是內在因子或外在因子所產生的活性氧和自由基，在人體中也具有抗氧化防禦系統來預防這些傷害。正常狀態下，生物體所產生的自由基與抗氧化防禦系統，彼此之間會達到平衡以維持身體上之健康，然而此平衡會因營養不良或疾病而遭到破壞，該平衡就會傾向於（134）. 氧化端，此平衡失調狀態稱之為氧化之逆境. 。由於細胞中具有修. 復系統，可以辨認、修復或消除受到氧化破壞之分子，所以大部份之細胞尚可忍受輕度之氧化壓力，但劇烈之氧化逆境仍會傷害或殺死細胞，且可能導致許多疾病的發生。一般而言，人體的抗氧化物和促氧化物（prooxidant）的狀態通常會輕微的偏向後者，表四所示為人體抗氧化狀態的主要決定因子（135）. 。當氧化因子達到足以壓制生體中之抗氧化系統，則會對身體造. 成嚴重之影響（136）。雖然體內有一些修復系統可用來平衡這些傷害，但由於體內對活性氧具有生理需求性，因此並不會完全的被清除掉。故人體內的氧化傷害會不斷的形成，隨著年齡的增加而累積。氧化會因為（1）活性氧及/或自由基產生過多，（2）抗氧化系統因吸收過少或內生性產出降低而變弱以及（3）游離態過渡金屬增加而產生逆境。嚴重的營養不良會使人體缺乏抗氧化防禦系統所需的礦物質（如 Cu、Mn、Zn、Se）和維生素（維生素 C、E 及β-胡蘿蔔素）等。而當氧化逆境形成時，會促使活性鐵離子自組織儲存之鐵蛋白中釋放出來，並消耗體內之抗氧化物質，使組織傷害的情況加深（137）。. - 121 -.

(40) 致病性（老化）. 細胞受體功能改變變性產物碳水化合物多醣體去聚合反應破壞酵素的構造及功能. 蛋白質. 活性氧或自由基. （氧化作用）. （氧化作用）. 與血漿因子結合. 攻擊 DNA 轉換外來物成致癌物質. 鹼基結構改變. DNA 細胞斷裂突變變性. 阻斷 ATP 形成. 脂質過氧化. 形成醛類化合物. 細胞膜失去功能. 擴大自由基反應. 抑制 Ca-ATPase. 增加細胞內鈣濃度. 與蛋白質或核酸作用致癌化. 細胞死亡. 圖十三自由基對細胞的影響（124）. - 122 -. 形成對嗜中性球趨化的強化物質. 擴大組織傷害並形成惡性循環.

(41) 圖十四氫氧自由基攻擊 DNA 鹼基後的產物（131）. - 123 -.

(42) 氧化逆境. 受催化的銅和鐵離子在細胞內釋放. 經由在 DNA • 上 OH 的產生 H2O2 的產生是由於結合在 DNA 上的金屬離子轉變. 離子和 DNA 結合. 圖十五氧化的之逆境造成 DNA 受損的假說圖（131）. - 124 -. 產生 DNA 上的去氧核醣.

(43) 此外，香煙中富含多種自由基，故抽煙會增加肺部及其他組織的氧化逆境，而某些藥物與毒素在人體代謝中會加強氧化壓力，如除草劑 paraquat 經吸入肺部後，會造成大量之·O2-而造成肺部之傷害。氧化逆境會造成細胞的損傷及增加慢性疾病（如心臟疾病與癌症）的發生。因此，避免氧化逆境對於健康及防治疾病是很重要的。. （五）自由基與疾病與活性氧和自由基有關之疾病，據研究指出有神經退化性疾病（阿玆海默症、帕金森氏症、亨丁頓氏舞蹈症、肌萎縮症等）138 、（. ）. 癌症、心血管疾病（冠狀動脈心臟疾病、中風、缺血性心臟疾病、週邊血管疾病等）（139）、風濕性關節炎（90）、腸炎、免疫系統退化、腦機（140）能障礙、白內障（Cataract）、等，如表五所示。. 研究指出，抽煙所產生的超氧自由基及 NO2 是肺部疾病最主要的危險因子，包括造成肺氣囊腫（emphysema）、慢性支氣管炎（chronic （141） bronchitis）、氣喘（asthma）和肺癌（lung cancer）。另有研究. 指出，老年人保護眼球晶體之代謝成分（如：glutathione reductase）活性下降，造成纖維狀細胞之大量增生，患者晶體中 H2O2 之代謝能力亦隨之下降，加上因光分解所產生之超氧陰離子和氫氧自由基亦會造成晶體蛋白質之修飾作用，遂加速了白內障之生成（142）。研究指出，糖尿病患者血漿中常含有高量之脂質過氧化產物 MDA（143,144）。. （六）人體對抗自由基毒害的系統人體有一套完整對抗自由基毒害的系統，但因為污染源過多（如空氣、食物煙害）、營養攝取不完全、接受醫學上治療（藥物、放射. - 125 -.

(44) 表四人體抗氧化狀態的決定因素. （135）. 抗氧化效應. 氧化前效應. 基因因子. 基因因子. 飲食-飲食-• ˙抗氧化的維生素（A,C,E） • ˙脂質，特別是多不飽和鍵脂 • ˙抗氧化的食物成分和光化合肪酸物 • ˙兩價金屬（Cu, Fe） • ˙當抗氧化的金屬 • ˙氧化前營養物和光化合物 • （Se, Zn, Cu, Mn, Fe）環境-• ˙食品抗氧化物和添加劑 • ˙污染源 • ˙抽煙 • ˙紫外線酒類（含有抗氧化物）-酒精--. 運動--. 受傷、疾病、醫療行為-• ˙受傷 • ˙其他疾病 • ˙藥物、醫療處置（如：放射線治療）生理階段和狀況-• ˙未成熟 • ˙老化 • ˙過度的運動 ˙壓力-• ˙生理上 • ˙心理上. - 126 -.

(45) 表五自由基參與的各種疾病心臟循環系統. （145）. 腦. 心肌病變. 老年性癡呆症. 動脈硬化症. 巴金森氏症. Doxourubicin 毒性. 高血壓之血管疾病. 肺臟. 毛細血管擴張性失調症. 肺氣腫. （Ataxia-telangiectasia Syndrome）. 成人型呼吸窘迫症. 眼球. 支氣管肺臟形成不良. 白內障. Paraquat 毒性. 退化性眼底病變. Bleomycin 毒性. 新生兒視網膜病變. 礦物塵肺沉著症. 眼球出血. 腎臟. 皮膚. 重金屬之腎毒性. 燒、燙傷. Aminoglycoside 之腎毒性. 日光輻射. 腎臟移植排斥作用. 接觸性皮膚炎. 紅血球蠶豆症（G6PD 缺乏症）. Bloom 氏症候群毗喀紫質沉著症. 鉛中毒. 癌症. 瘧疾. 老化（退化性疾病）. Fanconi 貧血. 自體免疫疾病（紅斑性狼瘡）. 鐮刀型貧血. 缺血性貫流之組織傷害. 消化系統. （硬塞、手術等）. 四氯化碳之肝毒性. 輻射性傷害. 脂肪酸引起的胰臟炎. 腎絲球炎. Alloxan 致糖尿病. 維生素 E 缺乏症. 非類固醇抗發炎藥物之. 化學治療或放射治療副作用. 消化系統副作用. 汞中毒地中海型貧血所引起的鐵質過多症. - 127 -.

(46) 化學治療）及老化使得排除自由基的酵素減少等，造成自由基的堆積而導致許多病變. (115). 。以下簡述生物體內為了清除並抑制自由基而發. 展出的對抗系統，藉由一些不同的機轉來抵抗對細胞有害的威脅，包括酵素系統及非酵素系統（維生素系統）兩大抗氧化系統：. 1. 抗氧化維生素系統：主要包括有維生素 C（ascorbic acid）、維生素 E（tocopherol）及胡蘿蔔素（β- carotene），圖十六為維生素 C、維生素 E 及 GSH 抗氧化系統之總圖. (146). 。. （1）維生素 C 維生素 C 為一種水溶性維生素，也是眾所周知的抗氧化物。每分子維生素 C 可提供一對未配對電子，所以是有效之含氧自由基清除劑，維生素 C 與自由基作用後會產生 semi-dehydroascorbate，此物質在抗氧化過程中，可經由 GSH 及/或 NADPH 的還原作用而再生（147）. 。. （2）維生素 E 維生素 E 是一種脂溶性的抗氧化物，可有效的抑制脂質過氧化作用。天然的維生素 E 重要的有四型（α、β、γ、δ），一般認為其抗氧化性以α型為最有效。一分子α-tocopherol 可清除二個自由基（148），在細胞膜上及血漿的脂蛋白含有α型維生素 E（α-tocopherol），因其含有-OH 基可以作為脂質氧化連鎖反應中的阻斷劑，是屬於清除型之抗氧化劑。（3）胡蘿蔔素 β-胡蘿蔔素是維生素 A 的前驅物及在體內它可以消除單重態氧，及作為自由基的清除物（Free radical scavenger），可提供抗氧化保. - 128 -.

(47) 護效果給富含脂質之組織。其可經由與脂質過氧化自由基結合而終止連鎖反應之進行，並可憑藉結構之特異性，吸收單重態氧分子過多之能量而阻止氧化反應之進行。. 2. 抗氧化酵素系統某些含有過渡金屬之酵素，也可消除活性氧和自由基，如過氧化氫（Catalase，CAT）、麩氨基硫過氧化（glutathione peroxidase， GSH-PX）及超氧歧化（Superoxide dismutase，SOD）等，如圖十七所示。. （1）過氧化氫 CAT 是體內三大抗氧化酵素之一，為複合蛋白之一種，廣泛存在於細胞質中，反應中心為 Fe3+，並以 heam 為輔基，可使 H2O2 迅速分解為水及氧（150）。CAT（除了紅血球外）多分佈於細胞中之過氧化體（peroxisome）中，過氧化體中的酵素如氨基酸氧化（amino acid oxidase）及氫氧酸氧化. （hydroxy-acid oxidase）所產生之 H2O2. 均可被 CAT 所代謝（93,106,151,152）。. （2）麩氨基硫過氧化人體內三大抗氧化酵素之一，具還原 H2O2 或過氧化脂質成為水及氧或其他無害物質的功能。GSH-PX 存在於血液、粒腺體及細胞質中，包括需要依賴硒 (Se) 元素的 Se-GSH-PX 及不需要依賴硒的 Non- Se-GSH-PX 兩種型態（104）。Se-GSH-PX 可以還原 H2O2 及有機氫氧化物，Non-Se-GSH-PX 則只可利用有機氫雙氧化物。麩氨基硫（Glutathione，GSH）是由. 胺酸（glycine）、麩胺酸（glutamic acid）. 及半胱胺酸（cysteine）所構成之 tripeptide，其可藉由 GSHPX 催化 - 129 -.

(48) 為 GSSG，麩氨基硫還原（glutathione reductase）還原成為 GSH，反應如下. （153）. ： GSHPX. H2O2 + 2GSH. GSSG + 2 H2O glutathione reductase. GSSG + NADPH + H. +. 2GSH + NADP. 在正常細胞中，GSH/GSSG 之比值會較高，而 GSHPX 因大量存在於細胞質中，可直接清除 H2O2，且對 H2O2 之親和力大於 CAT，故其重要性較大. （93,151,152,154）. 。圖十八為麩氨基硫之氧化還原系統。. （3）超氧歧化 SOD 存在於細胞質及粒腺體中，其存在於細胞質中者，以銅、鋅為反應中心；存在於粒腺體中者以錳為反應中心（155）。人體和其他動物上會有 Mn-SOD、Cu,Zn-SOD，原生動物等則含 Fe-SOD。SOD 可藉由轉化超氧陰離子（O2.-）成為 H2O2 而清除之，反應如下： O2.- + O2.- + 2H+. H2O2 + O2. 而所產生之 H2O2 再由前述之 CAT 及 GSHPX 清除之。由於 SOD 分子量甚大，無法由腸胃吸收，並有半衰期甚短及易為腎臟排掉之缺點，故已有甚多研究者開始從自然界申尋找可清除 O2.之 SOD-like 物質（93,151,152,154）。. 二、超氧歧化. 之簡介. SOD 是一類具有抗氧化活性的高分子金屬. - 130 -. ，具有一般生物的一.

(49) 切特性，它廣泛存在於自然界一切需氧和耐氧的生物體各組織細胞內。由於 Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD 這三種 SOD 同功. 都能. ﹣. 特異性地清除生物氧化過程中產生的· O2 ，實際上對產生 SOD 的細胞，具有對活性氧的防禦和保護作用。. （一）超氧歧化. 的生物學特性. SOD 是一類具有抗氧化活性的高分子生物，它廣泛存在於自然界一切需要氧和耐氧的生物體各組織細胞內，具有一般生物的特性。同樣是活細胞的成分，由活細胞產生，在體內外具有一定催化功 ﹣. 能的蛋白質。它是迄今發現唯一以· O2 作為基物進行反應的，以金屬螯何物的形式存在，按照. 蛋白結合的金屬離子種類不同，可將. SOD 分為三種類型，即 Cu/Zn-SOD，Mn-SOD 和 Fe-SOD。圖十九和圖二十為 Cu/Zn-SOD 及 Mn-SOD 的結構圖（149）。 Cu/Zn-SOD 呈淡藍綠色，主要存在於真核細胞的胞漿中，分子量約 32000 左右，在可見光區 670nm 處有最大吸收，在紫外光區 265nm 處有最大吸收；分離純化的 Mn-SOD 呈淡粉紅色，存在於除紅血球外的所有動物細胞粒線體和原核生物中，分子量大多在 10000 左右，在可見光區 475nm 處有最大吸收，在紫外光區 280nm 處有最大吸收；Fe-SOD 呈淡黃色，這種類型的 SOD 僅存在於原核生物細胞中，其分子量約 38000 左右。 SOD 的種族及組織的特異性很強，生物種屬不同、同種生物的不同組織內或同一組織不同部位，SOD 的種類和含量也不同。在不同生物的不同發育階段，SOD 的活性和含量也不完全相同。. （二）超氧歧化. 的理化性質. - 131 -.

(50) 圖十六維生素 C、維生素 E 及 GSH 抗氧化系統. - 132 -. (146).

(51) 圖十七氧自由基的形成及抗氧化系統的酵素（149）. - 133 -.

(52) 圖十八麩氨基硫之氧化還原系統（149）. - 134 -.

(53) 1. 對熱的安定性：一般而言，蛋白質、生物性。SOD 與其他生物. 對熱表現出高度不安定性及易變. 不同，對熱比較穩定，但是當去掉金屬輔. 基後，其對熱穩定性很快下降，活性也跟著喪失。 2. 對 pH 的安定性： SOD 對 pH 的敏感性遠比其他生物小，pH 值在 5.3~10.5 的範圍內，對. 的活性影響不大，同樣的當去掉金屬輔基後，其. 對 pH 穩定性會迅速下降。 3. SOD 的光吸收： SOD 具有特殊的光吸收特性，這是由於不同種類 SOD 分子所含胺基酸種類及數量不同所導致。 4. 對氰化物的敏感性：氰化物可使許多. 喪失活性，Cu/Zn-SOD 對氰化物較為敏. 感，加入 1-2 mM/L 的氰化物就能使其活性全部喪失，Mn-SOD 則較不敏感，當氰化物濃度超過 10 mM/L 時，活性才開始出現變化。 5. SOD 對還原劑的影響還原劑對 SOD 的影響較大，如當加入硫基乙醇，SOD 酵素分子將很快解聚，導致 SOD 酵素活性顯著降低，甚至完全失去原有的生物功能。. 三、美白與抗氧化人類隨著年齡的增長，體內防禦系統的能力逐漸降低，導致體內氧化還原平衡失調，引起免疫功能損失及老化等病症。生物體細胞中抗氧化物的存在，可以對體內的氧化還原反應進行適度的調節，被認為是. - 135 -.

(54) 長壽之一重要因子。另外如前一章所述，抑制黑色素的形成除了可由降低酪胺酸的活性、抑制酪胺酸. 合成外，亦可由抗氧化的方向著. 手，具還原能力的抗氧化劑能防止 dopa 的自動氧化，在化妝品上可作為美白用。（一）美白功效的評估以下簡介幾個評估美白功效的實驗方法，如：抑制酪胺酸活性、阻斷 dopa 的自動氧化等。（156）. 1. Dopachrome 法. Tyrosinase 的活性抑制試驗是利用 dopachrome method 的方法。將 tyrosinase、L-tyrosine、HEPES 緩衝溶液和乙醇混合，再分別加入測試樣品。 2. Mason-Peterson Method （1）酪胺酸. 抑制活性測試（157,158）. Tyrosinase 的活性抑制試驗是根據 Mason and Peterson 的方法來做。將測試樣品溶於緩衝溶液，於 25℃下加入 tyrosinase 及 dopa 溶液，於波長 475 nm 下測定吸光值，計算抑制率。（2）Dopachrome 自動氧化產生黑色素（159）將 tyrosinase 於 25℃下加入 dopa，以 HCl 停止反應。離心後取沉澱物溶於 soluene 350 中，測量 400 nm 時的吸光值。得抑制率，以麴酸當作標準。 3. Sato 法（160）將 Mouse B16 melanoma cells 培養在 Eagle's minimum essential medium 中，測試樣品溶於 DMSO，加到上述的培養基，. - 136 -.

(55) 圖十九 Cu/Zn-SOD 的結構（149）. 圖二十 Mn-SOD 的結構（149）. - 137 -.

(56) 不加測試樣品的 DMSO 當作對照組。用肉眼觀察其數量和顏色，與對照組做比較。 4. Brown guinea pig. （160）. 使用 UV-B lamp 照射天竺鼠的背部，於二星期內照射六次。再經一星期後，將測試樣品塗抹在背上，使用比色計量測其亮度，與對照組做比較。（二）麴酸分析方法建立及確效麴酸為少數經衛生署公佈可用於化妝品的美白成分之一，亦常用作為美白實驗中的對照標準品。衛生署於八十九年公告，可使用於化妝品的美白成分有下列四種：1.Magnesiun ascorbyl phosphate 2. Ascorbyl glucoside 3. Kojic acid 4. Arbutin。. 1. 麴酸理化性質（161）（1）化學名 2-hydroxymethyl-5-hydroxy-γ-pyrone or 5-Hydroxy-2- (hydroxymethyl) -4H- pyran-4-one or 5-Hydroxy-2- (hydroxymethyl) -4-pyrone （2）結構式（3）分子式及分子量 C6H6O4；mol wt 142.11 （4）物理、化學性質於丙酮，乙醇加乙醚或甲醇加醋酸中形成菱柱狀結晶型，熔點 153-154℃，pKa = 7.9，8.03。極易溶於水、乙醇和丙酮，幾乎不溶於乙醚、醋酸、氯仿和嘧啶中。 2. 麴酸的簡介 - 138 -.

(57) 麴酸由不同品種的微生物體 Aspergillus、Penicillum 及 Gluconoacetobacter，經過發酵而產生的有機酸. （162,163）. ，在 1907 年. 由 Yabuta 從 Aspergillus oryzae 中首次分離出來，並且在 1924 年（164,165）. 由 Takahashi 等人定出它的結構. 。自然環境下，麴酸可以完全（166）. 地降解，且由微生物利用碳和水在有氧的過程中合成. 。. （167,168）. 麴酸具有些微的抑菌與抗發炎的生物活性有抗真菌. （169）. ，它的衍生物具. （170）. 及抗白血病. 的作用。在 1982 年，Shibuya 等人表. 示，麴酸在 Ames test 試驗中，顯示微弱的致突變性，於真核細胞中並未證實其為誘導突變的物質. （171）. 。麴酸在狗的實驗，靜脈注射之中. 毒及致死劑量分別為 150 mg/kg、1 g/kg 狗體重（172）；在培養的老鼠肝細胞中，顯示會導致 DNA 斷裂及基因的裂解（clastogenic）（173）。在 1991 年 Wei 實驗出高劑量（≥9 mg/ml）麴酸在中國倉鼠的卵巢細胞會造成毒性；且在造成明顯地姊妹染色體交換（sister-chromatid exchange，SEC）的頻率及染色體迷亂（chromosomal aberrations， CAb）的現象，並與劑量呈正相關。Wei 等人的報告中亦表示，麴酸對 S. typhimurium. TA98 及 TA100 具致突變能力（174）。長期連續經口給予高劑量麴酸（20 個月，3%）會導致小鼠的甲狀腺瘤，機轉可能與是因為血漿中的 T3 降低和 TSH 增加有關（175）。儘管這些潛在的危險性在體外及動物實驗中發現，麴酸仍廣泛的使用在傳統的日本食物中，且認為是有益於健康的，像味增湯、醬油、清酒等等（166）。在食品工業，麴酸已經使用在抑制農產品中多酚氧化（polyphenol oxidase）所造成的棕色化（176）。在化妝品上，麴酸廣泛的使用在美白方面，它是一個酪胺酸. 的抑制劑，藉由結構上第 4. 位置的酮基及第 5 位置的氫氧基螯合作用將酪胺酸的銅離子移除，影響酪胺酸. 將 N-acetyl tyrosine 氫氧化為 N-acetyl dopa 和 - 139 -.

(58) （165,177,178）. N-acetyl dopaquinone 的過程，導致酵素活性的抑制. 。. 在皮膚上，麴酸能有效防止光造成的傷害。皮膚的光損傷是由於紫外光照射所導致活性氧群的形成. （179）. ，皮膚裡所含的鐵可能會參與. 活性氧自由基的形成，因此，能螯合鐵的物質就成了光照的防護劑。麴酸對鐵具有螯合的作用，在 Mitani 及 Koshiishi 等人以裸鼠做的研究顯示，麴酸能有效避免由慢性光損傷導致皮膚形成皺紋、皮膚的增（180-182）. 殖、真皮下層的纖維化及真皮上層細胞外基質物的增加. 。. 四、研究目的化妝品使用於人的皮膚，必須對皮膚不產生任何傷害，故中藥化妝品中所使用的中藥材先要瞭解其安全性，再對其功效進行評估，最後應確保製作成劑型時的品質。本研究擬參考歷代方劑中記載具美容功效之中藥材，首先進行中藥材之安全性試驗，包括：單一劑量口服致死劑量（LD50）、皮膚刺激性試驗、眼睛刺激性試驗等之測定。利用酵素免疫分析儀測定中藥材水及甲醇的萃取物對酪胺酸抑制之活性，及其抗氧化與擬超氧岐化. 之活性。. 由功效評估實驗中篩選出具有美白、抗氧化及擬超氧岐化活性潛力的中藥材，製作成化妝品上常用的凝膠劑型，用於受試者，評估其臨床的療效。本研究也對中藥凝膠製劑進行安定性試驗，以瞭解不同中藥之甲醇萃取物在凝膠劑型中之安定性。. - 140 -.

(59) 參、結果與討論第七章美容用中藥材之安全性由於美容化妝品是日常生活中每天或長期連續被使用的物質，因此美容化妝品應該是安全的，無毒副作用的。傳統中醫藥，幾千年的應用中已積累了許多藥效記錄和經驗，對它們的用量、安全性和副作用也有許多驗証，這是合成化合物無法比的。傳統醫藥美容植物藥中所含有的天然活性物，具多重效能，藥效持久穩定，作用溫和，適用廣，副作用無或很小。美容化妝品使用於人的皮膚，因此與其他賦型劑一樣，中藥化妝品的安全性和有用性，是化妝品研製和開發先要瞭解的目標。中藥材必須對皮膚不產生任何傷害。本實驗使用一、冰片等十五種中藥材水及 50%酒精萃取液，進行單一劑量毒性試驗、皮膚及眼睛刺激性試驗，二、人參等五十四種中藥材水之萃取液（包含上述十五種）進行皮膚及眼睛刺激性試驗。三、實驗中藥材之製備（一）中藥材水萃取液之製備五十四種中藥材之水之萃取物重量與萃取率的換算如表六及表七。（二）中藥材 50%酒精溶液萃取物重量與萃取率的換算如表八所示。（三）50%酒精萃取液中酒精之去除：50%酒精萃取溶置於 60℃之烘箱中，0.5 小時後，觀察其體積減少一半以上。調整其體積為原體積之一半。此時酒精之理論含量值為 0.001%以下。 - 141 -.

(60) 表六五十四種中藥材之水之萃取率 40ml. 40ml 中藥材名稱. 中藥材名稱萃取物重 (g) 萃取率 (%) 人. 萃取物重 (g) 萃取率 (%). 參. 3.9842. 39.842. 威靈仙. 0.3326. 3.326. 女貞子. 2.0156. 20.156. 郁李仁. 0.307. 3.07. 山慈菇. 1.0408. 10.408. 桔. 梗. 1.2184. 12.184. 天門冬. 2.6851. 26.851. 桑白皮. 0.235. 2.35. 冬瓜子. 0.5228. 5.228. 桑. 葉. 2.0699. 20.699. 半. 夏. 6.3624. 63.624. 桃. 仁. 0.7058. 7.058. 玉. 竹. 1.4938. 14.938. 浮. 萍. 0.7622. 7.622. 生地黃. 1.5638. 15.638. 益母草. 0.212. 2.12. 白. 芨. 3.6546. 36.546. 益智仁. 2.1192. 21.192. 白. 朮. 2.431. 24.31. 栝蔞實. 0.4624. 4.624. 白. 芍. 1.2183. 12.183. 茯. 苓. 1.0314. 10.314. 白. 果. 0.339. 3.39. 細. 辛. 0.1798. 1.798. 白. 芷. 2.5267. 25.627. 麥門冬. 4.1121. 41.121. 白. 蘞. 1.0102. 10.102. 菟絲子. 1.098. 10.98. 合歡皮. 0.9526. 9.526. 當. 歸. 3.001. 30.01. 杏. 仁. 1.314. 13.14. 綠. 豆. 0.1498. 1.498. 杜. 仲. 1.0054. 10.054. 本. 1.4354. 14.354. 牡丹皮. 1.2204. 12.204. 蒺. 藜. 1.5492. 15.492. 辛. 夷. 1.7444. 17.444. 澤. 瀉. 1.811. 18.11. 防. 風. 0.5292. 5.292. 薏苡仁. 0.0687. 0.687. 知. 母. 2.192. 21.92. 黨. 參. 0.913. 9.13. 冰. 片. 0.2818. 2.818. 牛. 膝. 4.8602. 48.602. 牛. 蒡. 4.5153. 45.153. 丹. 參. 4.1555. 41.555. 艾. 草. 3.103. 31.03. 冬青葉. 2.0699. 20.699. 連. 翹. 2.0436. 20.436. 地膚子. 1.7178. 17.178. 梔子花. 0.7183. 7.183. 百. 合. 1.3083. 13.083. 山. 5.0517. 50.517. 黃. 連. 1.0089. 10.089. 楂. - 142 -.

(61) 表七五十四種中藥材之水萃取體積與萃取物重量 (mg) 換算表水之萃取液. 水之萃取液. 中藥材名稱. 中藥材名稱 0.1 ml. 0.5 ml. 0.1 ml. 0.5 ml. 參. 2.4605. 12.3025. 威靈仙. 0.8315. 4.1575. 女貞子. 5.039. 25.195. 郁李仁. 0.7675. 3.8375. 山慈菇. 2.602. 13.01. 桔. 梗. 3.046. 15.23. 天門冬. 6.7128. 33.5638. 桑白皮. 0.5875. 2.9375. 冬瓜子. 1.307. 6.535. 桑. 葉. 5.1748. 25.8738. 半. 夏. 15.906. 79.53. 桃. 仁. 1.7645. 8.8225. 玉. 竹. 3.7345. 18.6725. 浮. 萍. 1.9055. 9.5275. 生地黃. 3.9095. 19.5475. 益母草. 0.53. 2.65. 白. 芨. 9.1365. 45.6825. 益智仁. 5.298. 26.49. 白. 朮. 6.0775. 30.3875. 栝蔞實. 1.156. 5.78. 白. 芍. 1.7958. 8.9788. 茯. 苓. 2.5785. 12.8925. 白. 果. 0.8475. 4.2375. 細. 辛. 0.4495. 2.2475. 白. 芷. 6.3168. 31.5838. 麥門冬. 10.2803. 51.4013. 白. 蘞. 2.5255. 12.6275. 菟絲子. 2.745. 13.725. 合歡皮. 2.3815. 11.9075. 當. 歸. 7.5025. 37.5125. 杏. 仁. 3.285. 16.425. 綠. 豆. 0.3745. 1.8725. 杜. 仲. 2.5135. 12.5675. 本. 3.5885. 17.9425. 牡丹皮. 3.051. 15.255. 蒺. 藜. 3.873. 19.365. 辛. 夷. 4.361. 21.805. 澤. 瀉. 4.5275. 22.6375. 防. 風. 1.323. 6.615. 薏苡仁. 0.1718. 0.8588. 知. 母. 5.48. 27.4. 黨. 參. 2.2825. 11.4125. 冰. 片. 0.7045. 3.5225. 牛. 膝. 12.1505. 60.7525. 牛. 蒡. 11.2883. 56.4413. 丹. 參. 10.3888. 51.9438. 艾. 草. 7.7575. 38.7875. 冬青葉. 5.1748. 25.8738. 連. 翹. 5.109. 25.545. 地膚子. 4.2945. 21.4725. 梔子花. 1.7958. 8.9788. 百. 合. 3.2708. 16.3538. 山. 12.6293. 63.1463. 黃. 連. 2.5223. 12.6113. 人. 楂. - 143 -.

(62) 表八冰片等中藥之 50%酒精溶液所萃取之體積與重量 (mg) 換算表中藥材名稱. 50%酒精溶液 40 ml. 去酒精之 50%酒精萃取液. 萃取物重 (g). 萃取率 (%). 0.1 ml. 0.5 ml. 冰. 片. 0.3529. 3.529. 1.7645. 8.8225g. 牛. 蒡. 5.082. 50.82. 25.41. 127.05. 艾. 草. 3.5723. 35.723. 17.8615. 89.3075. 連. 翹. 1.2656. 12.656. 6.328. 31.64. 梔子花. 1.6095. 16.095. 8.0475. 40.2375. 山. 楂. 3.7859. 37.859. 18.9295. 94.6475. 牛. 膝. 7.5424. 75.424. 37.712. 188.56. 丹. 參. 3.9039. 39.039. 19.5195. 97.5975. 冬青葉. 1.6444. 16.444. 8.222. 41.11. 水. 萍. 0.4332. 4.332. 2.166. 10.83. 冬瓜子. 0.5511. 5.511. 2.7555. 13.7775. 地膚子. 0.6012. 6.012. 3.006. 15.03. 薏. 仁. 0.5089. 5.089. 2.5445. 12.7225. 百. 合. 1.0617. 10.617. 5.3085. 26.5425. 黃. 連. 2.5029. 25.029. 12.5145. 62.5725. - 144 -.

(63) 一、毒性試驗（一）單一劑量毒性試驗. （183,184）. 單一劑量毒性試驗的目的為測試試驗物質之急性毒性。經單一劑量投藥後 (包含 24 小時內完成的多次投藥) ，哺乳類動物臨床毒性症狀 (嚴重程度) 、發生時間、持續的時間及中毒後的復原性，並瞭解毒性症狀與劑量及時間的關係。單一劑量毒性試驗之結果有助於重複劑量毒性試驗時劑量範圍之選擇，同時可顯示該試驗物質的標的器官與遲發之毒性。同時單一劑量毒性試驗可協助選擇臨床試驗第一階段的起始劑量，並了解服藥過量可能引發之急性毒性。劑量範圍須包含會及不會產生毒性症狀 (造成死亡) 之劑量。若試驗物質毒性很低，則以試驗物質許可之最高限界劑量進行。若採強迫餵食方式投藥，投藥前動物須經過特定時段的禁食，而投藥之體積應在 10 ml/kg 動物體重以下，若投藥體積過高，可採多次投藥方式，但須在 24 小時內完成。單一劑量之毒性其結果如表九及表十所示。依中醫藥典籍記載，試驗物質之毒性很低，故投予量採最高劑量：10 g 藥材之 50%酒精或水的萃取物/ kg 體重投予。結果顯示小白鼠全部存活，活動情形與未給藥之對照組無異；十五種中藥材之水及 50%酒精萃取物其 LD50 均大於 10g 藥材之萃取物 / kg 體重。皆可視為無毒性。. （二）皮膚刺激性試驗所有會與皮膚或與眼睛接觸的新產品須進行皮膚與眼睛刺激性測試。觀察試驗物質對皮膚與眼睛及相關黏膜可能造成的傷害（185,186）. 。採用皮膚刺激性計分系統評估，摘自 OECD（Organization - 145 -.

(64) 表九中藥材 50%酒精溶液萃取物. 表十中藥材水萃取物之單. 之單一劑量毒性試驗結果. 一劑量毒性試驗結果. 藥. 材. 死亡率. LD50* （g/kg）. 藥. 材. 死亡率. LD50* （g/kg）. 冰. 片. 0. >10. 冰. 片. 0. >10. 牛. 蒡. 0. >10. 牛. 蒡. 0. >10. 艾. 草. 0. >10. 艾. 草. 0. >10. 連. 翹. 0. >10. 連. 翹. 0. >10. 梔子花. 0. >10. 梔子花. 0. >10. 山. 楂. 0. >10. 山. 楂. 0. >10. 牛. 膝. 0. >10. 牛. 膝. 0. >10. 丹. 參. 0. >10. 丹. 參. 0. >10. 冬青葉. 0. >10. 冬青葉. 0. >10. 水. 萍. 0. >10. 水. 萍. 0. >10. 冬瓜子. 0. >10. 冬瓜子. 0. >10. 地膚子. 0. >10. 地膚子. 0. >10. 薏. 仁. 0. >10. 薏. 仁. 0. >10. 百. 合. 0. >10. 百. 合. 0. >10. 黃. 連. 0. >10. 黃. 連. 0. >10. *劑量為 10g 藥材之萃取物/kg 動物體重. - 146 -.