全管柱型偵測（WCD）系統介紹

在進行各類的流體實驗如流動注入分析法，液相層析（liquid chromatography, LC）、氣相層析（gas chromatography, GC）和毛細管 電泳（capillary electrophoresis, CE）時，傳統常見的單通道偵測器，

通常銜接於管柱出口來對通過之樣品進行偵測。流經偵測器的樣品訊 號通常以「時間對訊號強度值」的方式記錄，然後再對所得訊號進行 研究與探討。然而，有些科學家認為以上所述的單通道偵測器並非唯 一一種可以觀察流體行為的偵測系統，所以，便開始發展所謂的多通

第一篇有關多通道偵測系統的文獻於1988年發表[17]，Evans和 McGuffin使用雙通道偵測器來觀察螢光樣品在毛細管中的流動行 為，藉著觀察分析物在2偵測點間的趨勢，可排除分析管柱中所謂的 管外效應（extracolumn effect）對樣品產生的影響。之後，Rowlen等 人設計了一組解析度更高的多通道偵測系統[18,19]，將14組紫外光感 二極體（UV-sensitive photodiode）架設在玻璃材質的層析管柱外，用 來即時觀察樣品在層析管柱中進行沖堤時的遷移分佈情形，對這種偵 測系統，作者命名其為全管柱偵測（WCD）系統，但在這套偵測系 統開發出來前，作者在1986年便以電腦模擬的方法來表現全管柱偵測 器觀察流體行為的結果[20]，並且提出使用全管柱偵測系統的優點及 其潛力等論述；延續電腦模擬的研究之後，作者著手開發WCD系統，

並 且 以 實 驗 數 據 來 證 實 使 用WCD 的 確 對 高 效 能 液 相 層 析

（high-performance liquid chromatography, HPLC）有相當地優勢與價 值，其列舉出來可能的優勢如下：

1. WCD系統可以真實的記錄樣品於管柱前端、尾端等不同位 置的分佈與流析時間。

3. 更精確的得到滯留因子（retention factor）。

4. 可測量動靜相間平衡的速度。

5. 可以實驗證明滯留因子在線性層析（linear chromatography）

或者非線性層析（non-linear chromatography）過程中的改變 狀況。

當WCD系統的用法及優勢被提出後，相當多的分離科學者開始改 良這套偵測系統，捨棄先前所使用的分離式光能轉換器（discrete photon transducer），改以電荷耦合元件（charge-coupled device, CCD）

為訊號接受器，這是一種陣列式的光電耦合檢像器，上有許多排列整 齊的電容能感應光線，並將影像轉變成數位訊號，在擷取影像時，有 類似傳統底片的感光作用，常被應用於數位相機、光學掃描器與攝影 機等感光元件。CCD的使用大幅增進了WCD系統的效能，其陣列式 的電路排列除了大幅提升偵測器空間解析度以外，影像擷取的效果還 可以讓使用者觀察到更生動真實的樣品分析過程，但是由於市售CCD 尺寸上的限制，所以在這套技術發展初期，是用於觀察小範圍毛細管 內 的 樣 品 流 動 情 形 。 一 般 毛 細 管 的 管 柱 材 質 是 融 熔 二 氧 化 矽

只要將塗布於外層的聚醯亞胺除去，便可使光線穿透過玻璃進而觀察 到管柱內樣品移動情形，所以當WCD這類偵測系統開始受到關注 後，便有很多科學家將這樣的技術用來觀察毛細管電泳中樣品移動分 佈的情形，其中又以觀察毛細管導電聚焦（cpillary isolectric focusing, CIEF）實驗中樣品流體行為等研究最為常見，當具有不同等電點的 物質被注入管柱後，其分離可藉著管中的緩衝混合液沿著管柱連續地 改變酸鹼值來完成，分析物則會停留在其特定的管柱位置而形成狹窄 的區帶，等電聚焦分離是基於分析物的平衡性質的差異，而不是遷移 速率的差異，所以一旦分析物遷移至特定管柱位置時，其區帶位置則 會保持一定且不再隨時間改變[1]，這樣的分離機制如果以WCD系統 來當做偵測系統的話，可以不必等到樣品遷移至管外之前，便能得到 分析分離結果，而且還可以直接觀察分析物遷移的整個平衡過程，這 些資訊都可以更迅速的幫助實驗操作者找到適當的操作條件來提升 分離效率。

第一次將WCD系統運用來觀察毛細管等電聚焦系統的科學家是 Wu等人[21]，作者以雷射光源激發管內樣品使其放光，然後以全管柱

[22-27]。在WCD系統的發展史中，CCD的裝置與使用方法多有不同，

有些學者是以CCD直接收集光訊號然後轉換成電訊號來進行研究分 析，有些則是將CCD搭配光學設計的零件來使獲得更寬廣之觀察範圍 的訊號，例如使用數位攝影鏡頭來收集樣品移動影像，Nilsson等人就 是以CCD攝影機來記錄毛細管電泳實驗中的DNA片段的螢光影像 [28,29]。甚至有科學家使用WCD系統來獲得部分實驗參數後，便可 預測在CIEF實驗中分離150種樣品之混合物的分析結果[30]。

除了以具透光性的融熔二氧化矽運用於毛細管電泳外，在液相層 析的發展初期，其實也是以具透光性之玻璃材質的層析管柱來進行分 離實驗的，所以在WCD技術開始發展後，便有科學家使用錄影影像

（video-imaging）擷取的偵測方法來觀察填充靜相後的玻璃管柱內樣 品移動的情形。Tamura等人以CCD攝影鏡頭來直接記錄發螢光樣品 在 逆 相 高 效 能 層 析 （ reversed-phase high performance liquid chromatography）玻璃管柱中的分離過程影像[31,32]。Guiochon等人 也設計了一套WCD系統，用來收集層析系統中樣品沖堤過程中的影 像訊號[33-35]，並且點出一般HPLC管柱中常用來防止靜相流失的擋

訊號來進行分析處理，這樣的技術較先前所提的以光能轉換器為訊號 收集器的偵測方法，大幅提升了其空間解析度，並且可以獲得物質遷 移過程中的三維資訊：樣品遷移時間、樣品濃度強度（peak height）、

樣品分佈範圍（peak width）藉由獲得更多樣品在層析過程中的動態 層析資訊（dynamic chromatography information），將有助於分析管柱 內所發生的層析流體行為，進而改善實驗條件來達到分離效率提升的 目標。

雖然以上已經介紹多組WCD系統，但是這些系統都沒有同時整合

「直接獲取分析訊號」、「高解析度」、「大範圍觀測視窗」等裝置優勢，

所以本實驗室組裝設計了一套WCD系統與耐高壓玻璃管柱，結合兩 者，可大範圍（21 cm）的觀察分析物在一般常用的HPLC實驗條件下 之分離過程，藉由對管柱內樣品行為的了解，本研究將修正一些平常 容易被忽視的錯誤層析觀念，以及發掘一些隱藏於管柱內不易被關注 到的層析現象，供未來層析學者進行更深入的探討。