模式一

配製兩種極性不同之動相，甲醇與水以71：29（V/V）等比例混 合，此溶液為動相 A；甲醇與水以 99：1（V/V）等比例混合，此溶 液為動相B，階梯式梯度沖堤模式啟動前，先以 100%的動相 A 流速 1 mL min^-1的條件進行管柱平衡，接著分別在樣品注入2、3、4、5、

6 分鐘時，瞬間將動相變為 100%的 B，在這樣的切換動相模式實驗 中，我們稱動相 A 為第一動相，動相 B 則為第二動相，在往後的模 式二與三亦以此類推。樣品一注入管柱的同時，立即開啟 WCD 系統 與 UV/Vis 偵測器收集樣品流經管柱過程的樣品空間波峰訊號以及管 外訊號。在不同的動相變換時間條件下，樣品於沖堤過程中，停留於 管柱內所需的總滯留時間長度不同，故 WCD 系統之數據取點間距時 間亦不相同，極性較大的動相在沖堤過程中會使樣品對靜相的滯留作 用力提升，則樣品移速慢，故當程式越慢切換成極性較小之動相時，

樣品在管柱內停留的時間也就越長，則數據取點間距時間亦必須拉 長，5 種切換動相時間的實驗分別搭配的 WCD 系統數據取點間距時 間為1.5、2、3、3.5、4 秒。

溶液為動相 A；甲醇與水以 91：9（V/V）等比例混合，此溶液為動 相 C，階梯式梯度沖堤模式啟動前，先以 100%的動相 A 流速 1 mL min^-1的條件進行管柱平衡，接著分別在樣品注入 2、3、4、5、6 分 鐘時，瞬間將動相變為 100%的 C，在樣品一注入的同時，立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集樣品流經管柱過程的樣品空間波峰 訊號以及管外訊號，5 種切換動相時間的實驗分別搭配的 WCD 系統 數據取點間距時間為2、3、3.5、3.5、4 秒。

4.2.3.3 模式三

配製兩種極性不同之動相，甲醇與水以 71：29 等比例混合，此 溶液為動相A；甲醇與水以 81：19（V/V）等比例混合，此溶液為動 相 D，階梯式梯度沖堤模式啟動前，先以 100%的動相 A 流速 1 mL min^-1的條件進行管柱平衡，接著分別在樣品注入 2、3、4、5、6 分 鐘時，瞬間將動相變為 100%的 D，在樣品一注入的同時，立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集樣品流經管柱過程的樣品空間波峰 訊號以及管外訊號，5 種切換動相時間的實驗分別搭配的 WCD 系統 數據取點間距時間為2.5、3.5、4、5、5.5 秒。

在模式一的階梯式梯度沖堤實驗中，傳統單通道偵測器所收集到 的層析圖譜如圖 4-1 所示，圖 4-1(a)為基線校正前結果，圖 4-1(b)為 基線校正後結果，校正前後的層析時圖波峰指標參數列於表4-1 中。

沖堤過程中，選擇樣品移動至管柱約 10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處的空圖波峰出來觀察比較，結果如圖4-2(a)-(e)，根據以上結果 畫出樣品於管柱內的遷移路徑圖於圖4-3(a)-(e)，灰色線條分別代表樣 品以動相 A 及動相 B 進行等位沖堤實驗時所得之遷移曲線（數據來 自於第三章中 k=7.27 與 k=0.54 等條件之實驗結果），黑色線即代表 樣品於模式一的階梯式沖堤條件下所得之樣品遷移曲線。

模式二的階梯式梯度沖堤實驗中，傳統單通道偵測器所收集到的 層析圖譜如圖 4-4 所示，圖 4-4(a)為基線校正前結果，圖 4-4(b)為基 線校正後結果，校正前後的層析圖波峰指標參數列於表4-2 中。沖堤 過程中，WCD 系統所觀察到的樣品空圖波峰結果如圖 4-5(a)-(e)，根 據以上結果畫出樣品於管柱內的遷移路徑圖於圖4-6(a)-(e)，灰色線條 分別代表樣品以動相 A 及動相 C 進行等位沖堤實驗時所得之遷移曲 線（數據來自於第三章中 k=7.27 與 k=1.10 等條件之實驗結果），黑

線校正後結果，校正前後的層析圖波峰指標參數列於表4-3 中。沖堤 過程中，WCD 系統所觀察到的樣品空圖波峰結果如圖 4-8(a)-(e)，根 據以上結果畫出樣品於管柱內的遷移路徑圖於圖4-9(a)-(e)，灰色線條 分別代表樣品以動相 A 及動相 D 進行等位沖堤實驗時所得之遷移曲 線（數據來自於第三章中 k=7.27 與 k=2.86 等條件之實驗結果），黑 色線即代表樣品於模式三的沖堤條件下所得之樣品遷移曲線。

由以上三種模式的空圖結果可看出（見圖 4-2、4-5、4-8），動相 於2、3、4 分鐘時做變化的這三組條件，由於動相較早做切換，故當 樣品移動到WCD 系統的觀察視窗範圍內時，其波峰之波形已漸趨穩 定，據樣品在觀察範圍內所有得到的空圖結果，可得到波峰寬度與管 柱位置之關係圖，結果顯示，在空圖波型穩定的條件範圍內，樣品空 間波寬與管柱位置呈線性關係，於是便可以外插法求出樣品移動到管 柱 25 公分時的波峰寬度為何，然後再根據公式(4-2)與(4-1)計算三種 沖堤模式中空圖波峰理論板高H′與板數值 N′，結果列於表 4-4。但是 在動相 5、6 分鐘做切換的這兩組條件下，由於樣品移動到 WCD 系 統觀察範圍內時，適逢於動相切換等混合階段，故波峰之波形較為混

與使用第二動相進行等位沖堤樣品所得之結果相同，也就是說，在本 板數之平均值有達450%的差異（100×3497÷777=450%），由不同參數

（空間與時間）等實驗結果所計算而得的理論板數竟會有如此大的差 異，原因即在於，計算理論板數的方法（公式(4-3)或公式(4-4)），是

加入一「樣品移動速度」參數（如公式（3-1）所述），意即表示，公 式(4-3)是一建構在「樣品移動速度固定」的原則下延續發展而得的結 果，但是在非線性層析實驗中，由於動相組成隨著時間在改變，所以 管柱內樣品的移動速度便會在不同流析時間下受到不同動相之溶劑 強度的影響，而致使樣品之移動速度有所改變，如此一來，公式(4-3) 便無法成立，自然也就不能被使用來計算板數或者板高了，所以在進 行層析實驗時，只要用點〝詭計〞，藉由延緩改變動相的時間來使樣 品滯留在管柱內的時間加長，如此一來，公式(4-4)中的 tR增加且可保

持 W1/2(t)不變，則時圖之理論板數便會大幅增加，管柱效率便會看似

大幅提升了，但實際上，從觀察管柱內流體行為所得之實驗結果使我 們可以很清楚地認知到，這些都是『假象』而已，管柱本身所能提供 的效能不會隨著動相改變而有太大的變化的，就如同蒸餾塔原理般，

在製作層析管柱過程中，以高壓填充方式將靜相填入管柱的這個步驟 完成的當下，代表管柱效率的理論板數值便已大致固定，雖然在不同 動相沖堤或者選擇不同的分析樣品會導致其板數 N 以及板高 H 有些 許差異，但此值之差異應不大才是。

接觸波峰之左方部分的樣品（波峰左方之樣品為較接近管柱進樣入口 處之樣品），由於動相極性小，能使樣品對靜相之滯留作用力大幅縮 減，故此區域樣品之移速便會劇烈增加，加快樣品往管柱出口方向前 進的速度，如此一來，會使樣品在動相接觸等短暫時間內產生類似濃 縮的波寬變窄之現象，待穩定後，其波峰才會又繼續的隨流析時間加 長而變寬。將模式一階梯式梯度沖堤實驗中，動相於 2、3、4 分鐘做 切換的這 3 組條件之樣品空間波峰寬度與管柱位置關係作圖（圖 4-10），圖中可明顯的看到樣品波峰變窄然後再漸漸變寬的現象，這 樣的現象於文獻中亦曾經有人提及[31]，因為這種作用力，所以三種 模式下所得之空圖波峰寬度皆不相同，模式中兩種動相之極性差異越 大者（如模式一），樣品空間波峰寬度濃縮之現象便較為明顯，則樣 品之空圖波峰寬度便會較窄，而以管內空間波峰寬度值所計算而得之 理論板高便亦會較小（如表 4-4 所示）；而模式中兩種動相之極性差 異較小時（如模式三），由於濃縮效果較不明顯，則樣品之空圖波峰 寬度便會較寬，故以樣品於管內空間寬度值所計算而得之理論板高便 會較模式一所得結果來的更大些（0.0437＞0.0322）。

獲得管柱內樣品空間波峰寬度差異都極小，故以空間波峰數據所計算 而得的 H′值差異皆不大，但是，若以傳統管柱外單通道偵測器所獲 得的層析圖譜之數據來計算H 值的話，在不同的非線性層析條件下，

其差異可達 3 倍以上。甚至，以時圖結果所計算而得的 N 值可能會 與以空圖數據計算所得的N′值差異達到 4 倍以上，只要在沖堤過程中 加入越多〝把戲〞，這個誤差值可以使之越大，但是因為直接觀察管 柱內樣品空間波峰訊號是最真實的流體行為表現方法，所使用的公式 也是所有計算理論板數方法的最根源，就會避免了公式推導過程中的 定義疏失，所以層析操作者應該是以空圖計算所得之N′值為參考，而 不能以時圖計算所得結果為準，也就是說：在任何非線性層析條件 下，理論板數或者板高並不會隨著動相比例變化而使此數值產生太大 的改變。

本研究所得結論就是，在非線性層析系統中，並不能使用公式

（4-3）或公式（4-4）來處理非線性層析數據，層析操作者爾後需避 免犯下同樣的錯誤。至於在非線性層析條件下要如何計算理論板數與 板高，還需作進一步的研究。

(a) 基線校正前

(b) 基線校正後

圖4- 1 模式一階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜

(a) 2 分鐘切換動相 (b) 3 分鐘切換動相

(c) 4 分鐘切換動相 (d) 5 分鐘切換動相

(e) 6 分鐘切換動相

圖4- 2 模式一階梯式梯度沖堤實驗中，當樣品抵達管柱約 10.4、

11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形

(a) 2 分鐘切換動相 (b) 3 分鐘切換動相

(c) 4 分鐘切換動相 (d) 5 分鐘切換動相

(e) 6 分鐘切換動相

圖4- 3 模式一階梯式梯度沖堤實驗所得之樣品遷移路徑圖

動相 A

動相 B

(a) 基線校正前

(b) 基線校正後

圖4- 4 模式二階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜

(a) 2 分鐘切換動相 (b) 3 分鐘切換動相

(c) 4 分鐘切換動相 (d) 5 分鐘切換動相

(e) 6 分鐘切換動相

圖 4- 5 模式二階梯式梯度沖堤實驗中，當樣品抵達管柱約 10.4、

11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形

(a) 2 分鐘切換動相 (b) 3 分鐘切換動相

(c) 4 分鐘切換動相 (d) 5 分鐘切換動相

(e) 6 分鐘切換動相

圖4- 6 模式二階梯式梯度沖堤實驗所得之樣品遷移路徑圖

動相 A

動相 C

(a) 基線校正前

(b) 基線校正後

圖4- 7 模式三階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜

模式三：初始動相-甲醇：水=71：29（V/V），第二動相-甲醇：水=