第二章 儀器設計及裝置
2.1 實驗
2.1.2 藥品
Tartrazine(黃色四號合成色素)，dye content approx. 90%，分子量
534.36，最大吸收波長 430 nm，購自於 SIGMA(Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO, USA)。
Anthrarufin，購自於 Aldrich (WI, USA)，其分子量 240.41，最大
吸收波長 425 nm，溶於丙酮中使成為樣品溶液。動相組成為甲醇與 水。甲醇與丙酮皆屬 HPLC 級溶劑，亦購自 Aldrich。實驗用水為經 過Millipore(Beford, MA, USA) Milli-Q 處理的 18.2 M Ω 去離子水。
分析，便可得數種不同的實驗數據類型，此段落將對本研究中所獲得 的各種類圖譜進行定義。
由於本研究當中使用 2 組偵測系統（WCD 與傳統 UV/Vis 偵測 器），所以在這裡我們先定義(圖 2-10)：以 UV/Vis 偵測器收集訊號時，
為固定一個偵測管柱出口的位置，隨時間來擷取樣品通過偵測位置的 訊號，故所得的圖形橫座標單位為時間、縱座標單位為訊號強度，此 類型數據即稱之為時圖（temporal profile），且由於此組數據是在管柱 外之環境所收集而得，故又稱管外（post-column）時圖。使用 WCD 系統時，可以同時偵測大範圍的樣品分佈，如同瞬間拍照的技術，獲 取樣品在一維管柱空間中的訊號強度值，獲得的圖譜橫座標為管柱位 置、縱座標為訊號強度，此類型之數據稱為空圖（spatial profile），且 由 於 此 數 據 是 在 管 柱 內 之 環 境 所 獲 得 ， 故 亦 可 稱 之 為 管 內
（on-column）空圖。
WCD 系統除了可以獲得管柱內樣品的空圖訊號，若將固定一訊 號收集點所獲得的訊號強度隨著時間累積起來的話，亦可獲得橫座標 單位為時間的管內時圖數據（圖2-11）。
T1、T2、T3…Tn等流析時間時〝拍攝〞到樣品於管柱內的空圖波峰訊 號 Peak1、Peak2、Peak3…Reakn，找出以上空圖波峰之頂點分別位於 管柱位置N1、N2、N3…Nn處，再將T1、T2、T3…Tn與N1、N2、N3…Nn
等數據同時表現於同一張關係圖上，此樣品流析時間與空圖波峰頂點 位置關係圖即稱之為樣品遷移路徑圖，遷移路徑圖中所繪製出的數據 趨勢線則稱為遷移曲線（migration curve）。
2.1.4 波型指標參數
空圖與時圖波形的指標參數為：
(1)波高：實驗波形的最大訊號值，空圖波高之對應符號為 h(s)、 時圖波高之對應符號為h(t)。
(2)波峰半高寬：實驗波形最大值之 1/2 高度處，波峰左右兩側的 寬度，空圖半高寬所對應之符號為 W1/2(s)、時圖半高寬所對應之符號 為W1/2(t)。
(3)波峰面積：本實驗採用積分法來估計波形下所涵蓋的波面 積，此方法將兩組訊號值以及兩訊號值的時間或距離差距以梯形面積
其中 ym 代表第一個訊號值，xm 為 ym 對應的位置；ym+1 代表第二個 訊號值，xm+1 為 ym+1 對應的位置，若 xm 與 xm+1 間隔差距越小，
則累加結果會越接近真實面積，空圖面積所對應之符號為 A(s)、時圖 面積所對應之符號為A(t)。
(4)空圖數據取點時間：WCD 系統獲得空圖波峰時的電腦記錄時 間，其所對應之符號為tp′。
(5)時圖波峰位置：時圖波峰最高點所對應的樣品流析時間，其所 對應的符號為tp*。
實驗波形（包含管內空圖波形、管內時圖波形、管外時圖波形）
所得的各項指標參數之符號的定義整理於表2-2。
2.1.5 實驗流程
實驗裝置架設完畢之後，先調整機台與多通道偵測器的相關位置 與角度，使燈源之光線能夠通過填充管柱並進入偵測器，然後根據電 腦操作界面上呈現的光訊號強度，進行機台之 XYZ 軸微調，以達最 佳化狀態（如圖 2-14），所謂最佳化狀態是指光源強度穩定且左右兩
充靜相之管柱。
（2）依照實驗條件設定幫浦沖堤程式。
（3）設定電腦操作界面。
（4）注入樣品，並將儀器蓋上黑布避免受其他光源干擾。
（5）開動幫浦進行實驗並同時以 2 組偵測系統收集樣品訊號。
（6）從電腦操作界面上看到訊號恢復至原本狀態即表示樣品已 流出管路，此時停止收集訊號。
（7）進行數據處理。
2.1.6 實驗條件
2.1.6.1 管柱耐壓性測試
管柱尚未填充靜相前進行以下測試實驗：以不鏽鋼管路連接針式 幫浦與管柱，首先將去離子水灌入針式幫浦中，然後填入特製耐高壓 管柱中，待管柱內充滿去離子水後，將管柱另外一端出口密閉，使管 柱內環境形成一密閉空間，然後以定壓操作的方法逐步緩慢地提升管
程中，動相所產生的背壓只要低於此最高耐壓數值以下，玻璃管柱便 不會壞損。
2.1.6.2 比耳定律測試
在一般的分子吸收測量實驗中，物質之吸收訊號強度會遵守比耳 定律：
A abc =
(2-2) a 為吸光係數（absorptivity），b 為光線通過樣品溶液之路徑長度，c為樣品濃度。由於，在本研究中所使用來計算吸收值的光線其實屬於 擴散反射穿透光線，分析方法並非一般常見的吸收光譜法，故需進行 比耳定律測試實驗，以確保本研究中 WCD 系統所獲得的實驗數據為 可採用之吸收訊號。
將Tartrazine 溶於甲醇：水=1：1（V/V）的溶液中，配製成 10、
50、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000、1500、
2000 mg L-1的樣品溶液，在注入樣品前先將管柱內打滿甲醇：水=1：
1 的溶液，測量光線穿過管柱後抵達偵測器之光強度 P0，然後再分批 將 Tartrazine 樣品溶液打入管柱內，收集光線通過後之訊號 P，將此
看出，靠近自製管柱上可觀測視窗之兩側的光源訊號較弱較不穩定，
故在此比耳定律測試實驗中，我們選擇第 250-450 個偵測點位置所獲 得的樣品吸收值來做平均，使獲得樣品在管柱內的平均吸收值，再將 樣品濃度與平均吸收值關係作圖，便可得檢量線，以測試本 WCD 系 統所獲得之吸收訊號是否合乎比耳定律。本實驗中，WCD 系統所使 用的濾波片為435 nm 濾波片。
2.1.6.3 WCD 系統再現性測試
為測量機台之穩定性與再現性，將Anthrarufin 溶於丙酮中，配製 成濃度150 mg L-1的樣品溶液，注入管柱之樣品體積為20 μL，以組 成比例為甲醇：水=93：7（V/V）的動相對樣品進行等位沖堤（isocratic elution），沖堤流速 1 mL min-1，樣品進樣後立即開啟 WCD 偵測系統 收集樣品於管柱中移動過程之樣品空間分佈訊號，數據取點間距時間 為 1.3 秒，並同時開啟 UV/Vis 偵測器收集樣品流出管柱後的吸收度 訊號（偵測器波長選擇為435 nm），重複 5 次實驗後，選擇樣品移動 至管柱位置約 10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處的五組空圖訊號 波形指標 (波高、波峰半高寬、波峰取點時間與波峰面積)來進行再
2.2 實驗結果與討論
2.2.1 管柱耐壓性測試
測試結果是此特殊設計之玻璃管柱能承受至少 200 kg cm-2 的壓 力而不產生損壞洩漏，甚至以瞬間加壓的方式使管內壓力飆升至200 kg cm-2 後再瞬間洩壓，都不會對玻璃管柱造成損壞，一般常用的 HPLC 實驗條件中，壓力鮮少超過此限，故確定此特殊設計之玻璃管 柱可進行往後之層析實驗。
2.2.2 比耳定律測試
本實驗所得之檢量線如圖2-15 所示，在低濃度條件下（300 mg L-1 以 下 ）， 樣 品 吸 收 度 與 濃 度 成 線 性 正 比 關 係 （ 趨 勢 線 迴 歸 係 數 R2=0.986），但於高濃度條件下，偵測系統所觀察到的樣品吸收度與 濃度之線性關係會產生偏差，所以在往後進行實驗時，所使用的樣品 濃度不可過高，避免收集到偏離比耳定律的樣品吸收訊號，而造成實 驗結果的討論方向發生錯誤。
2.2.3 WCD 系統再現性測試
動過程中其波形面積變化之相對標準偏差值（RSD）。結果顯示，5 組重複實驗中，樣品在移動過程中之空圖波峰面積相對標準偏差值約 0.90%-1.41%。接下來，進一步地選出 5 組重複實驗中，樣品移動到 管柱13.0 公分處之空圖波峰數據來詳細探討，分別將其波高 h(s)、波
峰半高寬 W1/2(s)、波峰數據取點時間 tp
′
與空圖波峰面積 A(s)數據進行RSD 值計算，所得結果列於表 2-3。計算結果顯示，空圖波形指標 RSD 值皆小於 1.24%，以上結果表示機台穩定性良好，允許繼續進行 往後實驗。
2.3 結論
本研究所使用之偵測系統屬於一穩定性高、再現性好的大範圍觀 測系統，搭配自製的玻璃管柱，讓我們可以清楚的觀察到樣品在有填 充靜相之管柱內的移動行為。接下來的章節中，將介紹多種在層析管 柱中發生的分離行為，藉以釐清一些現有錯誤的層析觀念，對層析領 域之理論研究與教學提供一己之力。
圖2- 1 實驗裝置圖
其中，燈源、濾波片、光學盒等零件架設於XYZ 軸調整機座上，
包含個人電腦的話，即為全管柱偵測系統。
圖2- 2 自製 HPLC 管柱結構圖
管柱規格：總長度25 公分、內徑 3 毫米。其中，中間 18 公分長度範 圍屬玻璃材質，另外7 公分的長度範圍屬不鏽鋼材質。
圖2- 3 詳細實驗裝置圖
光學盒內部包含三組平面鏡和一片聚焦透鏡，透過圖示內之光學路 徑，21 公分寬的光線可以被收集在一組寬度 6 公分的 CCD 上，然後 轉換成電訊號於個人電腦以供數據處理。
Lamp emission
400 440 480 520 560 600
Wavelength(nm)
R e la ti v e In te n s it y
圖2- 4 燈源的放射圖譜
燈源屬冷陰極螢光燈管，拆解自光學掃描器，其在435 nm 及 540 nm 左右有相當強的放射。
圖2- 5 全管柱偵測系統實物照片
全管柱偵測系統包含光學盒、燈源、濾波片、XYZ 軸調整機座以及 處理訊號之個人電腦，除個人電腦以外，其餘零件皆架設於光學桌面 上，以降低實驗操作時之震動所造成的實驗誤差。燈源及濾波片由於 零件較不明顯，故於本圖中並未以箭頭指出其位置。
光學桌 XYZ 軸調整機座 自製HPLC 管柱
光學盒
圖2- 6 擴散反射穿透（diffuse-reflection transmittance）現象 由於管柱內所填充的靜相屬不透光物質，故光線穿過管柱抵達光學盒 的模式，屬擴散反射穿透現象。
圖2- 7 電腦操作界面圖
操作界面上可設定之參數包含：1.數據取點間距時間；2.偵測器曝光 時間；3.取樣點數；4.取樣模式。除了數據取點間距時間於每次實驗 前須重新輸入以外，在本研究中，偵測器曝光時間固定為 1600%（57.6 ms）、取樣點數固定為 670 個、取樣模式固定為〝Gray〞。
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圖2- 8 數據取點時間說明圖 A：數據取點間距時間（實驗設定參數）
B：偵測器曝光時間（實驗設定參數）
C：電腦取數據所需時間（浮動值）
A 數值與 B 數值為操作者在實驗開始前所設定的固定參數，C 數值受 電腦內部處理環境影響而有浮動不固定之特性。
圖2- 9 實驗所得之吸光值空時矩陣
WCD 包含 670 個偵測點，若記錄 150 組線性層析實驗數據的話，
便共有約 10 萬個數值（670×150=100,500），全部放在 excel 的 worksheet 中，縱軸代表管柱空間位置，橫軸代表 WCD 擷取數據 時間，字型選用 9 號字，欄寬降為 3，列高降為 7，螢幕 display
便共有約 10 萬個數值（670×150=100,500），全部放在 excel 的 worksheet 中，縱軸代表管柱空間位置，橫軸代表 WCD 擷取數據 時間，字型選用 9 號字，欄寬降為 3，列高降為 7，螢幕 display