遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學暨其臨床應用

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國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所博士論文

Graduate Institute of Clinical Medicine

National Taiwan University, College of Medicine Ph.D. Thesis

遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學暨其臨床應用 Genetic epidemiology and molecular pathology of

hereditary hearing impairment and the clinical applications

研究生：吳振吉 (Chen-Chi Wu)

臨床指導老師：許權振 (Chuan-Jen Hsu ) 基礎指導老師：陳培哲 (Pei-Jer Chen)

中華民國九十九年一月

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致謝

暮然回首，自從碩士班投入於聽力損失之「分子遺傳學」(molecular genetics) 研究，不知不覺也過了七個多年頭了，宛如又從新念了一遍台大醫學系。

回顧這七年多來所走過的足跡，從一無所知的門外漢，到國外同領域的研究者開始知道台灣有個作deafness genetics 的 Wu CC；從剛開始只能消極地告訴病童家長「聽損原因不明，不過要定期追蹤」，到今天我們實驗室已初具規模、並已可提供全台灣聽損病人確切的基因診斷以及適當的遺傳諮詢。七年多的研究所生涯，雖不敢說有偉大的研究成就，但自覺從進入所內到離開，自己的行囊卻是裝的滿滿的。

當中，最要感謝的，就是我的兩位指導教授：許權振教授及陳培哲教授。許教授這幾年來，不僅在知識及臨床上給予我很多指導，也提供我許多人力、物力資源，全力支持我做聽損的基因研究；陳教授望之儼然，即之也溫，他總是不藏私、毫無保留地提供我研究方面的建議，每當研究遇到瓶頸，老師都能適時地伸出援手，指導我找到正確的研究方向。非常慶幸人生中可以遇到兩位這麼好的老師，也多虧兩位老師的提攜和指導，才能讓資質駑鈍的我能夠逐漸成長，並為未來10~20 年的研究之路，打下良好的基礎。

其次，要感謝的是我論文的指導委員：楊義良教授、楊偉勛教授和劉殿楨教授。感謝楊義良教授於擔任台北護理學院聽語所所長百忙之際，仍願意擔任我論文的指導委員，並給予我研究中關於聽語復健方面珍貴的建議；楊偉勛教授是醫學院以親和力、幽默聞名的老師，每當基因研究遇到問題的時候，他總是能親切地指導我；聽力學博士劉殿楨老師，在聽力的分析以及老年性聽損的研究方面，

不僅給我很多指導，也實質地提供我許多幫助。論文的口試委員李宣佑教授，是國內研究感覺系統遺傳學的泰斗，願意不辭勞遠到台北給我直接的指導，實在銘感五內。

我也要感謝醫學院及醫院曾經給予我指導和幫助的老師和學長，包括幫我們培育聽損基因變異轉殖鼠的林淑華老師和游益興博士、幫我們處理電子顯微鏡研究的盧國賢教授、提供我們測量老鼠內耳電位的劉宏輝教授、提供我們測量老鼠平衡功能儀器的蕭水銀教授、以及於 connexin 細胞轉染研究給與我們建議的吳建春老師。基因醫學部胡務亮主任所建立的台大醫院遺傳性疾病基因庫，使我們收集病例的流程更加順暢；婦產部陳思原老師，於遺傳疾病之產前及胚胎植入前基因診斷方面，也給我很多指導；蘇怡寧學長，因為基因醫學部的門診剛好為隔壁診，屢屢幫我解答了許多基因研究方面的疑惑；陳沛隆學長可以說是我投入遺傳研究的啟蒙師父，但今後要向學長學習的恐怕只會更多；蔡佳醍學長，則是在多基因疾病基因關聯研究方面，給予我許多建議。

此外，還要感謝公衛學院流病所統計組的李依錦醫師(我大學同學)和劉妍甄同學幫我們處理統計相關問題。耳鼻喉部裡的葉德輝老師和楊庭華學長，於我們

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開始進行動物研究之初，給與我們很大的協助。大林慈濟醫院的黃俊豪醫師，可以說是住院醫師以來的老戰友，現在仍一起收集老年性聽損的受試者、一起進行研究。同時，也要感謝國內耳鼻喉科界及聽語學界許多先進們給予我們的指正與病人轉介。

感謝同實驗室的盈璋、昱勳、柏伶、琬錡和文聖，一起和我於聽損基因研究之路上並肩作戰；也要感謝許權振教授的助理錦薇，幫我們處理掉一些實驗室文書上的瑣事。

最後，感謝照顧我最久，永遠在背後支持我的父親、母親、拙荊怡岑、家姊以及舍妹。你們是我一切奮鬥的原動力。

雖然完成了博士論文，但是我認為，我們的研究其實還在起飛的階段。在感謝上天對我的眷顧、感謝周遭有這麼好的師長、環境和同仁的同時，卻也感受到了身處在國內醫學的龍頭—臺大醫院的使命感，我想，今後唯有更加努力，才能回報大家給我的栽培、指導和照顧。

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目錄

封面 1

口試通過證明 2

致謝 3

目錄 5

圖表目錄 6

縮寫表 9

中英對照表 11

一、中文摘要 15

二、緒論 19

第一部份：遺傳性聽損基本介紹 20

第二部份：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學 24

第三部份：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用 32

第四部份：本研究之假設與目的 37

三、研究方法與材料 41

第一部份：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究 42

第二部分：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用 51

四、結果 57

五、討論 73

六、展望 93

七、論文英文簡述 103

八、參考文獻 117

九、圖表 143

圖 143

表 184

研究方法附表 218

十、附錄 221

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圖表目錄

圖

圖一：遺傳性聽損之分類與流行病學分佈 143

圖二：四種可能影響粒線體m.1555A>G 突變臨床表徵的機制 144 圖三：可供粒線體m.1555A>G 突變病人隨身攜帶之小卡片 145 圖四： Slc26a4 基因 c.919-2A>G 變異及 p.H723R 變異之 plasmid

constructs

146

圖五： pIRES2-AcGFP1 質體 147

圖六：於細胞株之功能性基因研究之流程 148

圖七： Gjb2 基因 p.V37I 變異之 plasmid construct 149

圖八： SNaPshot 基本原理 150

圖九：胚胎著床前基因診斷(PGD)流程簡圖 151

圖十： SLC26A4 基因 c.919-2A>G 突變源自一起始點變異 152 圖十一： SLC26A4 基因促進區之 c.-2554G>A 變異 153 圖十二： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之聽力表徵 154 圖十三： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之平衡覺表徵 155 圖十四： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之解剖學表徵 156 圖十五： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之組織學表徵 157 圖十六： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh之內耳毛細胞退化 158 圖十七： Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh內耳之pendrin 表現 159 圖十八： GJB2 基因 p.V37I 變異與特發性感覺神經性聽損之研究流程 160

圖十九： p.V37I 變異之家族樹分析 161

圖二十：於GJB2 基因促進區(promoter)及其上游之 GJB6 基因搜尋突 變點

162

圖二十一： GJB2 基因 p.V37I 與 c.235delC 同型合子之複合聽力圖 163

圖二十二：西方點墨法及螢光研究 164

圖二十三：染料運送(dye transfer test)研究 165 圖二十四： GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh之聽力表徵 166 圖二十五： GJB2tm1Dontuh/tm1Dontuh之內耳組織學 167 圖二十六：粒線體 m.1555A>G 突變臨床表現型之家族內差異性 168 圖二十七：粒線體 m.1555A>G 突變臨床表現型之家族間差異性 169 圖二十八：所有母系遺傳成員皆帶有 m.1555A>G 同質突變 171 圖二十九：粒線體 m.1555A>G 突變外顯率與粒線體 DNA 單套群之相

關性

172

圖三十： SNaPshot 基因檢測之結果圖 173

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圖三十一： PGD 案例之聽力圖及內耳影像結果 174 圖三十二：於第二次 PGD 療程所進行 12 個胚胎之基因檢測 175

圖三十三：以絨毛膜取樣進行產前診斷 176

圖三十四：以 AABR (35 dBHL, cliks)進行新生兒聽力篩檢 177 圖三十五： 一 BOR 症候群家族及其所帶 EYA1 基因 p.Q123X 突變 178

圖三十六：聽損基因研究之未來方向 179

圖三十七：進行新生兒耳聾基因變異篩檢之原因 180

圖三十八：利用新生兒血片進行耳聾基因變異篩檢流程 181

圖三十九：新生兒耳聾基因篩檢可輔助傳統新生兒聽力篩檢 182

圖四十：質離子幫浦阻斷劑(PPI)作用於 SLC26A4 基因突變病人急性聽損之可能機制

183

表

表一： 420 個家族初始受試者之基本資料 184

表二：於420 個家族中三段常見耳聾基因之基因變異光譜 185

表三：醫院及聽語復健中心初始受試者中常見耳聾基因變異對偶

基因頻率的差異

186

表四：醫院及聽語復健中心初始受試者中SLC26A4 基因型分佈的 比較

187

表五：醫院及聽語復健中心初始受試者中聽力學特徵之比較 188

表六：以羅吉斯迴歸分析聽力學特徵與SLC26A4 基因型之相關性 189 表七：於101 個 Pendred 氏症候群和非症候群型大前庭導水管家族

之SLC26A4 基因型分布

190

表八：於101 個 Pendred 氏症候群和非症候群型大前庭導水管家族之SLC26A4 基因變異

191

表九：於c.919-2A>G 同型合子、異型合子及對照組所進行之 SNP 分析

192

表十： SLC26A4 基因型與表現型之關連性 193

表十一： SLC26A4 基因促進區(promoter)及 FOXI1 基因之基因變異 194 表十二： 21 名 c.919-2A>G 異型合子病人之未被偵測出突變

SLC26A4 對偶基因之單套型

195

表十三：不同組間基因變異對偶基因頻率之比較 196

表十四：聽損程度不同組間p.V37I 變異基因型分布之比較 197 表十五：不同p.V37I 基因型病人基本資料與聽力表徵之比較 198

表十六： 1005 名受試者基本資料 199

表十七：依Zlow, Z4-tone 與 Zhigh scores 區分實驗組與對照組年齡、性別之比較

200

表十八：依Zlow, Z4-tone 與 Zhigh scores 區分實驗組與對照組基因型之 201

(9)

分布

表十九： GJB2 單套型與老年性聽損之相關性 202

表二十：不同c.109G>A 基因型之平均 Zlow, Z4-tone 與 Zhigh scores 203

表二十一：羅吉斯回歸校正其他干擾因子 204

表二十二： 10 個 m.1555A>G 突變家族初始受試者之臨床表現型 206 表二十三：粒線體 DNA 單套群與 m.1555A>G 突變外顯率之比較 207

表二十四：比較不同基因檢測結果之語音聽知覺表現 208

表二十五：比較不同影像學結果之語音聽知覺表現 209

表二十六：以廣義線性模式分析各預後因子與語音辨識率總和之相關性

210

表二十七： 24 名內耳畸形病童之植入人工耳蝸後之語音聽知覺表現 211 表二十八：本研究所選取 SNaPshot multiplex assays 之點位 212

表二十九： SNaPshot 反應與突變檢測之引子 213

表三十：經SNaPshot assay 檢測出基因變異病人之基因型 214

表三十一：案例家族兩次 PGD 療程之結果 215

表三十二： 於體染色體隱性遺傳模式下，SLC26A4 基因變異與大前庭導 水管之關連性

216

表三十三： 文獻比較：SLC26A4 基因型與表現型之關連性 217

研究方法

附表一 Sequences of the primers for quantitative PCR of the 21 SLC26A4 exons

218

附表二 Sequences of the primers and conditions used for amplification of the SLC26A4 promoter and FOXI1

219

附表三 Sequences of the primers for PCR of the 11 TRMU exons 220

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縮寫表

AABR automated auditory brainstem response ABR auditory brainsem response

ANOVA analysis of variance

ARHI age-related hearing impairment ASSR auditory steady-state response

cDNA complementary DNA

CI confidence interval

Cx connexin

EVA enlarged vestibular aqueduct

gDNA genomic DNA

GLM general linear model, HHL hereditary hearing loss HL hearing level

HRCT high resolution computed tomography IAC internal auditory canal

IEM inner ear malformation LCL lymphoblastoid cell line

LHON Leber’s hereditary optic neuropathy MAF minor allele frequency

MD Mondini’s dysplasia

MIM Mendelian Inheritance in Man NIHL noise-induced hearing loss OAE otoacoustic emission

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OR odds ratio

PCR polymerase chain reaction

PGD pre-implantation genetic diagnosis SBE single base extension

SCC semicircular canal

SNHI sensorineural hearing impairment SNP single nucleotide polymorphism

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中英對照表

人工耳蝸 cochlear implant 人工耳蝸植入手術 cochlear implantation 大前庭導水管 enlarged vestibular aqueduct 干擾因子 confounding factor

上游調控區域 upstream regulatory element

子單元 subunit

毛細胞 hair cell

內淋巴 endolymph

內淋巴水腫 endolymphatic hydrops 內聽道 internal auditory canal

內聽道狹窄 narrow internal auditory canal 內聽道擴張 wide internal auditory canal

引子 primer

半規管 semicircular canal 目標族群 target population

功能性基因研究 functional genetic study

甲狀腺腫 goiter

外顯率 penetrance

同型合子突變 homozygous mutation 同質突變 homoplasmic mutation 多病患家族 multiplex family

老年性聽損 age-related hearing impairment 西方點墨法 western blotting

血管紋 stria vascularis

先天性聽損 congenital hearing loss

自動聽性腦幹反應 automated auditory brainstem response 次要等位基因頻率 minor allele frequency

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耳蝸 cochlea

耳蝸未完全分隔 incomplet partition of cochlea 耳聲傳射 otoacoustic emission

耳聾基因 deafness gene

亨丁頓舞蹈症 Huntington’s disease

初始受試者 probands

波動性聽力喪失 fluctuating hearing loss

表型模擬 phenocopy

表現型 phenotype

非症候群型遺傳性聽損 non-syndromic hereditary hearing loss 定位選殖 positional cloning

直系同源 orthologous

阿胥肯那吉猶太人 Ashkenazi Jews 阿茲海默症 Alzheimer’s disease 易感基因 susceptibility gene

胚胎著床前基因診斷 pre-implantation genetic diagnosis 胚胎單套定型技術 embryo haplotyping

肺囊泡纖維化 cystic fibrosis

哈溫平衡 Hardy-Weinberg equilibrium

前庭 vestibule

前庭擴大 vestibular enlargement 前庭導水管 vestibular aqueduct 突變光譜 mutation spectrum

突變負荷 mutation load

後天性聽損 acquired hearing loss 染色體互換 chromosomal crossover 研究族群 study population

起始者效應 founder effect

連鎖不平衡 linkage disequilibrium 連鎖分析 linkage analysis

高解析度電腦斷層掃描 high resolution computed tomographic scan

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候選基因 candidate gene

候選基因方式 candidate gene approach 家族樹分析 segregation analysis

家族譜 pedigree

缺失突變 deletion mutation

症候群型遺傳性聽損 syndromic hereditary hearing loss 純音聽力檢查 pure-tone audiogram

胺基酸甘醣體 aminoglycoside

帶因者 carrier

淋巴球母細胞株 lymphoblastoid cell line

基因多效性 pleiotropy

基因多型性 polymorphism

基因定型 genotyping

基因背景 genetic background

基因重組 recombination

基因剔除鼠 knockout mouse

基因座 locus

基因接合處突變 splice site mutation 基因異質性 genetic heterogeneity

基因單套型 haplotype

基因置換鼠 knockin mouse

基因關聯研究 genetic association study

基因雙套型 diplotype

習語前聽損 pre-lingual hearing impairment 習語後聽損 post-lingual hearing impairment 移碼突變 frameshift mutation

異型合子突變 heterozygous mutation 異質突變 heteroplasmic mutation

盛行率 prevalence

單一核苷酸多型性變異 single nucleotide polymorphism 單病患家族 simplex family

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單套缺失 haploinsufficiency

單套群 haplogroup

發育不全 dysplasia

勝算比 odds ratio

無義突變 nonsense mutation

感覺神經性聽損 sensorineural hearing impairment 複合異型合子突變 compound heterozygous mutation 複合聽力圖 composite audiogram

對偶基因 allele

廣義線性模式 general linear model 聚合酶連鎖反應 polymerase chain reaction

編碼區 coding region

調節基因 modifier gene

選樣偏差 selection bias

遺傳性聽損 hereditary hearing loss 遺傳流行病學 genetic epidemiology 噪音性聽損 noise-induced hearing loss 錯義突變 missense mutation

隱藏突變 hidden mutation

雙基因 di-genic

聽力程度 hearing level 聽力損失形式 hearing loss pattern 聽力圖圖形 audiogram configuration 聽性穩態誘發反應 auditory steady-state response

聽損病因 etiology

變異的對偶基因 variant allele

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一、中文摘要

研究背景及目的

特發性(原因不明)感覺神經性聽損係臨床上相當常見的疾病，而最近的研究證實，基因變異是導致特發性感覺神經性聽損的重要成因之一。最近數年來，學界已經發現至少四十多個基因與特發性感覺神經性聽損的發生有關(即遺傳性聽損)。遺傳性聽損基因及其突變，常因種族不同而存在著很大的差異，

易言之，吾人臨床上並無法直接採用國外的研究結果，來作為遺傳諮詢的準則，若要提供病患及其家屬正確的資訊及診斷，顯然必須仰賴國人自行完成一大規模且完整的基因流行病學調查，而以此一檢體庫為基礎，吾人日後亦可致力於新耳聾基因的找尋或其他研究。同時，一些常見耳聾基因變異之致病機制，諸如：GJB2 基因的 p.V37I 變異之致病性、SLC26A4 基因變異之基因 型與表現型之關連性、SLC26A4 基因變異如何導致聽損、以及影響粒腺體 m.1555A>G 突變臨床表現型之因素等，皆有待吾人釐清，以助於吾人了解病人聽損發生之原因，進而針對該原因研擬治療方針。

而如同其他單基因遺傳疾病，過去幾年來遺傳性聽損的研究，也逐漸地被應用於臨床醫學以幫助病人及其家屬。然而，從臨床研究者的角度觀之，

吾人自不宜安於現狀、故步自封，而應致力於新臨床應用之研究或研發，以使更多病人得以受惠於基因醫學的新進步。而隨著我們對於耳聾基因變異流行病學更精確的掌握，以及對於耳聾基因變異致病機制更深入的了解，若能結合其他領域醫學的較新進步，如內耳之人工耳蝸手術、基因定型技術、以及生殖科技等，應能從中研究出聽損基因檢測之臨床新應用。

研究材料與方法

本研究分兩大部分執行：第一部分為遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究；第二部分為遺傳性聽損基因檢測之臨床應用。

於第一部分之遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究，本研究先由建立一大規模之特發性感覺神經性聽損基因檢體庫著手，並從中研究國人聽損基因流行病學；其次，再分就三個最常見之耳聾基因，即 GJB2 基因、

SLC26A4 基因與粒線體 12S rRNA 基因之基因變異，研究其致病機制：

1. 遺傳性聽損之基因流行病學研究：於一大規模之聽損世代中，進行基因檢測，並比較常見遺傳性聽損基因突變之機構間及地區間差異。

2. SLC26A4 基因變異及其致病機制：於大前庭導水管家族，分析 SLC26A4 基 因型與表現型之關連性，搜尋僅帶單一SLC26A4 基因突變或未帶突變之初

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始受試者是否帶有SLC26A4 基因促進區(promoter)及 FOXI1 基因之基因變 異，並進行單套型分析以尋找隱藏突變之可能位置；同時，培育帶有Slc26a4 基因國人最常見之c.919-2A>G 突變之基因置換鼠，以研究 SLC26A4 基因 變異之致病機轉。

3. GJB2 基因變異及其致病機制：分別於特發性感覺神經性聽損與老年性聽損 等二研究世代，藉由分析比較GJB2 基因 p.V37I 變異之對偶基因頻率及基 因型分布，以釐清該變異與聽損發生之相關性；同時，亦於 HeLa 細胞進行轉染實驗，並培育帶有p.V37I 變異之基因置換鼠，以研究其致病機轉。

4. 粒線體 12S rRNA 基因變異及其致病機制：分析影響粒線體 12S rRNA 基因 m.1555A>G 突變表現型之因子，包括粒線體基因體之單套群、m.1555A>G 之突變負荷、細胞核內可能影響粒線體表現的基因、以及抗生素暴露等因素。

於第二部分之遺傳性聽損基因檢測之臨床應用研究，本研究則區分下列三子題，研究聽損基因檢測之新應用：

1. 以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成果：研究接受人工耳蝸植入手術病童之術後長期語音聽知覺表現，分析比較各預後因子(包括基因檢測結果、手術年齡、人工耳蝸使用期間、術前殘存聽力及影像學檢查結果等) 對於人工耳蝸植入手術術後聽能創建效果好壞的影響。

2. 研發高效率低成本之基因診斷工具：使用 SNaPshot 此一基本技術，設計一套可同時檢測約 20-40 個耳聾基因突變位點的檢測方法，並應用該檢測方法於一新的特發性感覺神經性聽損世代，以確認此一診斷工具的效力。

3. 胚胎著床前聽損基因診斷：針對帶有特定耳聾基因變異的家族，設計胚胎著床前基因診斷技術，以助其生育聽力正常之胎兒。

結果

第一部分之遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究

1. 遺傳性聽損之基因流行病學研究：本研究建立了一個大規模國人特發性感覺神經性聽損的基因庫，也釐清了國人聽損基因流行病學的大致輪廓—國人的基因變異仍以GJB2、SLC26A4 及粒線體 12S rRNA 基因等三個耳聾基 因最為常見，並證實了來自不同機構的病人，由於其聽力特徵亦不相同，

將導致基因流行病學研究結果的歧異。

2. SLC26A4 基因變異及其致病機制：國人大前庭導水管病人中，八成以上可 歸因於 SLC26A4 基因變異，而進一步之表現型-基因型關連性研究，則暗 示仍有未被檢測出之 SLC26A4 基因變異；另外，於本研究所培育出之 Slc26a4 基因 c.919-2A>G 突變之基因置換鼠 Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh，表現型可觀察到重度聽損、平衡能力差、前庭導水管擴大等與人類疾病類似之

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表徵。

3. GJB2基因變異及其致病機制：對偶基因頻率、病人基因型分佈與家族樹分析顯示，p.V37I 變異與特發性感覺神經性聽損以及老年性聽損均顯著相關，而於 HeLa 細胞進行之實驗則顯示該變異可能為影響蛋白質功能之突變。然而p.V37I 變異同型合子臨床上聽損程度差異極大，甚至可能完全正常，顯示應有其他因素調控其聽力表徵。

4. 粒線體12S rRNA 基因變異及其致病機制：國人特發性感覺神經性聽損家族中，粒線體m.1555A>G 突變之盛行率約為 3%，而於多病例家族，其盛行率更高達11%。抗生素暴露、m.1555A>G 突變之突變負荷及細胞核相關基因之基因變異，皆非決定國人 m.1555A>G 突變臨床表徵之重要因子；

反之，某些單套群，如單套群F，似乎與家族之低外顯率相關。

第二部分之遺傳性聽損基因檢測之臨床應用研究

1. 以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成果：基因檢測結果及影像學結果為影響人工耳蝸植入術後成效最重要的兩個指標。以影像學上內聽道狹窄之有無評估人工耳蝸之預後，可預測出術後成效不佳之病例；而以基因診斷預測預後，則可預測出術後成效良好之病例。兩者恰可相輔相成，

合併使用，將有助於吾人於人工耳蝸植入術前，更精準地預測病人術後成效。

2. 研發高效率低成本之基因診斷工具：本研究研發之SNaPshot assay，可於 2 次SNaPshot 反應，完成國人最常見之 20 個耳聾基因變異點位之掃描。將該項基因檢測技術應用於診斷214 個聽損家族則發現其正確率不亞於傳統 之基因定序，且具效率高、成本低、可彈性調整點位與易於推廣等優點。

3. 胚胎著床前聽損基因診斷：本研究首先以 GenomiPhi technology 和 primer extension mini-sequencing 等方法，針對一 SLC26A4 基因 c.919-2A>G 突變 同型合子病童及其父母，研發並校正單一細胞 c.919-2A>G 突變點檢測技術。其後，以人工生殖技術，誘導排卵並進行體外受精，於胚胎培育成八細胞期時，進行胚胎切片以作單一細胞基因診斷。於第二次 PGD 療程，

本研究成功使病童母親受孕，並於2009 年 5 月生育聽力完全正常之嬰兒，

而完成世界首例報告。

結論

本研究過去幾年來所進行的遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究，已使我們對於國人特發性感覺神經性聽損之常見基因變異、基因型與表現型之關連性、以及其致病機制，有了基本的了解。而最近幾個常見耳聾基因變異基因置換鼠之成功培育，不僅有助於我們釐清各基因變異之致病機制，亦將成為我們未來研究新治療方針之礎石。當然，本研究也注意到有些

(19)

尚未解決的課題，有待吾人進行更深入的研究。

本研究發現，聽損之基因檢測結果不僅可用來預測人工耳蝸手術術後成果，基因流行病學資料的建立，也使得吾人得以研發高效率、低成本的基因檢測工具來推廣基因檢測並幫助更多病人。近年來，本研究也嘗試結合其他領域醫學的較新進展，以研究聽損基因檢測之臨床新應用：聽損之基因檢測與生殖科技的結合，使得吾人臨床上得以扮演更積極的角色，而能夠於生命的最始期即能提供聽損家族其所需要的幫助。

關鍵字

遺傳性聽損 (Hereditary hearing impairment) 基因流行病學 (Genetic epidemiology) SLC26A4 基因 (SLC26A4 gene)

PDS 基因 (PDS gene)

大前庭導水管 (Enlarged vestibular aqueduct) Pendred 氏症候群 (Pendred syndrome) GJB2 基因 (GJB2 gene)

Cx26 基因 (Cx26 gene)

粒線體12S rRNA 基因 (Mitochondrial 12S rRNA gene) 人工耳蝸植入手術 (Cochlear implantation)

SNaPshot 技術 (SNaPshot technique)

胚胎著床前基因診斷 (Pre-implantation genetic diagnosis)

(20)

二、緒論

第一部份：遺傳性聽損基本介紹

（一）前言

（二）遺傳性聽損之定義

（三）遺傳性聽損之分類與流行病學

（四）遺傳性聽損之常見致病基因及其突變

（五）其他罕見遺傳性聽損基因之發現

（六）遺傳性聽損致病基因之特色

（七）結論

第二部份：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學

（一）具有流行病學意義的常見耳聾基因及其突變

（二）國內遺傳性聽損流行病學之過去相關研究及其結果

（三）當前國人遺傳性聽損基因流行病學所待進行之工作

（四）遺傳性聽損基因變異之致病機制

（五）結論

第三部份：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用

（一）遺傳性聽損基因檢測之一般臨床應用

（二）臨床新應用一：以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成果

（三）臨床新應用二：研發高效率低成本之基因診斷工具

（四）臨床新應用三：胚胎著床前聽損基因診斷

（五）結論

第四部份：本研究之假設與目的

（一）遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學

（二）遺傳性聽損基因檢測之臨床應用

(21)

第一部分：遺傳性聽損基本介紹

(一) 前言

聽力損失是各種感覺系統缺陷中最為常見的。臨床醫師在處理聽力損失的病人時，通常必須先找出原因，才能做出進一步的決定，而常見的原因包括感染、

外傷、噪音、耳毒性藥物、老化、遺傳等等。這些原因的致病機轉和預防治療，

大多早已為臨床醫師所熟知，惟獨吾人對於「遺傳性聽損」(hereditary hearing impairment)的瞭解，一直到最近幾年才有重大突破。

(二) 定義

廣義的遺傳性聽損，除了吾人所熟知發生於嬰兒、幼童及青少年時期之遺傳性聽損外，尚包括老年性失聰、美尼爾氏症及耳硬化症等基因因素可能扮演一定角色的耳疾，惟這些疾病受太多環境因素所干擾與影響，因此不包括在一般的討論之內。其次，遺傳性聽損並不等於「先天性聽損」(congenital hearing impairment)。先天性聽損是指出生時就發生的聽損，其中當然由基因遺傳所引起的佔有相當大的比重，但是其他因素如母子病毒垂直感染或週產併發症等，也會導致先天性聽損。另一方面，遺傳性聽損的病人，也不全是先天性聽損，因為一部份病人於出生時聽力可能為正常或接近正常，隨年紀漸長才逐漸變差。一般而言，在已開發國家如台灣，剛出生的嬰兒約1000 人中有 3 人會合併中至重度聽損，，其中三分之二可歸因於遺傳因素；而至成年之前，此 1000 人中又約有 1 人會再發生感覺神經性聽力損失，其中遺傳因素所扮演的角色則仍未知(Marazita et al., 1993)。

(三) 遺傳性聽損之分類與流行病學

遺傳性聽損可依是否合併身體其他器官的異常，區分為「症候群型」

(syndromic)與「非症候群型」(non-syndromic)兩類，其中以後者為多數，兩者比例約為30：70 (Petit, 1996)(圖一)。較常見的症候群型遺傳性聽損有：Pendred 氏症候群（聽損合併甲狀腺腫）、Usher 氏症候群（聽損合併色素性視網膜炎）、

Waardenburg 氏症候群（聽損合併前額白髮及內眥異位）、Jervell & Lange-Nielsen 氏症候群（聽損合併心律不整）等等。由於症候群型遺傳性聽損有其他身體表徵可供辨識，而有助於病例的收集與分類，因此吾人對於症候群型遺傳性聽損的基因研究，有較多的瞭解，目前已知約有100 個基因與症候群型遺傳性聽損有關。

反之，佔較多數的非症候群型遺傳性聽損之基因研究，則一直到 8、9 年前才有突破性的進展。歸究其原因主要有三：（1）致病基因的異質性—有太多基因

(22)

可能造成聽損，（2）病患除了聽損外缺乏可辨識的臨床表徵，（3）瘖啞病人之間經常相互通婚致使研究更加複雜化(Petit, 1996)。傳統上針對非症候群型聽損之遺傳研究，乃是藉由家族性病例之「連鎖分析」(linkage analysis)，將可能的目標基因定位於染色體上。當然，各個家族之間致病基因可能不同，然而由於臨床表徵無法區分，因此各個可能致病的基因就以「基因座」(locus)的方式區隔。基因座的命名方式主要根據兩點：遺傳的形式（如 DFNA 代表體染色體顯性、DFNB 代表體染色體隱性、DFN 代表 X 染色體性聯遺傳、DFNY 代表 Y 染色體性聯遺傳），以及發現之先後（如第一例發現的體染色體顯性遺傳定名為 DFNA1）。目前已知至少有57 個 DFNA 基因座、77 個 DFNB 基因座、8 個 DFN 基因座、以及 1 個 DFNY 基因座，而且數目還在持續增加中(Hereditary Hearing Loss Homepage, http://webhost.ua.ac.be/hhh/, accessed on 10/10/2009)。一般而言，體染色體隱性的遺傳性聽損，聽力損失程度通常較嚴重，也多發生在「習語前」

(pre-lingual)；而體染色體顯性的遺傳性聽損，聽力損失程度則相對較輕微，且較常發生在「習語後」(post-lingual)。在習語前遺傳性聽損的病人中，DFNB 約佔 75%的個案，DFNA 約佔 20%的個案，DFN 約佔 2~3%的個案，而另外還有不到 2~3%的個案是經由粒線體遺傳。其中，在歐美的研究中，DFNB1 在遺傳性聽損病人的盛行率接近 50%，而在地中海沿岸的居民，其盛行率甚至可高達 79%

(Gasparini et al., 1997; Maw et al., 1995)。

(四) 遺傳性聽損之常見致病基因及其突變

1997 年可以說是非症候群型遺傳性聽損之基因研究有重大發展的一年。在這一年，比較重要的基因座的「候選基因」(candidate gene)，如 DFNB1 的 GJB2 (Cx26)基因(Kelsell et al., 1997)及 DFNA1 的 DIAPH1 基因(Lynch et al., 1997)相繼 被發現。之後，由於分子生物學的進步和人類基因體的成功解碼，使學者得以活用「定位選殖」(positional cloning)及「候選基因」(candidate gene)等方法，而加速整個研究的進展。目前已經發現約有四十多個基因的突變與非症候群型聽損的發生有關，包括GJB2 (Cx26)、GJB3 (Cx31)、GJB6 (Cx30)、GJB1 (Cx32)、DIAPH1、

MYO7A 、 MYO15 、 OTOF 、 SLC26A4 (PDS) … … 等 (Hereditary Hearing Loss Homepage, http://webhost.ua.ac.be/hhh/, accessed on 10/10/2009)。其中，臨床上較常見發生異常的基因有：GJB2 (Cx26)基因、SLC26A4 (PDS)基因、粒線體 DNA 突變(12S rRNA 基因)、以及 OTOF 基因等。由於這些常見的耳聾基因及突變，

意義上直接相關於遺傳性聽損的基因流行病學，鑑於論述之完整性，將於其後的第二部分詳細說明。（第二部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究）

(五) 其他罕見遺傳性聽損基因之發現

(23)

至於其他罕見之致病基因，由於只出現在全世界單獨一個或少數幾個家族，

因此由遺傳諮詢的觀點而言，並不具顯著的臨床價值。然而，其之於吾人對於內耳功能的瞭解，卻具有極大的貢獻(Battey, 2003; Steel et al., 2001)。較著名者，如吾人關於內耳中之「鉀離子再循環」(potassium recycling)(Wangemann, 2006)、內耳毛細胞中多種「非典型肌凝蛋白」(unconventional myosin)及其相關分子(Boeda et al., 2002; Verpy et al., 2000)、毛細胞纖毛(stereocilia)間連結之細微構造 (Belyantseva et al., 2005; Frolenkov et al., 2004)、乃至於毛細胞與聽神經間之突觸與神經傳導機制(Roux et al., 2006)等等知識，有一大部分乃是建構於這些罕見致病基因的研究工作之上的。

(六) 遺傳性聽損基因之特色

由過去數年的文獻，吾人逐漸歸納出遺傳性聽損基因的一些特色，與其他疾病的基因有所不同：

1. 除極少數例外(Balciuniene et al., 1998; Bykhovskaya et al., 2000; Riazuddin et al., 2000)，絕大多數遺傳性聽損均由單一基因所造成，不論是症候群型或非症候群型，多由單一基因所造成。

2. 有些症候群，如 Usher 氏症候群及 Waardenburg 氏症候群之各亞型，雖然病人的「表現型」(phenotype)無法區分，卻可能是由多種不同基因所造成的。此種現象，稱為「基因異質性」(genetic heterogeneity)。

3. 反之，有一些基因，會依突變的不同而形成不同的表現型。如前述之 SLC26A4 基因，除了導致 Pendred 氏症候群，也可導致非症候群型遺傳性 聽損。同理，不同的 GJB2 基因突變，也會分別以體染色體隱性 (DFNB1)(Kelsell et al., 1997)、體染色體顯性(DFNA3)(Denoyelle et al., 1998)、或症候群型聽損(Vohwinkel’s syndrome)(Maestrini et al., 1999)等不同的遺傳方式遺傳。

這些特色，都使得遺傳性聽損的研究較其他遺傳性疾病的研究更複雜。

(七) 結論

由於分子生物學的進步和人類基因體的解碼，最近數年來，學界對於導致遺傳性聽損的成因有了顯著的進展。至今已經發現約有四十多個基因與非症候群型聽損的發生有關(Hilgert et al., 2008)。就臨床研究者的角度而言，如何將此一基礎知識的進步應用到病人身上，可謂是最重要的工作。本文以為，要使近年來關於耳聾基因的相關知識達到臨床上的實用化，應該包含下列工作：

1. 遺傳性聽損的基因流行病學及分子病理學研究：

首先，應進行一大規模、完整的基因流行病學研究，以確定各耳聾基因及其突變在族群中的盛行率及重要性，方有助於之後基因檢測、遺

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傳諮詢及預後評估等工作；同時，應釐清常見耳聾基因變異之致病機制，以助於吾人了解病人聽損發生之原因，進而針對該原因研擬治療方針。

2. 遺傳性聽損基因檢測之臨床應用：

將基因檢測的結果，直接應用於病人身上，以確定病人聽損發生的成因，俾於較準確地評估病人的預後以及預測家族中聽損的再發生率；

同時，分析病人的基因變異是否會影響到臨床上各種治療的效果，以使帶有特定基因變異的病人，都能獲得較妥切的醫療。另外，亦應研發高效率低成本之聽損基因檢測工具，以使更多病人得以接受聽損基因檢測，並受惠於最新之醫學進展。

3. 動物研究模式之建立以及新型治療之研發：

對於遺傳性聽損致病成因的日益瞭解，也必將促進吾人於未來擬定及開發新的治療方式，如藥物治療、基因治療及幹細胞治療等治療方式，

以減緩病人聽力之惡化，甚或根本地改善其聽力損失。然而，由於內耳構造精細、功能複雜，而且受損後修復能力有限，並無法直接於人體進行實驗，而細胞株研究之代表性極為有限，若欲研發新型治療方式，則亟須仰賴動物研究模式之建立。

(25)

第二部分：遺傳性聽損之基因流行病學及分子病理學研究

(一) 具有流行病學意義的常見耳聾基因及其突變

近幾年來的研究指出，有些耳聾基因突變，在大多數族群，或至少在特定的族群，具有較高的盛行率，這些耳聾基因包括：GJB2 (Cx26)基因、SLC26A4 (PDS) 基因、粒線體DNA 突變(12S rRNA 基因)、以及 OTOF 基因等，分別介紹於下：

1. GJB2 (Cx26)基因

如前所述，在歐美等國針對高加索人種所做的研究指出，DFNB1 是遺傳性聽損的病人中，盛行率最高的基因座，故當DFNB1 的候選基因 GJB2 (Cx26)被發現後，學者亦開始檢測聽損病人 GJB2 的基因突變。果不其然，

GJB2 的突變仍是遺傳性聽損最常見的基因缺陷：在 56%的法國病人 (Denoyelle et al., 1999)、35-42%的義大利及西班牙病人(Estivill et al., 1998)、以及 40-58%的美國病人(Green et al., 1999)中，可以找到 GJB2 的基 因突變。在這些高加索人種中，最常見的GJB2 基因突變為 c.30delG（或稱 為c.35delG，因為 30-35 由 6 個 G 組成），約佔地中海沿岸GJB2 突變的 85%

(Denoyelle et al., 1999; Estivill et al., 1998)，以及美國 GJB2 突變的 70%

(Green et al., 1999)。

GJB2 為製造 connexin26 分子的基因。Connexin 為細胞與細胞連接時，

形成「間隙連接」(gap junction)的重要分子，存在於細胞膜上，可控制小於 l .2 kDa 的小分子來往於細胞之間(Harris, 2001)。六個 connexin 可組成一組 connexon，鄰近的兩個細胞的 2 組 connexon 則形成一個「間隙連接」，而成為細胞質的連接管道。在耳蝸(cochlea)，除了毛細胞(hair cell)和少數細胞外，幾乎所有表皮細胞(epithelium) 和纖維細胞 (fibrocyte) 都可以找到 connexin26 蛋白的存在，因此一般認為 connexin26 在內耳主司鉀離子的運送及再循環(Spicer et al., 1996)。惟最近亦有研究指出，connexin26 在內耳的重要功能亦包括訊息傳遞物質 Ins(1,4,5)P3 的運送(Beltramello et al., 2005)。如果 connexin 的合成發生問題，則可能影響到細胞之間離子及物質的運送，進而影響到內耳的電生理，導致聽損。

在其他種族的研究中，雖然GJB2 基因突變仍為非症候群型遺傳性聽 損之一常見原因，然而，其突變型與盛行率卻與高加索人種有顯著差異。

阿胥肯那吉猶太人(Ashkenazi Jews)中，最常見的 GJB2 突變為 c.167delT，

而非 c.30delG (Morell et al., 1998)。而鄰國日本的研究則顯示，只有約 12-33% 的病人可找到 GJB2 的基因突變，而最常見的突變為也不是

(26)

c.30delG，而是 c.235delC (Abe et al., 2000; Kudo et al., 2000)。

在歐美針對GJB2 基因突變所做的研究中，學者很快就注意到，約有 1/3 的病人，只能找到一個 c.30delG 的突變，而無法清楚解釋其體染色體隱性之遺傳模式(Marlin et al., 2001)。後來則發現，原來很多這種病人的另一

「對偶基因」(allele)上，帶有另一突變—「del(GJB6-D13S1830)」(del Castillo et al., 2002)。由於此一突變橫跨 GJB6 (Cx30)基因及微衛星基因標識 D13S1830 間約 342-kb 的片段，且極靠近 GJB2 之上游區域，因此學者推估 此突變之致病機制可能有二：其一為藉由喪失 connexin30 之表現而以「雙基因」(di-genic)的方式遺傳〈按：connexin26 與 connexin30 可互相結合形成 connexon〉，其二則為喪失 GJB2 基因上游調控區域(upstream regulatory element)，而影響 GJB2 之第二個對偶基因之正常轉錄作用，進而形成體染 色體隱性遺傳。晚近之一大規模研究顯示，似乎以第二說較為合理(Snoeckx et al., 2005)。而後來的研究也指出，此一 del(GJB6-D13S1830)突變，是西 班牙裔族群人口中僅次於GJB2 c.30delG 之第二常見突變。然而此一突變較 少見於其他地區的高加索人種(Del Castillo et al., 2003b)。

至於臨床表現型方面，根據過去數年的研究，學者們也逐漸歸納出帶有 GJB2 基因突變之病人的一些臨床表徵，包括病人之聽損多為習語前的 中或重度聽損、聽損程度因人而異、有些病人的聽力可能會逐漸變差、以及病人顳骨影像學未合併異常等特徵(Denoyelle et al., 1999)。最近歐美的研究則指出，帶有c.30delG 同型合子突變(homozygous mutation)的基因型常伴隨著較差的聽力(Cryns et al., 2004; Snoeckx et al., 2005)。

2. SLC26A4 (PDS)基因

SLC26A4 (PDS)基因突變是歐美人種中，導致遺傳性聽損第二常見的 原因(Albert et al., 2006)。SLC26A4 (PDS)基因最早是於 1997 年被證實為導致症候群型遺傳性聽損 —Pendred 氏症候群的致病基因(Everett et al., 1997)。除了甲狀腺腫外，Pendred 氏症候群尚常會合併兩種常見的內耳畸形—「大前庭導水管」(enlarged vestibular aqueduct, EVA)和「Mondini 氏發育不全」(Mondini’s dysplasia)。後來則發現，在單獨只有大前庭導水管或 Mondini 氏發育不全，而未合併甲狀腺腫的病人，也可以找到 SLC26A4 基 因的突變(Li et al., 1998; Usami et al., 1999)。換言之，SLC26A4 基因突變，

除了導致Pendred 氏症候群，也會導致非症候群型遺傳性聽損。

SLC26A4 基因，或稱 PDS 基因，位於第 7 對染色體長臂上，由 21 個 exon 所組成。所製造的蛋白質為 pendrin，由 780 個胺基酸構成，分子量約 86 kDa，以 11 個 transmembrane domain 橫跨於細胞膜上(Everett et al., 1997)。分類上，pendrin 是屬於 SLC26A (Solute Carrier Family 26A)家族的蛋白質。這個家族的蛋白質尚包含幾個運送陰離子的蛋白質，如進行氯離子/碳酸根交換的 SLC26A2，以及運送硫酸根的 SLC26A3 等。在蛙卵

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(Xenopus oocyte)及某些細胞株的實驗中，pendrin 被證實是一個陰離子的運輸蛋白，它可以運送碘離子、氯離子及重碳酸根離子(Gillam et al., 2005;

Scott et al., 1999)。在老鼠的內耳中，pendrin 主要分佈於前庭導水管與內淋巴囊的表皮細胞，而Slc26a4 (Pds)「基因剔除鼠」(knock-out mouse)的研究，

也證實了Slc26a4 基因的喪失，的確也會導致老鼠內耳發育的畸形及重度聽 損(Everett et al., 1999; Everett et al., 2001)。因此一般以為 pendrin 在內耳中主要還是扮演調節離子均衡與內淋巴的作用。對於SLC26A4 基因突變導致 內耳畸形的致病機轉，曾有人提出：內耳發育的過程中，pendrin 的功能缺失，致使膜性迷路中內淋巴壓力增加，在前庭導水管使得膜性迷路向外壓迫骨性迷路，進而造成大前庭導水管，而在耳蝸，則導致耳蝸不完全分隔，

形成Mondini 氏發育不全(Petit et al., 2001)。而關於聽力喪失的成因，最近則有研究指出，內淋巴及「血管紋」(stria vascularis)內之酸鹼失衡導致內耳鈣離子回收降低(Nakaya et al., 2007; Wangemann et al., 2007)，以及其所引發之自由基的產生及所伴隨之Kcnj10 蛋白質產生減少(Singh et al., 2008)，乃至內耳局部甲狀腺功能之低下(Wangemann et al., 2009)，皆可能為導致 SLC26A4 基因突變聽覺喪失之重要因子。

帶有SLC26A4 基因突變之病人的臨床特徵主要有二：其一為合併大前 庭導水管或 Mondini 氏發育不全等兩種內耳畸形；其二則為波動性的聽力喪失(fluctuating hearing loss)，亦即聽力極易因外在因素如頭部撞擊而變差，也因此病人之聽損程度彼此之間也有很大差異。目前為止的研究並未能找出基因突變型與表現型之間的關連性，也就是說，我們無法由病人之 SLC26A4 基因突變型，精確地推測出病人是否會發生甲狀腺腫、影像學結 果及聽力學結果等等。

3. 粒線體 DNA 突變

粒線體 DNA 突變可以導致症候群型遺傳性聽損，也可以導致非症候群型遺傳性聽損。前者以m.3243A>G 突變最為常見，此突變發生在一 tRNA 的基因上，病人除聽損外，還會有糖尿病的症狀；後者則以m.1555A>G 突變最為常見，此突變發生在12S rRNA 的基因上(Fischel-Ghodsian, 1999)。

由於遺傳性聽損以非症候群型為主，所以整體而言，仍是以m.1555A>G 突變較為常見。

日本人的研究指出，高達3%的遺傳性聽損人口帶有 m.1555A>G 的突變(Usami et al., 2000)。其聽力學特徵為習語後聽損。聽損情形在不同家族間、甚至同一家族的兄弟姊妹間存在著極大的差異，然而一般而言，聽損程度較其他遺傳性聽損輕微。聽力會隨著年紀而逐漸變差，聽力圖則顯示高頻聽力較易受影響(Usami et al., 1997)。而導致粒線體 m.1555A>G 突變家族內或家族間表現型的差異，則可能來自下列四個機制(圖二)：

(1) 粒線體基因體(mitochondrial genome)之「單套群」(haplogroup)：

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粒線體基因體包含16569 個「鹼基對」(base pair)，這些鹼基對中之任何變異，包括「突變」或「基因多型性」(polymorphism)，都有可能影響到12S rRNA 之基因表現，導致家族內或家族間表現型的差異。

(2) 粒線體 1555A>G 突變之「同質」(homoplasmy)或「異質」(heteroplasmy)：

人體中每個細胞都含有數百到數千個粒線體，而每個粒線體又含有 2

至 10 套的 DNA，若所有的 DNA 都相同，稱為 homoplasmy，反之，

則稱為 heteroplasmy。根據過去文獻，粒線體 m.1555A>G 突變以 homoplasmy 突變為主，然而亦有報告指出，heteroplasmy 突變可見於某些家族，且與患病家族成員聽損程度之間，有相關性(del Castillo et al., 2003a)。

(3) 細胞核基因的影響：

過去的研究也證實，細胞核內的其他基因，也會影響細胞質內粒線體 12S rRNA 基因的表現(Guan et al., 1996; Guan et al., 2001)。因此，細胞核內的其他基因，也極有可能導致粒線體m.1555A>G 突變家族內或家族間表現型的差異。

(4) 外在環境的影響：

如「胺基酸甘醣體」(aminoglycoside)類抗生素暴露的差異(Young et al., 2005)。有研究指出，發生 m.1555A>G 突變，會使得所製造的 12S rRNA 更易與胺基酸甘醣體這類的抗生素結合(Hamasaki et al., 1997)，而加重胺基酸甘醣體的耳毒性，易言之，病人聽力特別易受胺基酸甘醣體所傷害。

4. OTOF基因

OTOF 基因，位於第 2 對染色體短臂上，由 48 個 exon 所組成，於 1999 年被發現是導致非症候群型遺傳性聽損DFNB9 的致病基因(Yasunaga et al., 1999)。所製造的蛋白質稱為 otoferlin，主要分佈於內耳的內毛細胞，一般認為它在內耳的功能，與內毛細胞產生神經訊號時，胞內小囊與細胞膜融合的過程有關。

在西班牙裔非症候群型聽損人口中，約有 3.5%的病人，可以找到

OTOF 的基因突變，其中絕大多數為 c.2485C>T (p.Q829X)突變(Migliosi et al., 2002)。因此，c.2485C>T (p.Q829X)突變，是現在已知僅次於 GJB2 基因 的c.30delG 突變以及 del(GJB6-D13S1830)突變，西班牙裔人口中第三常見 的耳聾基因突變(Rodriguez-Ballesteros et al., 2003)。

帶有 OTOF 基因突變的病人，其臨床特徵主要為「聽覺神經病變」

(auditory neuropathy)。病人呈現先天性、重度之聽損，然而其「耳聲傳射檢查」(otoacoustic emission, OAE)卻呈陽性反應，這是此種病人最大之特徵。

(二) 國內遺傳性聽損之過去相關基因研究及其結果

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1. 國人之 GJB2 基因突變光譜

在過去臺大醫院耳鼻喉部與基因醫學部針對國人所合作的研究中，我們發現，在國人先天性聽損病人中，約只有14.8%的患者顯現 GJB2 的突 變，而其中以c.235delC 最為常見(Hwa et al., 2003)，此點結果與日本人的研究類似(Abe et al., 2000; Kudo et al., 2001)，而歐美研究中較為常見的 c.30delG 及 c.del(GJB6-D13S1830)兩種突變，則均未見於國人。國內中山 醫學大學的研究，也顯示類似的結果—只有10%的病人出現 GJB2 的基因 突變(Wang et al., 2002)。相較於歐美的研究中，動輒 40-60%的病患導因於 GJB2 的基因突變，國人遺傳性聽損人口中，則只有約 10-15%的病人可找 到GJB2 的突變。這不禁讓我們思考，是否還有其他重要基因，導致國人 遺傳性聽損。

附帶一提的是，本研究所探索的GJB2 基因 p.V37I 變異，由於在國 人的對照世代中對偶基因頻率高達10%以上，因此在前述國人的兩個報告中皆被報告為無致病性的基因多型性(polymorphism)，此點與國外報告不同，先以敘明。（詳後述(四) 1. GJB2 基因變異）

2. 內耳畸形之流行病學研究

隨著影像儀器的進步，使得「內耳畸形」(inner ear malformation, IEM) 的診斷率大為提昇。歐美的研究即顯示，先天性聽損的患者中，約有30%

合併內耳畸形，其中大前庭導水管約佔15%，Mondini 氏發育不全佔 12%，

此兩者可以說是內耳畸形中最為常見的兩種畸形(Antonelli et al., 1999)。而且許多證據也顯示，內耳畸形可由基因突變所造成(Anagnostopoulos, 2002;

Li et al., 1998; Usami et al., 1999)。由於大多數的遺傳性聽損屬於非症候群型，無其他身體表徵可供辨識，因此以影像檢查結果作為表現型的分類基準，來研究遺傳性聽損，不失為一可行的切入點。於是，我們研究團隊於 2003 年起，即著手針對內耳畸形病人進行一系列之流行病學研究：我們回顧性分析臺大醫院於之前五年內，因為感覺神經性聽力損失接受顳骨高解析度電腦斷層掃描，並接受完整聽力檢查之18 歲以下病人 160 例。結果發現，高達37%的聽損病童可發現內耳畸形，其中又以大前庭導水管、

Mondini 氏發育不全、前庭擴大 (large vestibule) 及半規管發育不全 (semicircular canal dysplasia)等四類畸形特別常見。由於此四類畸形經常合併出現且又分別位於四處不同之內耳解剖位置，而聽力學特徵亦具同質性，因此吾人以為其致病機轉可能雷同，並取此四種畸形之英文字首，而合稱之為「EMVS 複合畸形」(EMVS complex)(Wu et al., 2005b)。

　 3. 小結

綜觀在吾人進行本研究之前國內遺傳性聽損之相關研究，儘管陸陸續續有些結果發表，但不難發現這些都是一個片段、一個片段的發現，很

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難整理出一個全盤性的概觀。而這些結果也指出，常見的耳聾基因如 GJB2，國人呈現出不同於國外的突變光譜，再度證明了常見的遺傳性聽 損基因及其突變因種族不同而異，也凸顯了建立國人本土資料的必要性。

(三) 當前國人遺傳性聽損基因流行病學所待進行之工作 1. 國人遺傳性聽損病人檢體庫之建立：

如上所述，由於常見的耳聾基因及突變常具有明顯的種族間差異，易言之，吾人臨床上並無法直接採用國外的研究結果，來作為遺傳諮詢的準則。若要提供病患及其家屬正確的資訊，顯然必須仰賴國人自己資料的建立。而以此一檢體庫為基礎，吾人日後亦可致力於新耳聾基因的找尋或其他研究。

2. 針對常見的耳聾基因及其突變，作一完整之盛行率的調查：

綜觀之前國內遺傳性聽損之相關研究，儘管陸陸續續有些結果發表，但卻都只是片片段段的發現，很難整理出一個完整的概觀。我們認為，唯有進行一大規模的遺傳性聽損之基因流行病學研究，方能釐清各耳聾基因突變之相對重要性，以解決當前研究的瓶頸。

3. 分析比較常見的基因型與表現型之間的關連性，以作為臨床評估之參考：

歸納整理 GJB2、SLC26A4 及粒線體 DNA(12S rRNA 基因)等常見耳聾基 因突變之臨床表現型，探討各基因型與表現型之間的關連性，並找尋會影響臨床表現的因子，以助吾人利用基因檢測結果來評估病人的預後。

4. 分析比較不同的病人來源，是否會影響遺傳性聽損基因流行病學的研究結果，以作為研究報告校正之基準：

文獻上關於聽損基因流行病學研究的報告，病人來源包括醫院、聽障學校及聽語復健中心等，由不同的病人來源所獲得聽損基因流行病學資料是否相同，並非毫無疑義。過去的研究也指出，以不同的納入標準收集病人，

即使研究族群為同一種族，也會導致聽損基因流行病學研究結果的歧異 (Green et al., 1999; Lim et al., 2003)。因此，若能擴充基因檢體庫之病人來源，應該可以提供機會來檢視遺傳性聽損基因突變之機構間及地區間差異，並更精確地評估國人聽損基因流行病學之結果。

(四) 遺傳性聽損基因變異致病機制之釐清

除了研究基因流行病學資料之外，釐清遺傳性聽損基因變異之致病機制，也有助於吾人瞭解病人聽損之成因，進而研擬相對應之治療策略。如前揭說明，常

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見之聽損變異雖已陸續報告於文獻，然其詳細之致病機制，則有待吾人進一步之探索：

1. GJB2 基因變異

雖然 GJB2 基因是文獻中報告最多之耳聾基因，然而有些變異之致病 性，卻仍存有爭議。其中，吾人最感興趣的，當屬漢人最為常見之 p.V37I 變異。

GJB2 基因的 p.V37I (c.109A>G)是東方人相當常見的基因變異，根據國 人之前的研究，其「對偶基因頻率」(allele frequency)在一般人中約為 11~12%，亦即，國人約高達四分之一的人口為此一變異之帶原者，因此以往一直被認為是一無致病性之「基因多型性」(polymorphism)(Hwa et al., 2003)。然而，邇近的研究指出，該一基因變異可能會以體染色體隱性的遺傳模式，導致輕度至中度的感覺神經性聽損(Dahl et al., 2006; Huculak et al., 2006; Snoeckx et al., 2005)。由於歐美高加索人種族群中，GJB2 基因 p.V37I 變異的對偶基因頻率不高，所以這些論文中所報告的p.V37I 變異「同型合子」(homozygote)之數目皆不多，臨床表現型之記錄也不完整。相對地，國人中此一基因變異的高盛行率，無疑提供我們一大利基，來釐清 GJB2 基 因p.V37I 變異之致病性及其於國人輕度至中度感覺神經性聽損病人間之盛行率，並整理其同型合子病人之臨床表現型。

2. SLC26A4 基因變異

如前揭說明，SLC26A4 基因突變係以隱性的遺傳模式導致 Pendred 氏症候群和非症候群型大前庭導水管。然而，臨床上在相當比例的病人，吾人卻只能找到單一的SLC26A4 基因突變，而且目前為止的研究也尚未能找 出基因突變型與表現型之間的關連性。為了完整釐清基因因素所扮演的角色，則有待進一步之研究。

另一方面，帶有SLC26A4 基因突變之病人臨床上所常見的急性波動性 聽力喪失，也一直都是耳鼻喉科醫師必須經常面臨的難題。而由於其詳細機制不明，故關於此類波動性聽力喪失之處理，雖然有一些傳統的治療方式(如投與類固醇或降腦壓藥物)，然而皆欠缺確實之基礎醫學依據，以致於治療效果往往無法預期。此一部分，亦值深入探研。

3. 粒線體 12S rRNA 基因變異

如前揭說明，粒線體 12S rRNA 基因變異中，以 m.1555A>G 突變最為常見，而其臨床主要特徵，除了抗生素之耳毒性外，即屬家族內成員或家族間比較，表現型存在極大之差異。雖然m.1555A>G 突變之盛行率，未如 GJB2 及 SLC26A4 之盛行率高，然而迥異於 GJB2 及 SLC26A4 等隱性基因 突變，m.1555A>G 突變之患病家族，其成員患聽損者動輒以數人計，一旦遺傳下來，多數兄弟姊妹皆可能患病。此外，粒線體m.1555A>G 是目前已

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知的非症候群型遺傳性聽損突變中，唯一可以事前預防其聽力惡化的，亦即，只要針對帶有m.1555A>G 突變之病人，避免其使用「胺基酸甘醣體」

(aminoglycoside)這類的抗生素，就能夠預防病人聽力急速惡化，這也就是粒線體m.1555A>G 突變臨床上之重要性及特殊性，而瞭解其致病機制，自然也成為臨床醫師刻不容緩的課題。

相對於 GJB2 及 SLC26A4 此二基因之突變，由於病例較多，相關發現 已可被應用於遺傳諮詢及產前診斷之上。然而，針對病例較少的粒線體 m.1555A>G 突變，吾人目前則尚未能精確地評估病人的預後。由於粒線體 m.1555A>G 突變具其臨床上之重要性及特殊性，因此極富研究價值，若能深入探研其家族內或家族間表現型差異之原因，無疑將可彌補臨床上遺傳諮詢在這方面的缺口。

(五) 結論

遺傳性聽損基因及其突變，常因種族不同而存在著很大的差異，易言之，吾

人臨床上並無法直接採用國外的研究結果，來作為遺傳諮詢的準則。若要提供病患及其家屬正確的資訊及診斷，顯然必須仰賴國人自行完成一大規模且完整的基因流行病學調查。而以此一檢體庫為基礎，吾人日後亦可致力於新耳聾基因的找尋或其他研究。

同時，一些常見耳聾基因變異之致病機制，諸如：GJB2 基因的 p.V37I 變異 之致病性、SLC26A4 基因變異之基因型與表現型之關連性、SLC26A4 基因變異如何導致聽損、以及影響粒腺體m.1555A>G 突變臨床表現型之因素等，皆有待吾人釐清，以助於吾人了解病人聽損發生之原因，進而針對該原因研擬治療方針。

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第三部分：遺傳性聽損基因檢測之臨床應用

(一) 遺傳性聽損基因檢測之一般臨床應用 1. 病人聽力預後之評估

基於過去幾年之臨床遺傳研究，特別是「基因型- 表現型關連性」 (genotype-phenotype correlation)方面的研究，目前我們已較能根據病人所帶有的基因突變類型，預測其預後。蓋基因的變異可以說是聽損發生最直接的證據，而藉由觀察並歸納以往的案例，我們發現同一種基因變異，其聽損的表現也類似。例如，帶有GJB2 基因變異的個案，聽損的程度通常 是不太惡化或惡化極慢的；而帶有 SLC26A4 基因變異的個案，臨床上則 常合併大前庭導水管，以及反覆發作的波動型聽力喪失；而帶有粒線體 12S rRNA 基因變異的個案，聽損的程度則會隨著年齡增長而逐漸變差，

尤其是若接觸到胺基酸甘醣體這一類的抗生素，聽力就會立刻變差。所以，如果能知道個案的基因診斷，就能夠知道往後聽力是否會繼續惡化。

2. 危險因子之避免

某些特定之遺傳性聽損，會因耳毒性藥物的暴露而急速惡化。最著名的，

就是前述粒線體12S rRNA 基因上 m.1555A>G 突變之胺基酸甘醣體耳毒易感性。因此，若病人檢測出帶有粒線體 12S rRNA 基因的 m.1555A>G 突變，我們會特別告知病人應特別注意胺基酸甘醣體之類的藥物，並發予可供病人隨身攜帶之小卡片(圖三)，以確實防止他科臨床醫師投與這些病人此類的藥物治療，杜絕其聽力之急遽惡化。

3. 產前診斷與遺傳諮詢

如同其他常見的遺傳性疾病，經由耳鼻喉部、婦產部及基因醫學部的跨科部合作，我們已可正確且迅速地完成遺傳性聽損之產前診斷。分別以施行羊水穿刺及絨毛膜取樣的方式，目前臺大醫院已順利完成數例聽損家族待生胎兒之基因檢測。易言之，藉由更精確地掌握病人之基因診斷，吾人對於遺傳性聽損之家族，已不再居於如過去般被動的角色，而僅能明示或默示其家屬利用結紮或其他節育措施，以避免生育出聽力損失之下一代。相反地，吾人可以主動地利用基因篩檢，檢測出其家族所帶有之基因突變，

而當其家族成員再度懷孕時，利用羊水穿刺、絨毛膜取樣或其他方法，於產前為胎兒做出診斷，以提供其家族為決定時之參考。

4. 小結

如同其他遺傳疾病，過去幾年來遺傳性聽損的研究，也逐漸地被應用於臨

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床醫學以幫助病人及其家屬，其要者悉如前述。惟吾人以為，根據我們過去幾年來聽損基因檢測所建立的資料及研究成果，若能結合其他領域醫學的較新進步，或許能從中找尋出聽損基因檢測新的臨床應用。

(二) 臨床新應用一：以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成效 1. 研究背景

「人工耳蝸」(cochlear implant, CI)植入手術近年來已被廣泛應用於治療助聽器效果不彰之重度聽損。然而，人工耳蝸相當昂貴（成本平均約 80 萬台幣）且植入手術本身具侵襲性，而術後不論是聽損兒童、家長還是聽語老師更要花費很長的時間並投入相當多的人力、物力進行聽語復健或聽能創建，但是，卻不是所有接受手術的案例都能獲得良好的成效。因此，找出預測其術後成效之指標，一直是臨床工作者所引頸企盼的。

2. 以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成效之原理

目前已知，手術年齡、人工耳蝸使用期間、術前殘存聽力及影像學檢查結果與人工耳蝸之術後成效有關。其中，影像學檢查被認為有助於醫師術前篩選適當病例，特別是內耳畸形中的「內聽道狹窄」(narrow internal auditory canal, NIAC)，更是文獻上唯一確定之不良預後指標。然而，內聽道狹窄之病例於所有病人中僅佔極少數，而影像學結果又多偏重於形態之描述，無法提供精確的聽損致病成因。職此，尋找其他預測指標存在其實用性及必要性，而基因診斷，由於是病人聽損發生成因的直接線索，故可能為人工耳蝸植入手術術後聽語復健或聽能創建效果好壞的重要指標。

3. 文獻回顧

晚近確有若干研究報告以基因檢測結果預測人工耳蝸植入手術術後成效，這些報告皆以GJB2 基因突變為研究對象。其結果顯示，帶有 GJB2 突變的病人，接受人工耳蝸植入手術之後，均能獲得不錯之效益(Lustig et al., 2004; Sinnathuray et al., 2004a; Taitelbaum-Swead et al., 2006)。然而，常見耳聾基因變異，並非僅限於GJB2，而這些研究報告，也往往只著重於 基因檢測結果，而未能將會影響人工耳蝸植入手術預後的其他因子一併納入考量，故其所能提供的訊息相當有限。

3. 小結

以聽損基因檢測結果來預測人工耳蝸植入手術的術後成效，邏輯上雖然相當合理，但過去國外的研究，僅侷限於特定的基因—GJB2，且未同時考量其他的干擾因子，因此臨床上的應用相當有限。我們認為，應於病人進行所有已知常見耳聾基因的突變檢測，並同時考量其他預後因子，方

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能提供一完整、通用的預測模式。

(三) 臨床新應用二：研發高效率低成本之基因診斷工具 1. 國內特發性感覺神經性聽損基因檢測之現況及困境

(1). 吾人現行的基因檢測方法

由於有多個常見的致病基因會導致國人特發性感覺神經性聽損，

所以進行聽損的基因檢測時，必須同時兼顧臨床上較重要的幾個基因，方能減少遺漏，以求周全。因此，我們目前所採行的基因檢測方法，乃係使用DNA「直接定序」(direct sequencing)的方法，於所有病人一次掃瞄三個國人常見的耳聾基因：GJB2 (Cx26)基因、SLC26A4 (PDS)基因及粒線體 12S rRNA 基因。對於特定表現型的病人如聽覺神 經病變或BOR 症候群等，本研究亦針對 OTOF 基因和 EYA1 基因等進 行突變掃瞄。

吾人所掃瞄的DNA 片段主要含括這些基因的所有 exon、以及 exon 與intron 交界處會影響 RNA splicing 的序列。使用直接定序的優點是可以獲得整段完整的 DNA 序列資料。由於吾人開始進行國人聽損的基因檢測時，國人常見的基因突變尚屬未知，因此，使用此種可以獲得整段完整 DNA 序列資料的直接定序方法，是有其邏輯上之合理性及必要性的。

(2). 吾人現行基因檢測方法的缺點

以直接定序法進行基因檢測最主要的缺點是必須耗費大量的人力、物力及時間。如前所述，GJB2 基因包含 2 段 exons，SLC26A4 基因包含21 段 exons，粒線體 12S rRNA 基因全長則包含約 1000 個鹼基對(mitochondria map position: 648-1601 b.p.)，姑且不論聽覺神經病變等其他特殊表現型的病人，光是一般病人，我們至少就需要進行約25 次的PCR 反應，以及其後的 PCR 產物純化與定序等工作，其中所耗費的人力、物力及時間不難推算。

2. 當前適合國人之基因檢測方法

若族群中基因突變主要分佈的位點已知，則吾人應可不必一一針對所有可能相關的 DNA 片段進行完整的序列掃瞄，而僅需針對這些常見或可能發生變異的位點加以檢測，即可為大多數病人完成基因診斷。由於國人 98%以上都是由漢人組成，且其中多數祖先源自華南地區，所以種族上的人口組成不若歐美人種那樣複雜。迄今為止，目前於國人所發現與特發性感覺神經性聽損有關的基因變異，不出30 至 50 個位點。考量國內當前的現況並參考迄今為止的研究成果，本研究認為，以SNaPshot 方法進行基因