p.V37I homozygotes
GJB2 基因 p.V37I 變異與特發性感覺神經性聽損之研究流程
本研究先依聽力程度分組，比較各組間對偶基因頻率與病人基因型分佈之差異，
同時進行家族樹分析，以先釐清p.V37I 變異與特發性感覺神經性聽損之相關性，
其後，進行單套型分析與突變點掃描，並整理 p.V37I 變異之表現型，以研究該 變異是否為真實突變、及其致病機制。
圖十九
I-1
p.V37I/wt I-2
p.V37I/p.V37I 100
2030 4050 6070 8090 100110
120125250500 1K 2K 4K 8K
II-1
p.V37I/wt II-2
p.V37I/p.V37I II-3
p.V37I/p.V37I II-4
p.V37I/p.V37I II-5 p.V37I/p.V37I
57 y 51 y
30 y 29 y 28 y 26 y 22 y
100 2030 4050 6070 8090 100110
120 125250500 1K 2K 4K 8K
F-706
p.V37I 變異之家族樹分析
家族樹分析顯示GJB2 基因 p.V37I 同型合子與聽損表現型同時出現。本研究共於 56 個 p.V37I 同型合子家族完成家族樹分析(segregation analysis)。一般而言，
p.V37I 同型合子變異與家族成員聽損之表現型一同出現，然亦有 p.V37I 同型合 子病人表現接近正常之聽力者(病人 II-5)。
圖二十
5’ 3’
: coding region : untranslated region
Exon 1 Exon 2
p.V37I
promoter
GJB6 GJB2
Primer Primer
Direct sequencing
No mutations!
No mutations!
於 GJB2 基因促進區(promoter)及其上游之 GJB6 基因搜尋突變點
為了排除 p.V37I 變異並非真實突變，而係其附近另有一與之形成連鎖不平衡之 真實突變導致聽損，本研究進一步於 GJB2 基因促進區(promoter)及其上游之 GJB6 基因進行突變點搜尋，然均未找到其他突變點。
圖二十一
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
120 125 250 500 1K 2K 4K 8K
Frequency (Hz)
Hearing level (dBHL)
c.235delC x 2 p.V37I x 2
GJB2 基因 p.V37I 與 c.235delC 同型合子之複合聽力圖
另一常見之GJB2 基因 c.235delC 突變相較，p.V37I 同型合子臨床上顯然表現較 輕之聽損表徵。
圖二十二
WT p.V37I
26KD Cx26 34KD
HCx26wt-GFP p.V37I-GFP
A
B
西方點墨法及螢光研究
A. 西方點墨法顯示野生型 GJB2 基因與 p.V37I 變異 GJB2 基因於蛋白質量之表 現並無差別。
B. 於轉染野生型 GJB2 基因之 transient HeLa 細胞株間，可觀察到由 connexin26 蛋白質所形成漂亮之gap junction plaque (B 左圖箭頭) ，而於轉染 p.V37I 變 異GJB2 基因之 HeLa 細胞間，則較少形成明顯之 gap junction plaque (B 右圖 箭頭)。(註：平均計算 5 個螢光視野)
圖二十三
HCx26wt p.V37I Control
50 μm
染料運送(dye transfer test)研究
以scrape dye transfer 的方式，進行 Lucifer Yellow 的運送比較。初步結果顯示，
p.V37I 變異 GJB2 基因之 HeLa 細胞間，Lucifer Yellow 的運送較野生型略差。惟 進一步之確認，或可利用本研究所培育之基因置換鼠GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh進行in vivo 的研究。
圖二十四
0 10 20 30 40 50 60
Gjb2+/+ Gjb2+/tm1Dontuh Gjb2 tm1Dontuh/
tm1Dontuh
Gjb2 tm1Dontuh/ tm1Dontuh
n=19 n=9 n=47
Gjb2 tm1Dontuh/ tm1Dontuh
p < 0.01 p < 0.05
A B
GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh之聽力表徵
p.V37I 變異同型合子基因置換鼠 GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh 之聽性腦幹反應檢查(p28 days)顯示聽力閾值變異大，有些為不正常(A 圖上)，有些為正常(A 圖下)。平均 值略較異型合子基因置換鼠及野生鼠高，但具統計學上顯著差異，可見其遺傳模 式亦與人類相同而為隱性遺傳(B 圖)。
圖二十五
Gjb2 tm1Dontuh/tm1Dontuh
Gjb2 +/+
RM SV
OC
A B
RM SV
OC
GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh之內耳組織學
p.V37I 變異同型合子基因置換鼠 GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh之內耳組織學上未見明顯變 化(下圖 B； OC, organ of Corti; RM, Reissner membrane; SV, stria vascularis)。
圖二十六
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
120 125 250 500 1K 2K 4K 8K
Frequency (Hz)
Hearing level (dBHL)
III-2 III-9
II-3 III-8 III-6
粒線體 m.1555A>G 突變臨床表現型之家族內差異性
同一家族中，雖然患病成員多呈現雙側對稱性、漸進性、學語後感音性聽損，且 均顯示正常之顳骨電腦斷層掃瞄結果，然而彼此間聽損程度卻有極大的差異性。
圖二十七
粒線體 m.1555A>G 突變臨床表現型之家族間差異性
不同家族間，其「外顯率」(penetrance)亦大不相同：有些家族中高達近十名成員 發病，有些家族則只有一兩名成員發病。以家族內母系血親計算，各家族之外顯 率由13%至 78%不等。(Horizontal lines above the symbols indicate individuals who were interviewed, and dots indicate individuals who received audiologic examination and DNA sampling. Asterisks indicate individual who developed hearing loss after exposure to aminoglycoside.)
圖二十八
以一家族為例，所有母系遺傳成員皆帶有 m.1555A>G 同質突變
所 有 帶 有 粒 線 體 m.1555A>G 突 變 的 受 試 者 ， 不 論 發 病 與 否 ， 皆 為 同 質 (homoplasmic)突變，可知粒線體 m.1555A>G 突變之突變負荷，顯非決定國人 m.1555A>G 突變臨床表徵之重要因子。(Control: 2 bands; homoplasic mutation: 1 band; heterplasmy: 3 bands)
C III-1 II-2 III-2 III-3 III-6 III-8 III-9 IV-1 IV-2 IV-5 IV-6
圖二十九
粒線體 m.1555A>G 突變外顯率與粒線體 DNA 單套群之相關性
單套群與表現型之相關性分析則顯示，不同粒線體DNA 背景之家族間，外顯率 亦不相同。而其中單套群A 與 B 似乎與高外顯率有關，而單套群 F 則與低外顯 率有關。(Penetrance = affected matrilineal relatives / total matrilineal relatives)
圖三十
GJB2 c.235delC
m.1555A>G m.961delT GJB2
c.299_300delAT
SLC26A4 c.919‐2A>G
SLC26A4 c.1160C>T
SLC26A4 c.1001+5G>C
GG
GJB2 c.109G>A
A
B
AA
GJB2 c.109G>A
SLC26A4 c.1489G>C
SLC26A4 c.1229C>T
SNaPshot 基因檢測之結果圖
每一基因變異點位皆可對應到特定位置之波型，而每一波型則因核苷酸各代表不 同顏色，而可清楚區分出同型合子或異型合子等不同基因型。
圖三十一
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
120 125 250 500 1K 2K 4K 8K
Frequency (Hz)
Hearing level (dBHL)
X
X X
X X X X
a b
M M
PGD 案例之聽力圖及內耳影像結果
吾 人 於 日 前 診 斷 一 名 患 大 前 庭 導 水 管 之 男 童 帶 有 SLC26A4 基因同型合子 (homozygous) c.919-2A>G 突變。該病童患有兩側重度聽損(圖 a)，電腦斷層掃描 則顯示兩側大前庭導水管及Mondini 氏發育不全(圖 b)。(箭頭：大前庭導水管；
M：Mondini 氏發育不全)
圖三十二
於第二次 PGD 療程所進行 12 個胚胎之基因檢測
於第二次PGD 療程，本研究共於 12 個胚胎進行切片。共有 4 個胚胎(PGD1、
PGD2、PGD3 與 PGD6)為完全正常，3 個胚胎(PGD4、PGD7 與 PGD12)帶單一 突變點，另5 個胚胎(PGD5、PGD8、PGD9、PGD10 與 PGD11) 則帶兩個突變 點而會發病。
圖三十三
以絨毛膜取樣進行產前診斷
本研究於十一週時所進行之絨毛膜採樣證實胎兒未帶SLC26A4 基因變異。
圖三十四
0.2μV/Div
a
0.2μV/Div
b
以 AABR (35 dBHL, cliks)進行新生兒聽力篩檢
該名胎兒已於2009 年 5 月順利出生，出生時接受自動聽性腦幹反應(automated auditory brainstem response, AABR)檢測(35 dBnHL)，顯示聽力完全正常。(a, 右 耳；b, 左耳)
圖三十五
EYA1: p.Q123X (c.367C>T)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
120 125 250 500 1K 2K 4K 8K
Frequency (Hz)
Hearing level (dBHL)
Probands: II-1 & II-2
II-2, R II-2, L II-1, R
II-1, L
一 BOR 症候群家族及其所帶 EYA1 基因 p.Q123X 突變
我們可藉由檢查病人是否具特別之身體表徵，而將之分類為特定的症侯群型遺傳 性聽損，再針對其基因進行基因檢測。目前我們已利用此方式，區別出8 個 BOR 症候群家族、6 個第二型 Usher 氏症候群家族、以及 5 個 Alport 氏症候群家族，
再分別針對EYA1 基因、USH2A 基因及 COL4A5 基因等進行突變檢測。本圖顯示 本研究於一BOR 症候群家族檢測出 EYA1 基因 p.Q123X 突變，即為適例。
圖三十六