三、研究方法與材料

第一部份：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究

（一）遺傳性聽損之基因流行病學研究

（二） SLC26A4 基因變異及其致病機制

（三） GJB2 基因變異及其致病機制

（四）粒線體12S rRNA 基因變異及其致病機制

第二部分：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用

(一) 以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成果 (二) 研發高效率低成本之基因診斷工具

(三) 胚胎著床前聽損基因診斷

第一部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究

(一) 遺傳性聽損之基因流行病學研究 1. 研究設計

本研究之設計為前瞻性的基因流行病學研究。

2. 材料與病人

本研究由醫院、啟聰學校或聽語復健機構，收集原因不明的「特發性感覺神經性聽損」(idiopathic sensorineural hearing impairment) 家族 800-1000 個，以作為本研究的「研究族群」(study population)。考量所欲研究的「目標族群」(target population)—亦即國內之全部遺傳性聽損病人人口，本研究認為，這是目前已知較為實際可行、且偏差較小的研究設計。

3. 研究方法與進行步驟

依據典型的基因研究之程序，包括定義疾病之表現型、確認病例、收集病例、收集DNA 檢體、處理 DNA 檢體、基因定型(genotyping)、以及資料分析。施行步驟分述於下：

(1). 病例之確認與收集

關於疾病表現型的定義，本研究認為，所有非外因造成的、先天性或早發性聽損的病人，都是適合的研究對象。因此，本研究由北部、

中部、南部的醫院、啟聰學校或聽語復健機構，篩選、收集此類家族 800-1000 個，此一選取病人的模式恰巧也提供吾人機會，以檢視常見的耳聾基因突變是否具機構間或地域間的差異。

病例的確認與收集之過程如下：每名個案，都由耳鼻喉科醫師親自進行訪談與檢查，以排除(1)胎內感染(2)出生體重小於 1500 公克(3)出生缺氧及使用呼吸器(4)黃疸指數過高(5)耳毒性藥物之使用(6)細菌性腦膜炎之病史(7)頭部外傷病史，其餘病人才納入本研究，以作為「研究族群」。

納入研究之病人均接受基本理學檢查，其重點為：(1)無顱顏面異常(2)耳鼻喉部正常(3)小兒神經學檢查正常(4)無心智功能異常，以區分其是否合併其他症候群。同時，也問取每位病人之詳細家族史，以確認其為「多病例家族」(multiplex family)或「單病例家族」(simplex family)，並儘可能採集「多病例家族」所有家族成員之血液檢體。若病人以前已在其他醫院有確立之診斷或有顳骨影像檢查結果，其資料

也將一併取得。病人聽損程度之判定，以「純音聽力檢查」(pure tone audiometry, PTA)之結果為準；然而對於無法配合進行純音聽力檢查之病人，則以「聽性腦幹反應」(auditory brainstemresponse, ABR)或「聽性穩態誘發反應」(auditory steady-state response, ASSR)判斷之。

(2). 檢體處理及常見聽損基因突變之檢測

個案填具同意書之後，進行血液檢體之收集與處理。DNA 的萃取是利用市售的基因抽取組(PureGene, Gentra system)。本研究檢測三個常見的耳聾基因：GJB2 (Cx26)基因、SLC26A4 (PDS)基因及粒線體 12S rRNA 基因。簡單歸納實驗流程，針對一般病人的檢體，本研究所檢測的基因片段包括GJB2 基因的 exon2 (此片段包含 GJB2 之全部 coding 區域)、SLC26A4 基因的 exon7-intron7-exon8 片段(此片段包含國人極為常見的c.919-2A>G 突變)(Wu et al., 2005a; Yang et al., 2005)、以及包含粒線體12S rRNA 基因全長(mitochondria map position: 648-1601 b.p.) 的 DNA 片段；而若病人病史可追溯到波動性的聽力喪失或已確知為內耳畸形病例，則再進行整段SLC26A4 基因共計 21 個 exon 的突變搜 尋。所有 PCR 反應的引子(primer)和反應條件，均根據文獻記載 (Campbell et al., 2001; Hwa et al., 2003; Rieder et al., 1998)，這些反應條件，業已經本研究團隊驗證過確實可行，而目前亦皆為我們實驗室之常規檢查之一。

所有的 PCR 的產物以 agarose gel 電泳確定無誤後，以 PCR Purification Kit 純化，再以上述的引子當作定序引子(sequence primer) 作直接定序。基因定序委託本院醫學研究部第二共同研究室進行分析，定序儀為ABI 3730 Genetic Analyzer (Perkin Elmer-Cetus, Foster City, CA, USA)。所有發現之基因變異，皆再加做另一方向的分析，以確認之，並與各耳聾基因相對應之網域資料比較(GJB2, Connexin-deafness Homepage, http://davinci.crg.es/deafness/index.php;

SLC26A4, Pendred/BOR Home Page, http://www.healthcare.uiowa.edu/

labs/pendredandbor/; 粒線體 12S rRNA, MitoMap, http://www.mitomap.

org/)，以確認其是否為新變異。若該變異為錯義(missense)變異，則比較各物種之間，該胺基酸基是否演化上高度保留；若該變異為基因接合處(splice site) 變異，則以線上軟體 (Neural Network at Berkeley Drosophila Genome Project, www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)計算其splice site score，以預測其對 RNA splicing 之影響。同時，亦比較 100 名之正常漢人對照組，以確認該變異是否為真實突變。

至本論文定稿時(2009 年 12 月)，本研究共為 991 個家族之初始受試者完成三段常見耳聾基因片段之突變檢測，共為144 個家族之初始受試者完成整段SLC26A4 基因之突變檢測。其間，因為陸續發表於國

外論文之故，各耳聾基因所相對應整理之家族數，並無法完全符合上 (radiographic result)、「聽力損失形式」(hearing loss pattern)、「聽力圖圖形」(audiogram configuration)、以及「聽損程度」(hearing level)等檢查結果，來作為比較表現型的各項指標。我們的實驗室對於各項指標研究的「目標族群」(target population)—亦即國內之全部遺傳性聽損病人人口中，耳聾基因之流行病學的正確資料。

(1). 臨床基因研究：Pendred 氏症候群和非症候群型大前庭導水管家族。

(2). 實驗動物模式之建立：培育 Slc26a4 基因 c.919-2A>G 及 p.H723R 突變 之「基因置換鼠」(knock-in mouse)。

3. 研究方法與進行步驟 (1). 臨床基因研究

a. SLC26A4 基因編碼區「缺失突變」(deletion mutation)之偵測 於僅帶單一 SLC26A4 基因突變或未帶突變之初始受試者，搜尋是 否具SLC26A4 基因編碼區之「缺失突變」(deletion mutation)。所使 用之方法，係利用 SYBR-Green I，針對 SLC26A4 基因全部共 21 個exons 進行 real-time PCR 反應(ABI 7700 PCR system, Foster, CA, USA)。Real-time PCR 反應的引子(primer)如研究方法附表一，反應條件則為50°C (2 min)、95°C (10 min)、緊接 40 次循環之 95°C (15 sec) - 60°C (1 min) - 72°C (1 min)。Real-time PCR 反應之結果與聽力正常之對照組及同一病人之 β-actin 基因作比較，以計算 normalized ratio (SLC26A4 amplicons / reference amplicon)。所有實 驗皆經重複一次，以確認之。

b. 基因型與表現型之關連性

分析SLC26A4 基因型與表現型的各項指標，包括影像學檢查結果、

甲狀腺腫的存在、聽力檢查結果等之間的關連性。

c. SLC26A4 基因促進區(promoter)及 FOXI1 基因之基因變異

於僅帶單一 SLC26A4 基因突變或未帶突變之初始受試者，檢測 SLC26A4 基因促進區 (promoter) 及 SLC26A4 基因的轉錄因 子—FOXI1 基因(MIM 601093)是否有突變。於 SLC26A4 基因促進區部分，本研究比較人類與其他物種於SLC26A4 基因上游 3 kb 以 內所相對應之「直系同源」(orthologous) DNA 片段，並找出兩段跨物種核苷酸同質性大於50%的片段(研究方法附表二)，蓋此演化上高度同質性之 DNA 片段，可能於 DNA 轉錄作用具重要影響，

而使核苷酸變異成為影響基因功能的突變。本研究所比較之物種包括人類 [human, accession no.: NT_007933, chromosome 7:

107085316- 107146090] 、恆河猴 [macaque, chromosome 3:

145079111- 145137936] 、乳牛 [cow, chromosome 4:

41143193-41076270] 、小鼠 [mouse, accession no.: NT_039548, chromosome 12: 32248140- 32202300]和大鼠[rat, chromosome 6:

49431055-49386806] (Ensembl, www.ensembl.org/index.html)。而於 FOXI1 基因，則針對其兩段 exons 直接定序。

d. 單套型分析

為了尋找SLC26A4 基因「隱藏突變」之可能位置，本研究分析「未 被偵測出突變之 SLC26A4 對偶基因」之單套型。單套型之基因定 型，乃針對SLC26A4 基因附近之單一核苷酸多型性變異(SNP)，進 行直接定序。

(2). 實驗動物模式之建立

「基因置換鼠」(knock-in mouse)的培育，本研究係與台灣大學「基因體醫學國家型計畫基因轉殖鼠核心實驗室」合作，該實驗室在轉殖與基因剔除鼠技術方面已有良好的基礎，並已成功培育出各種實驗鼠發表於國際知名雜誌(Lin et al., 2009; Yu et al., 2004)。本研究培育 Slc26a4 基因 c.919-2A>G 及 p.H723R 突變基因置換鼠的進行步驟，臚 列如下：

a. 設計並構築含抗生素篩檢基因之 Slc26a4 基因 c.919-2A>G 或 p.H723R 突變之基因替換質體(plasmid construct)：本研究所設計的 plasmid construct 如圖四所示。

b. 以電擊法 (electroporation) 的方法，將質體送入「胚胎幹細胞」 (embryonic stem cell)。

c. 以抗生素(neomycin)及「南方點墨法」(southern blotting)篩選胚胎幹細胞。

d. 將胚胎幹細胞植入代孕母鼠。

e. 「嵌合鼠」(chimera mouse)的產製：由代孕母鼠所生產之子代鼠即為嵌合鼠。

f. 由嵌合鼠與野生小鼠交配，預計經兩代之交配後，即可淨化復育為帶雙套Slc26a4 基因 c.919-2A>G 或 p.H723R 突變之基因置換鼠。

培育出基因置換鼠後，本研究自其出生之後，以「耳聲傳射檢查」

(otoacoustic emissions, OAE)、「聽性腦幹反應檢查」(auditory brainstem response)及 rotorod 平衡檢查，詳細記錄其聽力及平衡覺表徵。同時，

記錄其內耳解剖學、組織學及生理學上之表現型，以釐清 SLC26A4 基 因突變之致病機制。內耳組織學檢查主要係利用 H&E 染色及 confocal 螢光顯微鏡來觀察細胞型態及 Slc26a4 基因所製造的蛋白質—pendrin 在內耳分佈的位置及表現。

(三) GJB2 基因變異及其致病機制 1. 研究設計

本部分研究之設計為前瞻性基因研究，共分為三部分：

(knock-in mouse)。

3. 研究方法與進行步驟

(1). GJB2 基因 p.V37I 變異與特發性感音性聽損 a. 對偶基因頻率、病人基因型分佈與家族樹分析

以聽損程度區分特發性聽損病人為不同組別，比較輕至中度聽損病人、重度至極重度病人與聽力正常對照組之間，GJB2 基因 p.V37I 變異之對偶基因頻率以及病人基因型分佈(genotype distribution)，是有「連鎖不平衡」(linkage disequilibrium)之真實突變。

c. 基因型與表現型之關連性別皆標準化之Z-scores (Fransen et al., 2004)。根據低、中、高不同頻率，分別計算病人優耳之Zlow (0.25、0.5、1 kHz Z-scores 之平均)、

Z4-tone (0.5、1、2、4 kHz Z-scores 之平均)與 Zhigh (2、4、8 kHz Z-scores

之平均)。

b. 基因定型與分析

採集受試者的血液檢體、抽取DNA 後，使用 PCR、SNaPshot 等技

術，檢測這些受試者的 GJB2 基因編碼區所存有之基因多型性

(polymorphism)。本研究由 SNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

projects/SNP/)選取七個位於 GJB2 基因編碼區且漢人常見之突變或 基因多型性變異進行分析，包括 c.235delC 、 c.299_300delAT 、 c.109G>A (p.V37I, rs72474224) 、 c.79G>A (p.V27I, rs2274084) 、 c.341A>G (p.E114G, rs2274083)、c.368C>A (p.T123N)以及 c.608T>C (p.I203T)等。其後，以各音頻之 Z score 及聽力閾值區分受試者為實驗組(即聽力最差之 1/3，共 335 人)與對照組（即聽力最佳之 1/3，共 335 人），於校正其他與老年性聽損有關的干擾因子後，比較兩組間 GJB2 基因變異分佈之差異。

(3). 於細胞株之功能性基因研究

目前文獻上，被報告可應用於研究 connexin26 基因變異在細胞層級功能的細胞株包括Xenopus oocyte (Skerrett et al., 2004; White et al., 1998)、Sf9 細胞(Oshima et al., 2003)、Cos-7 細胞(Oguchi et al., 2005)以及HeLa 細胞(Martin et al., 1999; Thonnissen et al., 2002)等。近幾年來，

Fabio Mammano 及其團隊利用 HeLa 細胞成功地建立一套研究模式，可完整評估 GJB2 基因變異對於 connexin26 蛋白質功能的影響 (Beltramello et al., 2005; Beltramello et al., 2003; Bicego et al., 2006;

Piazza et al., 2005)。本研究採用該研究模式，使用 HeLa 細胞株來研究 GJB2 基因 p.V37I 變異對於 connexin26 蛋白質表現及功能之影響：

a.「基因選殖」(gene cloning)：

在文檔中遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學暨其臨床應用 (頁 42-58)

第一部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病 理學研究

第一部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究