第三階段

第五章非線性沖堤中層析峰滯留順序交錯現象之探討

5.2.3.3 第三階段

A40:60。將 5 mM 的磷酸鈉緩衝液（pH 4.2）與 ACN 以 40：60 比例混合，再以此溶液配製成10 mM TBA 的動相溶液，命名為動相 B40:60。 New Coccine 與 Carmoisine 溶於去離子水中配製成各別為 300 mg L^-1

的樣品溶液。首先各將20 μL 的樣品注入管柱中，分別將 A40:60和B40:60

二組動相以流速1 mL min^-1進行線性沖堤，在樣品注入的同時，啟動 UV/Vis 偵測器收集樣品管外訊號。

連續性梯度沖堤步驟，初始動相100%的 B_40:60以流速1 mL min^-1 的實驗條件進行管柱平衡，接著分別在樣品注入6、8、10、14、20、

30 分鐘內，動相組成逐步轉換為 100%的 A_40:60，隨著梯度完成所需時間越短，動相轉換速度越快。樣品注入後立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集訊號。在動相轉換完成所需時間為 6、8 分鐘的實驗中，WCD 系統之數據取點間距時間為約 5.2 秒；動相轉換完成所需時間為 10 分鐘的實驗中，WCD 系統之數據取點間距時間為 5.4 秒；動相轉換完成所需時間為 14 分鐘的實驗中，WCD 系統之數據取點間距時間為 5.6 秒；動相轉換完成所需時間為 20 分鐘的實驗中，

WCD 系統之數據取點間距時間為 5.8 秒；動相轉換完成所需時間為

組成變為 100%的 A40:60，樣品注入後立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集訊號，WCD 系統之數據取點間距時間為 5 秒。

根據以上三階段實驗的結果，找到最佳觀察分析物滯留順序對調現象之條件後，將New Coccine 與 Carmoisine 混合溶於去離子水中配 製成濃度100 mg L^-1的樣品溶液。初始動相100%的 B_40:60以流速1 mL min^-1的實驗條件進行管柱平衡，接著在樣品進樣後 3.5、3.75、4、5 分鐘時，瞬間將動相組成變為 100%的 A_40:60，樣品注入後立即開啟 WCD 系統收集樣品流經管柱過程的樣品空間波峰訊號，WCD 系統之數據取點間距時間皆為約5 秒。

5.3 結果與討論

5.3.1 第一階段

動相 A50:50和 B50:50以 1 mL min^-1的流速對樣品 New Coccine 與

Carmoisine 進行線性沖堤後，傳統單通道偵測器所收集到的層析圖譜

如圖5-1(a)與圖 5-1(b)所示。A50:50沖堤 New Coccine 時，樣品滯留時 間為2.44 分鐘；B50:50沖堤 New Coccine 時，樣品滯留時間為 4.93 分

鐘；A50:50沖堤Carmoisine 時，樣品滯留時間為 2.68 分鐘；B50:50沖堤

WCD 系統所得之所有樣品的遷移路徑圖統整於圖 5-2(a)中，可明顯的看出，New Coccine 在兩種動相分別沖堤的情況下，其滯留時間變化程度較 Carmoisine 劇烈，這樣的變化導致兩化合物之滯留順序對 調，但由於樣品整體滯留時間相當短（皆小於5 分鐘），WCD 系統所得遷移路徑圖之間隔距離小，未來要觀察到管柱內混合樣品之滯留順序交錯現象恐怕不易，所以縮小動相流速成0.5 mL min^-1，以期加長滯留時間，增加在管內觀察到交換現象之可能性，故在開始連續式梯度沖堤實驗前，先將動相 A50:50和B50:50以0.5 mL min^-1的流速對樣品 New Coccine 與 Carmoisine 進行線性沖堤，觀察 WCD 系統所得之所

有樣品的遷移路徑圖（圖 5-2(b)），接著以連續式梯度沖堤的條件進行實驗，期望在單一組沖堤實驗中可以完整觀察到分析物滯留順序對調現象。

圖5-3 為 New Coccine 與 Carmoisine 連續式梯度沖堤實驗中，WCD 系統所得之所有的樣品遷移路徑圖，圖5-3(a)為 New Coccine 之遷移 路徑圖，圖 5-3(b)為Carmoisine 之遷移路徑圖，由圖可看出，在動相 持續變化的同時，遷移曲線在每個時間點的切線斜率亦皆持續在改

移曲線取出作比較，結果如圖 5-4，3 種連續式梯度沖堤實驗中，皆

合樣品滯留順序交錯之現象。

5.3.2 第二階段

動相 A45:55和 B45:55以 1 mL min^-1的流速對樣品 New Coccine 與

Carmoisine 進行線性沖堤後，傳統單通道偵測器所收集到的層析圖譜

如圖5-6(a)與圖 5-6(b)所示。A45:55沖堤 New Coccine 時，樣品滯留時 間為4.16 分鐘；B45:55沖堤 New Coccine 時，樣品滯留時間為 9.49 分

鐘；A45:55沖堤Carmoisine 時，樣品滯留時間為 5.29 分鐘；B45:55沖堤

Carmoisine 時，樣品滯留時間為 8.28 分鐘。增加動相極性確實增大

樣品整體滯留時間，並且使兩化合物之滯留時間差異有些微的增加，

如此一來，分析物滯留順序調換情形預期將更容易被觀察到。

圖5-7(a)、5-7(b)分別為 New Coccine 與 Carmoisine 連續式梯度沖 堤實驗中WCD 系統所得之所有的樣品遷移路徑圖，由左至右的曲線分別代表樣品在 2、4、6、8、10、12、14、17、30 分鐘內完成動相梯度變化的實驗結果，由圖可看出，在動相持續變化的同時，遷移曲線在每個時間點的切線斜率亦皆持續在改變，也就是樣品移速時時刻刻都在改變中，而隨著改變動相變化的程度越劇烈（動相變化所需之

析物滯留順序交錯現象的觀察。分別將兩化合物的遷移曲線取出作比較，由於實驗條件相當多，故選出最有機會看到滯留順序交錯現象的幾組實驗結果即可，即動相梯度變化完成時間2、4、6 分鐘等 3 組條件，如圖5-8 所示，2、4 分鐘內完成梯度變化速度似乎太快（遷移曲線交會點在近管柱入口處），所以導致當化合物初抵達管柱內可觀測範圍時，New Coccine 便已追趕上 Carmoisine，並且開始進行順序交錯現象末期的分離動作；6 分鐘內完成梯度變化速度又稍嫌太慢（遷移曲線交會點在近管柱出口處），當樣品已抵達近管柱末端時，才看得出New Coccine 追趕上 Carmoisine 的情形，不過，值得注意的是，

3 種連續式梯度沖堤實驗中，已可稍微觀察看出分析物滯留順序交錯現象的雛型，但是由於兩化合物滯留時間差距亦不大，所以即便再嘗試更多連續式梯度沖堤條件，滯留順序交錯現象亦不明顯，故接下來嘗試階梯式梯度沖堤來進行實驗。

階梯式梯度沖堤實驗結果如圖 5-9 所示，兩化合物在注入 2 分鐘時瞬間改變動相組成的條件下，可明顯看出兩化合物的分離-混合-分離之現象，且從圖中可看出，雖然實驗操作條件是在樣品注入2 分鐘

在管柱內移動時會有所謂的樣品延遲時間出現（於 5.3.1 所述）。雖然說從以上遷移曲線結果來看，我們已經可以明顯的觀察到樣品滯留順序交錯現象，但是如果我們將兩化合物的完整遷移路徑圖列出的話

（如圖5-10，實線所表現的是波峰頂點之位置與時間關係、虛線則表示波峰兩側十分之一高度處的位置與時間關係。），可以發現，兩化合物在管柱內移動過程中，其波峰重疊的部份相當多，如果打入混合兩種化合物之樣品溶液，再以本章節中所使用的階梯式梯度沖堤條件進行實驗，則可能從頭到尾只觀察到一個結合2 化合物的混合波峰在管柱內移動，無法分辨出兩化合物出現分離-混合-分離等滯留順序交錯現象，故接下來再繼續提升動相極性，使兩動相對樣品之溶劑強度差異增大，以期觀察到管柱內的層析峰滯留順序交錯現象。

5.3.3 第三階段

動相 A40:60和 B40:60以 1 mL min^-1的流速對樣品 New Coccine 與

Carmoisine 進行線性沖堤後，傳統單通道偵測器所收集到的層析圖譜

如圖5-11(a)與圖 5-11(b)所示。A40:60沖堤New Coccine 時，樣品滯留 時間為 7.03 分鐘；B40:60沖堤 New Coccine 時，樣品滯留時間為 16.1

圖5-12(a)與圖 5-12(b)分別為New Coccine 與 Carmoisine 連續式梯 度沖堤實驗中，WCD 系統所得之所有的樣品遷移路徑圖，由左至右的曲線分別代表樣品在 6、8、10、14、20、30 分鐘內完成動相梯度變化的實驗結果，由圖可看出，在動相持續變化的同時，遷移曲線在看出，New Coccine 與 Carmoisine 在沖堤過程中，初期是分離狀態，

但是隨著沖堤過程中動相的改變，兩化合物的滯留時間發生重疊，接著再度分離，兩者之滯留順序產生調換，但是由於兩化合物滯留時間差距相當小，若注入混合樣品然後以此連續式梯度沖堤條件進行實驗的話，應該會在整個沖堤過程中只觀察到一組混合波峰在管柱內移動，故接下來嘗試以階梯式梯度沖堤條件來進行實驗。

滯留順序調換現象，且由於本條件中所使用之動相極性較第二階段所使用之動相極性來的大，故樣品受靜相滯留作用力的程度較第二階段所使用之條件來的更大，導致樣品之空間波峰寬度較窄（參考第3 章實驗之結果與討論），如此一來，即便圖 5-14 與圖 5-10 等樣品遷移路徑圖結果看似相同，但其實在第三階段的條件下，混合樣品之滯留順序交錯的現象將會更容易被觀察到，故接下來打入混合樣品，以上述之階梯式梯度沖堤的條件對混合樣品進行沖堤，以期觀察到兩組層析峰滯留順序交錯之現象。

圖5-15 為將混合樣品注入管柱後，以第三階段之階梯式梯度沖堤條件對樣品進行沖堤，WCD 系統所得的沖堤過程中管內樣品空間濃度分佈圖，由圖5-15(a)-(c)可見，樣品注入後 3.5、3.75、4 分鐘時瞬間改變動相，皆可使混合樣品在管內產生分析物滯留順序交錯現象

（化合物分離-混合-再分離），但若更慢改變動相的話（樣品注入後5 分鐘時瞬間改變動相），則無法在流析過程中看到順序交錯現象後期的分離情形（如圖5-15(d)），雖然可以更清楚看到交錯現象初期的分離-混合情形，但是由於本研究之目標是在一次流析過程中觀察到完

的B40:60以流速 1 mL min^-1的實驗條件進行管柱平衡，接著在樣品進樣後4 分鐘時，瞬間將動相組成變為 100%的 A40:60，這樣的沖堤條件可完整的觀察到兩化合物出現分離-混合-分離等滯留順序交錯現象

（如圖5-16）。

5.4 結論

梯度沖堤是液相層析系統經常使用的一種改進分離效率的方法，層析法最理想的分析狀態是：以最短的使用時間使分析物得到最高的分離解析度，當分析物滯留時間過長時，層析學者以改變沖堤動相組成使樣品之整體滯留時間縮短，便可提升分離效率。在本研究中，藉由直接的觀察到樣品在管柱中發生的滯留順序交錯現象，使我們更清楚的了解，只要選擇特定的動相來對樣品進行梯度沖堤，其所能改變的不只是讓沖堤時間縮短等作用，由於不同動相會對分析物產生的不同的分離競爭力，這樣的競爭現象會致使梯度沖堤亦可以有機

在文檔中以全管柱偵測法探討液相層析之分離 (頁 128-163)

第五章 非線性沖堤中層析峰滯留順序交錯現象之探討

5.2.3.3 第三階段

5.3 結果與討論

5.3.1 第一階段

5.3.2 第二階段

5.3.3 第三階段

5.4 結論

第五章非線性沖堤中層析峰滯留順序交錯現象之探討