四、結果 - 遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學暨其臨床應用

第一部份：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究 (一) 常見耳聾基因變異盛行率之調查

(二) SLC26A4 基因變異及其致病機制 (三) GJB2 基因變異及其致病機制

(四) 粒線體 12S rRNA 基因變異及其致病機制 (五) 結論

第二部分：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用

(一) 以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成果 (二) 研發高效率低成本之基因診斷工具

(三) 胚胎著床前聽損基因診斷 (四) 結論

第一部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病

究針對GJB2 (Cx26)、SLC26A4 (PDS)及粒線體 12S rRNA 等三段常見之耳 聾基因進行突變掃瞄。另外，針對前 150 個家族，本研究亦掃描國外曾被報告為「非罕見」之基因變異，包括GJB6 (Cx30)、粒線體 m.3243 及粒線 體m.7445 等點位，然而由於皆未發現基因變異，故其後並未納為本研究常規之聽損基因檢測。

對於特殊病例，如聽覺神經病變(auditory neuropathy)、branchio-oto-renal (BOR)症候群、Usher 氏症候群及 Alport 氏症候群等，本研究亦分別針對特定的基因，即 OTOF 基因、EYA1 基因、USH2A 基因及 COL4A5 基因等進

第一部分，(一))，由於發表時間較早，共整理 420 個家族；於「SLC26A4 基因變異及其致病機制」之研究(四、結果，第一部分，(二))，則分析共國人耳聾基因流行病學之概觀。此 420 個家族初始受試者(proband)之基本資料如表一所示，本研究依基因別、病例收集來源、以及地區分布，分析比較耳聾基因變異之盛行率及分布，其結果臚列於下。

2. 耳聾基因的突變 2 個 SLC26A4 基因突變(i.e. homozygous + compound heterozygous)，27 名可找到1 個突變(i.e. heterozygous)，16 名則未發現任何突變。

本研究共發現 10 處突變：c.230A>T (p.K77I)、c.919-2A>G、

c.1001+5G>C、c.1115C>T (p.A372V)、c.1160C>T (p.A387V)、c.1229C>T (p.T410M)、c.1343C>T (p.S448L)、c.1489G>C (p.G497R) 、c.2162C>T (p.T721M)及 c.2168A>G (p.H723R)，其中 c.230A>T、c.1001+5G>C、

c.1160C>T、c.1343C>T 與 c.1489G>C 為未曾報告於文獻之新突變，而 c.919-2A>G (IVS7-2A>G)則是國人最常見之突變，佔所有突變之 84%，

顯示國人SLC26A4 基因之突變光譜，與國外明顯不同。

[註：高加索人種中，較常見的 SLC26A4 基因突變為 p.L236P (16%)、

p.T416P (15%)及 c.1001+1A>G (14%)(Campbell et al., 2001)；而日本人最常見的 SLC26A4 基因突變則為 p.H723R (53%)(Tsukamoto et al., 2003)]

(2). GJB2 基因

於GJB2 基因本研究亦發現多處「對偶基因變異」(allele variant)，其中 以 c.109G>A (p.V37I)最為常見，然而其致病性仍有待釐清(見後 (三)GJB2 基因變異及其致病機制)。以確定的突變而言，以 c.235delC 最為常見。而以基因型而言，420 位初始受試者中，計 11 名為 c.235delC 突變之同型合子(homozygote)，16 名為帶有一 c.235delC 突變與其他 GJB2 基因變異之複合異型合子(compound heterozygote)。

(3). 粒線體 12S rRNA 基因

420 個初始受試者中，共有 12 個初始受試者帶有粒線體 12S rRNA m.1555A>G 突變，4 個初始受試者帶有粒線體 12S rRNA m.961delT+C(n) 變異（致病性仍未確定）。檢查12 個帶有 m.1555A>G 突變之家族，計近 50 位家族成員帶有 m.1555A>G 突變； 4 個帶有粒線體 m.961delT+C(n)變異之家族，則計有 20 位家族成員帶有 m.961delT+C(n) 變異。至於其他國外曾經報告過、已被確認之 12S rRNA 突變，如 m.1494C>T 等突變(Young et al., 2005; Zhao et al., 2004a; Zhao et al., 2004b)，則未見於本研究所收集之國內家族。

(4). 帶有兩種基因變異之初始受試者

若不考慮國人相當常見之 GJB2 基因 p.V37I 變異，則此 420 個初始受 試者中，帶有 SLC26A4 基因變異之病人，並未同時檢測出帶有 GJB2

基因突變或粒線體12S rRNA 基因突變者；帶有粒線體 12S rRNA 基因突變之病人，亦未同時檢測出帶有 GJB2 基因突變或 SLC26A4 基因突 變者。然而，於一 GJB2 基因 p.V37I 變異同型合子之初始受試者，則 檢測出帶有一SLC26A4 基因 c.919-2A>G 變異，惟由於該名病人並未具 內耳畸形，故吾人認為其病因較可能為 p.V37I 變異同型合子所致，

SLC26A4 基因 c.919-2A>G 變異可能僅為偶然帶因而已。

3. 耳聾基因突變盛行率的比較

如表三所示，以確定的耳聾基因突變而言，最常見者為 SLC26A4 之 c.919-2A>G 突變，其在本研究之聽損世代中的「對偶基因頻率」(allele frequency)為 12.1%，遠較 GJB2 之 c.235delC 突變的 4.5%為高。若合併計 入其他的突變，SLC26A4 突變在聽損病人之盛行率，亦較 GJB2 突變高。

而粒線體m.1555A>G 突變於國人聽損人口的對偶基因頻率則相對較低，約為2.9%。力學特徵，可知兩組間「聽力損失形式」(hearing loss pattern)以及「聽損程度」(hearing level)並不相同(表五)。而「羅吉斯迴歸」(logistic regression) 分析則證實，此一聽力學特徵的歧異，是導致醫院及聽語復健機構間

之輪廓，也證實了來自不同機構的病人，由於其聽力特徵亦不相同，將導 (homozygote)，1 名為 p.T410M 突變之同型合子，1 名為 p.H723R 突變之同型合子， 24 名為帶有二不同突變之複合異型合子(compound heterozygote) ； 21 名為帶有僅單一 c.919-2A>G 突變之異型合子 (heterozygote)，3 名為僅帶有其他單一突變之異型合子。簡之，101 個家族的初始受試者中，63 名(62%)可找到 2 個 SLC26A4 基因突變，24 名(24%)可找到 1 個突變，14 名(14%)則未發現任何突變(表七)。

基因定序之結果如表八所示，本研究於國人共發現 17 個位於 SLC26A4 基因編碼區(coding region)的基因變異，包括 11 個錯義突變 (missense mutation)、2 個無義突變(nonsense mutation)、1 個移碼突變 (frameshift mutation)以及 3 個基因接合處突變(splice site mutation)。

其後，本研究利用real-time PCR 之方法，針對該 38 名找到 1 個突變或未發現任何突變之初始受試者，搜尋是否具 SLC26A4 基因編碼區 之「缺失突變」(deletion mutation)，結果顯示 38 名初始受試者於 SLC26A4 基因全部共 21 個 exons 之 normalized ratio (SLC26A4 amplicons / reference amplicon)皆位於 0.92 – 1.08 之間，而未帶有基因編碼區之缺失突變。

(2). 最常見 SLC26A4 基因變異—c.919-2A>G 突變之起源

在本研究所發現的 SLC26A4 基因變異中，c.919-2A>G (IVS7-2A>G) 突變遠較其他突變常見，約佔所有突變之76.7%。歸究其因可能有二：

一為源自「起始者效應」(founder effect)；二為源自「好發點突變」(hot spot mutation)。而檢視此突變點附近之「DNA 標識」(DNA markers)，

適可為此問題提供一清楚之解答。

為釐清此一問題，本研究針對 16 名帶有兩個 c.919-2A>G 對偶基因

（亦即同型合子突變）之初始受試者以及帶有一個 c.919-2A>G 對偶基因（亦即異型合子突變）之初始受試者，進行進一步之分析(表九)。本研究應用PCR 反應與 DNA 直接定序之方法，來「基因定型」(genotype) 此32 名初始受試者 c.919-2A>G 突變點附近之 4 個「次要等位基因頻率」

(minor allele frequency, MAF) > 0.1 的「單一核苷酸多型性變異」 (single nucleotide polymorphism, SNP)：JST160568、JST089508、JST160566 及 JST160565 (Japanese Science and Technology Agency, JSNP database:

http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp) 。此 4 個單一核苷酸多型性變異與 c.919-2A>G 突變點之相對位置，由 5’至 3’端分別為：JST160568 — 2186bp — c.919-2A>G — 215bp — JST089508 — 1998 bp — JST160566 — 79bp — JST160565。同時，選取 50 名聽力正常無聽損家族史之自願受試者，以作為對照組。

基因定型的結果顯示，16 名同型合子突變之初始受試者，於

JST160568、JST089508、JST160566 及 JST160565 等四處顯現出獨特之基因型(Fisher’s exact test, all p < 0.001) (表九)。而統計由此 4 個單一核苷酸多型性變異及c.919-2A>G 突變所組成的「單套型」(haplotype)，則發現16 名初始受試者合計 32 條染色體中，30 條染色體(94%)的單套型是相同的(圖十)，顯示所有病人之 c.919-2A>G 突變可能來自共同的祖先，並驗證了此一突變之起始者效應(Wu et al., 2005a)。

(3). 基因型與表現型之關連性

接下來，本研究統計分析 SLC26A4 基因型與表現型的各項指標(包 括影像學檢查結果、甲狀腺腫的存在和聽力檢查結果等)之間的關連性。就基因型之分類而言，本研究將基因型就其所檢測出之基因變異數先予區分為帶單一突變(i.e. heterozygous)之初始受試者與帶有二突變 (i.e. homozygous + compound heterozygous)之初始受試者；而就帶有二突變者，則因文獻有載，同為隱性遺傳之耳聾基因 GJB2，其基因型之分 類應依其突變性質(如 truncating 突變或 missense 突變)加以區分，較具實益(Snoeckx et al., 2005)，本研究從之。

如表十所示，初始受試者之內耳畸形種類、甲狀腺腫之有無、聽損程度和聽力圖形，與 SLC26A4 基因型之間，並無顯著相關。而由於帶 有單一突變之初始受試者，其臨床表現型與帶有二突變者無差異，且該單一突變於家族成員中與臨床表現型一同出現，故本研究認為帶單一突變初始受試者其另一染色體上可能具有「隱藏突變」(hidden mutation)，

而非透過「表型模擬」(phenocopying, 亦即帶有單一突變之初始受試者為偶然帶因者)或「單套缺失」(haploinsufficiency)等機制，導致疾病發生。然而，亦不能排除其他「調節基因」(modifier gene)作用之可能。

(4). SLC26A4 基因促進區(promoter)及 FOXI1 基因之基因變異

由於前揭發現，本研究認為帶單一突變或未帶突變之初始受試者應具「隱藏突變」，故進一步搜尋 SLC26A4 基因促進區(promoter)及 SLC26A4 基因的轉錄因子—FOXI1 基因是否有突變。結果顯示，除於一 家族發現一個位於SLC26A4 基因促進區之變異—c.-2554G>A 外，本研 究於其他家族並未發現SLC26A4 基因促進區或 FOXI1 基因之突變(表十 一)。SLC26A4 基因促進區之 c.-2554G>A 變異雖非為演化上高度保留之核苷酸(圖十一 b)，但於家族樹分析中，與 p.G497R 突變分別位於不同染色體上，而與聽損表現型一同出現(圖十一 a)，故不能排除其致病性。

(5). 單套型分析

為了尋找 SLC26A4 基因「隱藏突變」之可能位置，本研究分析「未 被偵測出突變之 SLC26A4 對偶基因」之單套型。如前揭說明，由於帶 有 c.919-2A>G 突變之染色體其單套型相同，故本研究只需以基因定型之方式，確定 21 名 c.919-2A>G 突變異型合子病人之「雙套型」

(diplotype)，即可推知這些病人另一「未被偵測出突變之 SLC26A4 對偶 基因」之單套型。本研究共選取8 個「次要等位基因頻率」(minor allele frequency, MAF) > 0.03 之單一核苷酸多型性變異：rs#2248464 (intron 2)、rs#2248465 (intron 2)、rs#2712212 (intron 6)、rs#3839817 (intron 6)、

rs#2395911 (intron 8)、rs#2072064 (intron 10)、rs#2072065 (intron 10)和 rs#2301634 (intron 19)，以決定 SLC26A4 對偶基因之單套型。如表十二 所示，於21 個未被偵測出突變之 SLC26A4 對偶基因，共分布有 9 種單 套型，且其頻率均小於0.2，可知若有「隱藏突變」位於 SLC26A4 基因 之 intron 上，則突變點之分布應非集中於一點或特定數點(Wu et al., 2009b)。然其確切位置則有待日後進一步研究。

(6). 小結

本部分研究顯示，SLC26A4 基因突變是國人 Pendred 氏症候群和非症候群型大前庭導水管，唯一已知、但亦是最重要之基因因素。國人大前庭導水管病人，高達八成以上可歸因於 SLC26A4 之基因突變所致。因此 本研究建議，國內大前庭導水管病人皆應接受 SLC26A4 基因之突變檢 測，以確定病因，並利於其後之預後評估及治療。

2. 動物模式之建立

(1). 基因置換鼠 Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之聽覺及平衡覺表徵

目前本研究已於 C57BL/6 (B6)之小鼠株，成功培育出帶有 SLC26A4 基因 c.919-2A>G 突變之同型合子 (homozygous) 基因置換鼠 Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 及異型合子 (heterozygous) 基因置換鼠

Slc26a4+/tm1Dontuh，並完成聽性腦幹反應檢查(auditory brainstem response, ABR)，以記錄其聽力表徵。結果如圖十二所示，Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh

小鼠之聽性腦幹反應檢查在 120 分貝刺激下，完全沒有聽力的波型表現，而呈現極重度之聽損。異型合子(heterozygous) 基因置換鼠 Slc26a4+/tm1Dontuh 則呈現正常聽力，可見其遺傳模式應與人類相同而為隱性遺傳。

行為觀察顯示基因置換鼠 Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 中約 45%可觀察到歪頭(head-tilting)及繞圈圈(circling)之行為模式(圖十三 A)。在 rotorod 試驗可以發現Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh小鼠呈現較差之平衡能力，特別是

在文檔中遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學暨其臨床應用 (頁 58-74)