以全管柱偵測法探討液相層析之分離

國立交通大學

應用化學研究所

博士論文

以全管柱偵測法探討液相層析之分離

Separations in Liquid Chromatography

Observed by Whole-Column Detection

研 究 生：林淑慧

以全管柱偵測法探討液相層析之分離

Separations in Liquid Chromatography

Observed by Whole-Column Detection

研究生 ：林淑慧 Student：Shu-Hui Lin

指導教授：余 艇 博士 Advisor：Dr. Tiing Yu

國立交通大學

應用化學研究所

博 士 論 文

A Thesis

Submitted to Department of Applied Chemistry College of Science

National Chiao Tung University in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Ph.D. In

Applied Chemistry March 2009

以全管柱偵測法探討液相層析之分離

學生：林淑慧 指導教授：余 艇 國立交通大學應用化學研究所 摘要 液相層析法是一種可以應用到各科學部門的有力分離方法，由於 傳統偵測方式之限制，導致層析理論方面有時會有錯誤之陳述，本研 究以全管柱型偵測系統觀察層析管柱內的樣品流動訊號，藉著獲得空 間及時間的實驗數據，來對部分有疏失的層析理論進行修正。 根據實驗結果顯示，本研究可釐清數項容易被忽略或者誤導的層 析觀念：第一，以 15 組不同組成之動相沖堤樣品，使獲得 15 組滯留 因子（k）的實驗結果，層析圖譜中，k=7.27 的波峰寬度約為 k=0.54 樣品的4.6 倍，然而，兩組分析物在管柱內的空間分佈寬度卻幾乎相 同，此結果讓我們清楚地了解，層析圖譜上影響波峰變寬的真正原因 是樣品釋放出管柱的速度，換句話說，層析圖譜上波峰寬度的變化並 不能直接反應出樣品在管柱內的真正空間分佈寬度；第二，藉著階梯

我們更清楚的知道梯度沖堤條件對分離實驗的影響，並成功的觀察到 分析物在管柱內所產生的滯留順序交錯現象。

藉由本研究室所設計研發之全管柱型偵測系統的應用，使我們更 全面性地觀察樣品在層析管柱中的分離行為，進而成功地修正一些容 易被層析操作者所忽略的錯誤層析觀念。

Separations in Liquid Chromatography

Observed by Whole-Column Detection

Student：Shu-Hui Lin Advisor：Tiing Yu Institute of Applied Chemistry

National Chiao Tung University

Abstract

Liquid chromatography is a powerful separation method that finds applications to all branches of science. There are, however, some mistaken statements in chromatographic theory caused owing to the limitation of using conventional detection techniques. We designed a whole-column detection (WCD) system which enabled monitoring of whole on-column chromatographic peaks during the elution process on both spatial and time coordinate in order to clarify the shortcomings.

In the first part, a single-compound sample was eluted under mobile phases of fifteen different compositions, generating chromatograms of 15 different retention factors (k). The bandwidth of the peak (k=7.27) increased by almost 4.6 folds compared with the peak (k=0.54). However, the bandwidths of these two peaks remained almost the same on the spatial coordinate in the column. The peak width was found linearly dependent on the solute releasing speed from the column outlet to the

obtained using the traditional equations. It revealed the incompetence of the theoretical plate number and plate height definition while non-linear chromatographies are performed. In the third part, solute migrations were clearly monitored in the column. Peak crossover phenomenon was observed during the entire migration course using the WCD system.

In conclusion, we fabricated a WCD system in this study to comprehensively observe the elution process in liquid chromatography. Several misconceptions were clarified by the spatial data. The detailed on-column observations obtained using the WCD system may further provide useful information to uncover hidden aspects which may have been ignored by chromatographers.

誌謝 終於，搞定了! 這些年來，衷心感謝恩師 余艇教授不厭其煩的教誨與鼓勵，讓 我除了在學術領域中有所成長以外，更甚讓淑慧體悟到相當多人生中 圓滿與自在的道理；感謝 白書禎老師一直以來的大力支持，您做學 問的態度與生活的熱情讓淑慧極度佩服；感謝 陳月枝老師、 謝有容 老師多年來對淑慧的細心叮嚀與打氣；感謝 王少君老師在口試以及 往年分析年會中給予淑慧的鼓舞與指導。 數不清的日子，朋友來來去去，每個時期的夥伴都是我生命中的 貴人，因為，如果沒有你當年的一句〝加油〞，淑慧一定撐不到現在， 阿柚子、靜玟、志謙、誠明學長、霹靂創弘貓、恩瑋、育錚、芳卿、 坤展、志強、基育、安吉拉慧婷、凱傑、淑媺、霆琪、鈺評、士宗、 鈺君、大秉、哈比人、阿爆、阿嚕咪、周玉棟、阿川、立民、小昕昕、 親愛的寶貝阿仁，心中的謝意滿滿滿滿，整個無法用文字言喻，雖然 有些朋友平日鮮少聯絡，但是，套一句當年對育錚說過的話：沒打電 話給你並不代表我不想你喔！朋友是一輩子的，未來日子裡，淑慧一 定一定會用行動表現對你們的愛唷，啾！感謝實驗室學弟妹幫我打點 口 試 的 瑣 事 ， 琬 茹 、 印 從 、 伶 宜 、 典 祐 、 育 國 ， 尤 其 是經 緯， 你……… 最後，感謝永遠火力全開、在背後無條件支持我的家人，老爹、

目錄

中文摘要... ii 英文摘要... iv 誌謝... vi 目錄... vii 圖目錄...x 表目錄... xiv 第一章 簡介 ...1 1.1 研究動機...1 1.2 全管柱型偵測（WCD）系統介紹 ...3 第二章 儀器設計及裝置 ...9 2.1 實驗...9 2.1.1 儀器裝置...9 2.1.1.1 自製HPLC管柱...10 2.1.1.2 WCD系統...11 2.1.1.3 WCD系統操作界面設定 ...14 2.1.2 藥品...16 2.1.3 數據類型定義...16 2.1.4 波型指標參數...18 2.1.5 實驗流程...19 2.1.6 實驗條件...20 2.1.6.1 管柱耐壓性測試...20

2.2.1 管柱耐壓性測試...23 2.2.2 比耳定律測試...23 2.2.3 WCD系統再現性測試 ...23 2.3 結論...24 第三章 影響層析波峰變寬原因之探討 ...45 3.1 研究背景與理論介紹...45 3.2 實驗...48 3.2.1 儀器裝置...48 3.2.2 藥品...49 3.2.3 實驗步驟...49 3.3 結果與討論...50 3.3.1 空圖數據之探討...51 3.3.2 空時圖數據比較...53 3.3.3 時間效應...56 3.4 結論...58 第四章 層析實驗中理論板高、板數誤用現象之探討 ...80 4.1 研究背景與理論介紹...80 4.2 實驗...83 4.2.1 儀器裝置...83 4.2.2 藥品...83 4.2.3 實驗步驟...83 4.2.3.1 模式一...84

4.3.1 三種模式之比較...85 4.3.2 空間波峰寬度變化...89 4.4 結論...90 第五章 非線性沖堤中層析峰滯留順序交錯現象之探討 ...106 5.1 研究背景與理論介紹...106 5.2 實驗...108 5.2.1 儀器裝置...108 5.2.2 藥品...108 5.2.3 實驗步驟...109 5.2.3.1 第一階段...110 5.2.3.2 第二階段...111 5.2.3.3 第三階段...112 5.3 結果與討論...114 5.3.1 第一階段...114 5.3.2 第二階段...117 5.3.3 第三階段...119 5.4 結論...122 第六章 結論 ...139 參考文獻...141

圖目錄

圖2- 1 實驗裝置圖 ... 25 圖2- 2 自製HPLC管柱結構圖... 26 圖2- 3 詳細實驗裝置圖 ... 27 圖2- 4 燈源的放射圖譜 ... 28 圖2- 5 全管柱偵測系統實物照片 ... 29 圖2- 6 擴散反射穿透（diffuse-reflection transmittance）現象 ... 30 圖2- 7 電腦操作界面圖 ... 31 圖2- 8 數據取點時間說明圖 ... 32 圖2- 9 實驗所得之吸光值空時矩陣 ... 33 圖2- 10 管外時圖和管內空圖的定義 ... 34 圖2- 11 管內時圖的定義 ... 35 圖2- 12 遷移路徑圖與遷移曲線之定義 ... 36 圖2- 13 積分法求波形面積的示意圖 ... 37 圖2- 14 光源最佳化狀態 ... 38 圖2- 15 Tartrazine之檢量線... 39

抵達管柱約 10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空圖波 峰面積... 41 圖3- 1 教科書中，對三種物質於層析管柱內進行分離的解釋示 意圖 60 圖3- 2 15 組動相等位沖堤之層析結果圖... 61 圖3- 3 15 組動相以線性層析之模式沖堤樣品，當樣品抵達管柱 約10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形 ... 62 圖3- 4 k值與各公式之趨勢關係圖 ... 65 圖3- 5 15 組等位沖堤實驗中，管外層析時圖與管內 17 公分處 空圖波寬增加比例關係圖... 66 圖3- 6 (a)、(b)分別表現出空間波峰標準偏差

σ

( )s 與樣品注入管 柱後移動至管柱末端偵測點所需的時間tR及時圖波峰寬度W(t)之 意義 67 圖3- 7 15 組等位沖堤實驗中，溶劑與樣品之遷移路徑圖... 68 圖3- 8 15 組遷移曲線之斜率與層析時圖所計算而得之樣品移 速的比較關係圖... 69 圖3- 9 15 組等位沖堤實驗中，樣品移動速度倒數與時圖波峰半 高寬之關係圖... 70 圖3- 10 15 組等位沖堤實驗中，管外層析時圖與管內時圖（以管 柱17 公分位置為固定偵測點）波峰寬度增加比例關係圖 ... 71 圖3- 11 層析系統中時間效應之定義 ... 72

圖4- 1 模式一階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜... 92 圖4- 2 模式一階梯式梯度沖堤實驗中，當樣品抵達管柱約 10.4、 11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形 ... 93 圖4- 3 模式一階梯式梯度沖堤實驗所得之樣品遷移路徑圖... 94 圖4- 4 模式二階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜... 95 圖4- 5 模式二階梯式梯度沖堤實驗中，當樣品抵達管柱約 10.4、 11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形 ... 96 圖4- 6 模式二階梯式梯度沖堤實驗所得之樣品遷移路徑圖... 97 圖4- 7 模式三階梯式梯度沖堤實驗之層析圖譜... 98 圖4- 8 模式三階梯式梯度沖堤實驗中，當樣品抵達管柱約 10.4、 11.7、13.0、14.3、15.6 公分處之管內空間波形 ... 99 圖4- 9 模式三階梯式梯度沖堤實驗所得之樣品遷移路徑圖... 100 圖4- 10 模式一階梯式梯度沖堤，樣品空間波寬與管柱位置之關 係圖 101

圖5- 1 (a)動相A50:50與(b)動相B50:50以1 mL min-1的流速對New

Coccine與Carmoisine進行線性沖堤後所得之層析時圖 ... 123

圖5- 2 A50:50和B50:50以流速（a）1 mL min-1（b）0.5 mL min-1 的

流速分別對樣品New Coccine與Carmoisine進行線性沖堤，WCD

系統所得之遷移路徑圖... 124

圖5- 3 化合物(a)New Coccine與(b)Carmoisine在沖堤流速 0.5 mL

行 管 柱 平 衡 ， 在 樣 品(New Coccine 與 Carmoisine) 進 樣 後

(a)1(b)2(c)3 分鐘內，逐步將動相轉換成 100% A50:50， WCD系

統所得之分析物遷移路徑圖... 126

圖5- 5 初始動相 100% B50:50以流速0.5 mL min-1沖堤管柱，進

行 管 柱 平 衡 ， 在 樣 品(New Coccine 與 Carmoisine) 進 樣 後

(a)0(b)1(c)2 分鐘時，瞬間將動相轉換成 100% A50:50， WCD系

統所得之分析物遷移路徑圖... 127

圖 5- 6 (a) 動相A45:55與(b) 動相B45:55以 1 mL min-1的流速對

New Coccine與Carmoisine進行線性沖堤後所得之層析時圖 ... 128 圖5- 7 化合物(a)New Coccine與(b)Carmoisine在沖堤流速 1 mL min-1的連續式梯度沖堤實驗中，WCD系統所得之樣品遷移路徑 圖整理。圖表內由左至右之曲線分別是樣品注入 2、4、6、8、 10、12、14、17、30 分鐘內，將動相由 100% B45:55逐步轉換成 100% A45:55之實驗條件所得結果... 129 圖5- 8 初始動相 100% B45:55以流速1 mL min-1沖堤管柱，進行 管柱平衡，在樣品(New Coccine與Carmoisine)進樣後(a)2(b)4(c)6 分鐘內，逐步將動相轉換成100% A45:55， WCD系統所得之分析 物遷移路徑圖... 130 圖5- 9 初始動相 100% B45:55以流速1 mL min-1沖堤管柱，進行 管柱平衡，在樣品(New Coccine與Carmoisine)進樣後(a)2(b)2.5 分鐘時，瞬間將動相轉換成100% A45:55， WCD系統所得之分析 物遷移路徑圖... 131 圖5- 10 兩化合物注入管柱後 2 分鐘時，瞬間將初始動相B45:55改 變為A45:55，WCD系統所得之樣品完整遷移路徑圖 ... 132

圖 5- 11 (a) 動相A40:60與(b) 動相B40:60以 1 mL min-1的流速對

實驗所得結果... 134 圖5- 13 初始動相 100% B40:60以流速1 mL min-1沖堤管柱，進行 管柱平衡，在樣品(New Coccine與Carmoisine)進樣後(a)10(b)14 分鐘內，逐步將動相轉換成100% A40:60，WCD系統所得之分析 物遷移路徑圖... 135 圖5- 14 初始動相 100% B40:60以流速1 mL min-1沖堤管柱，進行 管柱平衡，在樣品(New Coccine與Carmoisine)進樣後 4 分鐘時， 瞬間將動相轉換成100% A40:60，WCD系統所得之分析物遷移路 徑圖 136 圖5- 15 (a)-(d)分別為當混合樣品(New Coccine＋Carmoisine) 注 入管柱後3.5、3.75、4、5 分鐘，瞬間將動相由 100% B40:60 改變 為100% A40:60，WCD所得之樣品空間濃度分佈圖... 137 圖5- 16 觀察分析物滯留順序交錯現象之最佳條件下所獲得的管 柱內樣品濃度空間分佈圖... 138

表目錄

表2- 3 WCD再現性測試條件實驗中，樣品達管柱 13 公分處的 空圖訊號波形指標... 44 表3- 1 動相組成比例與數據取點間距時間... 75 表3- 2 15 組等位沖堤層析之管外層析時圖波型指標... 76 表3- 3 15 組等位沖堤層析實驗之時圖層析波寬與樣品移動至 管柱17 公分處的空圖波峰寬度比較 ... 77 表3- 4 理論方程式參數符號表 ... 78 表3- 5 15 組等位沖堤層析實驗之時圖層析波高與樣品移動至 管柱17 公分處的空圖波峰高度× 1 k +1數據... 79 表4- 1 模式一階梯式梯度沖堤之層析時圖波型指標... 102 表4- 2 模式二階梯式梯度沖堤之層析時圖波型指標... 103 表4- 3 模式三階梯式梯度沖堤之層析時圖波型指標... 104 表4- 4 空時圖理論板數、板高計算結果... 105

第一章 簡介 1.1 研究動機 在二十世紀中期以前，混合物之分離大都是以傳統的方法如沉 澱、蒸餾及萃取來實現[1]。至今，則常以層析和電泳法來進行，尤 其是多成份且複雜的樣品，層析法（chromatography）是一種可應用 到各科學部門的有力分離方法，由於有許多新型層析技術的發展，使 得其應用在過去五十年間有巨幅的成長。這些方法對科學界的巨大衝 擊，可由1952 年諾貝爾獎頒發給 Martin 和 Synge 以獎勵他們在此領 域的貢獻而得到佐證，更令人印象深刻的是，在1937 年到 1972 年間 可列出 12 個諾貝爾獎，在他們的研究工作中層析法扮演重要的角色 [2]，可以見得層析法對科學界的重要性。 對於層析法的應用與技術設計而言，透過層析理論可以適當地選 擇解析能力或分離速度等條件。為人熟知的有：隔板理論（Plate Theory）與速率理論（Rate Theory）。 隔板理論[3]係來自蒸餾塔的概念，以動靜兩相間的平衡推導出管 柱效率的表現方法，如波峰寬度、滯留時間（retention time）、解析能

速率理論以荷蘭科學家 van Deemter 等人提出的方程式最為著

名。1952 年，Lapidus 和 Amundson 提出了速率理論，到 1956 年，van

Deemter 等人又將該理論擴展[4]，這項理論考慮到了分子擴散效應及 擴散所控制的質量轉移，討論範圍相當廣泛。

除了以上兩大理論之外，1959 年 Giddings 發展的通用不平衡理論

（Generalized nonequilibrium theory）[5]，更進一步地考慮到分子擴 散之質量轉移動力學。 根據以上這些理論所發展出來的研究，在多數的情況下，都能滿 足層析的實驗結果[6-10]。 Pai 於 2002 年發表之 Tailography [11]，以及 2003 年發表於同一 期 刊 之 Parcel model[12] 皆 指 出 ：「 由 傳 統 單 一 通 道 偵 測 器 （single-channel detector）所獲得之以時間單位為橫軸的圖譜結果， 並非流析管路中樣品的真實空間分佈」，在忽略時間效應（temporal effect）的情況下，會對傳統偵測器所收集到的訊號產生錯誤的解釋， 此類型之疏失不僅發生在流動注入分析（flow injection analysis, FIA） 系統中[13-16]，也會發生於被廣泛使用的層析系統裡。在 Pai 所發表

性，除了必須得到傳統之樣品流經管柱後的層析圖譜訊號，還必須獲 得在沖堤過程中，於管柱內的樣品空間分佈訊號，有鑑於此，本研究 室開始著手設計有別於傳統的偵測系統，我們使用光學掃描器之零 件，組裝成全管柱型偵測（whole-column detection, WCD）系統，以 便得到大範圍觀測視窗（長達 21 公分），完整記錄層析管柱內樣品波 型分佈，結合傳統單一光徑吸收光譜偵測器，組成一套完整的多功能 偵測系統，能同步觀察管柱內、外之樣品流析訊號，期望以此系統所 獲得到的實驗數據來驗證Pai 所提出之相關層析理論學說。 1.2 全管柱型偵測（WCD）系統介紹 在進行各類的流體實驗如流動注入分析法，液相層析（liquid

chromatography, LC）、氣相層析（gas chromatography, GC）和毛細管 電泳（capillary electrophoresis, CE）時，傳統常見的單通道偵測器， 通常銜接於管柱出口來對通過之樣品進行偵測。流經偵測器的樣品訊 號通常以「時間對訊號強度值」的方式記錄，然後再對所得訊號進行 研究與探討。然而，有些科學家認為以上所述的單通道偵測器並非唯 一一種可以觀察流體行為的偵測系統，所以，便開始發展所謂的多通

第一篇有關多通道偵測系統的文獻於1988年發表[17]，Evans和 McGuffin使用雙通道偵測器來觀察螢光樣品在毛細管中的流動行 為，藉著觀察分析物在2偵測點間的趨勢，可排除分析管柱中所謂的 管外效應（extracolumn effect）對樣品產生的影響。之後，Rowlen等 人設計了一組解析度更高的多通道偵測系統[18,19]，將14組紫外光感 二極體（UV-sensitive photodiode）架設在玻璃材質的層析管柱外，用 來即時觀察樣品在層析管柱中進行沖堤時的遷移分佈情形，對這種偵 測系統，作者命名其為全管柱偵測（WCD）系統，但在這套偵測系 統開發出來前，作者在1986年便以電腦模擬的方法來表現全管柱偵測 器觀察流體行為的結果[20]，並且提出使用全管柱偵測系統的優點及 其潛力等論述；延續電腦模擬的研究之後，作者著手開發WCD系統， 並 且 以 實 驗 數 據 來 證 實 使 用WCD 的 確 對 高 效 能 液 相 層 析

（high-performance liquid chromatography, HPLC）有相當地優勢與價 值，其列舉出來可能的優勢如下：

1. WCD系統可以真實的記錄樣品於管柱前端、尾端等不同位 置的分佈與流析時間。

3. 更精確的得到滯留因子（retention factor）。 4. 可測量動靜相間平衡的速度。 5. 可以實驗證明滯留因子在線性層析（linear chromatography） 或者非線性層析（non-linear chromatography）過程中的改變 狀況。 當WCD系統的用法及優勢被提出後，相當多的分離科學者開始改 良這套偵測系統，捨棄先前所使用的分離式光能轉換器（discrete photon transducer），改以電荷耦合元件（charge-coupled device, CCD） 為訊號接受器，這是一種陣列式的光電耦合檢像器，上有許多排列整 齊的電容能感應光線，並將影像轉變成數位訊號，在擷取影像時，有 類似傳統底片的感光作用，常被應用於數位相機、光學掃描器與攝影 機等感光元件。CCD的使用大幅增進了WCD系統的效能，其陣列式 的電路排列除了大幅提升偵測器空間解析度以外，影像擷取的效果還 可以讓使用者觀察到更生動真實的樣品分析過程，但是由於市售CCD 尺寸上的限制，所以在這套技術發展初期，是用於觀察小範圍毛細管 內 的 樣 品 流 動 情 形 。 一 般 毛 細 管 的 管 柱 材 質 是 融 熔 二 氧 化 矽

只要將塗布於外層的聚醯亞胺除去，便可使光線穿透過玻璃進而觀察 到管柱內樣品移動情形，所以當WCD這類偵測系統開始受到關注 後，便有很多科學家將這樣的技術用來觀察毛細管電泳中樣品移動分 佈的情形，其中又以觀察毛細管導電聚焦（cpillary isolectric focusing, CIEF）實驗中樣品流體行為等研究最為常見，當具有不同等電點的 物質被注入管柱後，其分離可藉著管中的緩衝混合液沿著管柱連續地 改變酸鹼值來完成，分析物則會停留在其特定的管柱位置而形成狹窄 的區帶，等電聚焦分離是基於分析物的平衡性質的差異，而不是遷移 速率的差異，所以一旦分析物遷移至特定管柱位置時，其區帶位置則 會保持一定且不再隨時間改變[1]，這樣的分離機制如果以WCD系統 來當做偵測系統的話，可以不必等到樣品遷移至管外之前，便能得到 分析分離結果，而且還可以直接觀察分析物遷移的整個平衡過程，這 些資訊都可以更迅速的幫助實驗操作者找到適當的操作條件來提升 分離效率。 第一次將WCD系統運用來觀察毛細管等電聚焦系統的科學家是 Wu等人[21]，作者以雷射光源激發管內樣品使其放光，然後以全管柱

[22-27]。在WCD系統的發展史中，CCD的裝置與使用方法多有不同， 有些學者是以CCD直接收集光訊號然後轉換成電訊號來進行研究分 析，有些則是將CCD搭配光學設計的零件來使獲得更寬廣之觀察範圍 的訊號，例如使用數位攝影鏡頭來收集樣品移動影像，Nilsson等人就 是以CCD攝影機來記錄毛細管電泳實驗中的DNA片段的螢光影像 [28,29]。甚至有科學家使用WCD系統來獲得部分實驗參數後，便可 預測在CIEF實驗中分離150種樣品之混合物的分析結果[30]。 除了以具透光性的融熔二氧化矽運用於毛細管電泳外，在液相層 析的發展初期，其實也是以具透光性之玻璃材質的層析管柱來進行分 離實驗的，所以在WCD技術開始發展後，便有科學家使用錄影影像 （video-imaging）擷取的偵測方法來觀察填充靜相後的玻璃管柱內樣 品移動的情形。Tamura等人以CCD攝影鏡頭來直接記錄發螢光樣品

在 逆 相 高 效 能 層 析 （ reversed-phase high performance liquid

chromatography）玻璃管柱中的分離過程影像[31,32]。Guiochon等人 也設計了一套WCD系統，用來收集層析系統中樣品沖堤過程中的影 像訊號[33-35]，並且點出一般HPLC管柱中常用來防止靜相流失的擋

訊號來進行分析處理，這樣的技術較先前所提的以光能轉換器為訊號 收集器的偵測方法，大幅提升了其空間解析度，並且可以獲得物質遷 移過程中的三維資訊：樣品遷移時間、樣品濃度強度（peak height）、 樣品分佈範圍（peak width）藉由獲得更多樣品在層析過程中的動態 層析資訊（dynamic chromatography information），將有助於分析管柱 內所發生的層析流體行為，進而改善實驗條件來達到分離效率提升的 目標。 雖然以上已經介紹多組WCD系統，但是這些系統都沒有同時整合 「直接獲取分析訊號」、「高解析度」、「大範圍觀測視窗」等裝置優勢， 所以本實驗室組裝設計了一套WCD系統與耐高壓玻璃管柱，結合兩 者，可大範圍（21 cm）的觀察分析物在一般常用的HPLC實驗條件下 之分離過程，藉由對管柱內樣品行為的了解，本研究將修正一些平常 容易被忽視的錯誤層析觀念，以及發掘一些隱藏於管柱內不易被關注 到的層析現象，供未來層析學者進行更深入的探討。

第二章 儀器設計及裝置 本章節將詳細介紹WCD系統與耐高壓玻璃管柱之組裝過程、管柱 耐壓性測試、WCD系統比耳定律（Beer′s law）測試與再現性測試。 2.1 實驗 2.1.1 儀器裝置 本實驗所使用的層析系統包含傳統往復式梯度沖堤（gradient

elution）幫浦（型號 Series 4，購自 Lab Alliance, PA, USA）、內體積 20 μL 的樣品迴圈（sample loop）、HPLC 管柱、WCD 系統（包含光 學盒、燈源、濾波片、XYZ 軸調整機座以及連接用來處理訊號之個

人電腦）和傳統 UV/Vis 偵測器（型號 Waters 486，購自 Milford, MA,

USA），實驗裝置圖如圖 2-1 所示。

HPLC 管柱又分為兩種，一為長度 40 公分、外徑 6 毫米、內徑 3

毫米的玻璃管柱，二為長度25 公分、內徑 3 毫米的自製 HPLC 管柱。

自製HPLC 管柱的耐壓測試是使用針式幫浦（其型號 ISCO Model

2.1.1.1 自製 HPLC 管柱 本研究初期所使用的 HPLC 管柱是長度達 40 公分的玻璃管柱， 但是由於其接頭零件屬高分子材質，耐壓能力不足，導致實驗條件大 幅受限，例如，將10 μm octadecylsilane（ODS）在常壓下填充入玻 璃管柱內做為靜相，接著將樣品注入此管柱來進行層析沖堤時，實驗 流速只能達0.3 mL min-1，倘若提供更高的幫浦流速進行實驗時，管 柱入口端或出口端之線路接合處，便可能會因為動相所造成的過高背 壓（backpressure）而產生洩漏的問題，故為了使管柱可以進行傳統 HPLC 條件（例如流速可至 1 mL min-1以上）的實驗，必須特製管柱 使其可以達到既透光、又耐高壓、耐酸鹼等特性，所以本實驗室委託 彥宏開發科技有限公司[36]設計製造此管柱，使其盡量吻合一般 HPLC 不鏽鋼管柱之使用範圍，管柱結構如圖 2-2 所示。首先將一長 度 20 公分、外徑 2 公分、內徑 8 毫米、耐酸鹼的不鏽鋼管柱兩側切 割出長15 公分寬 4 毫米的開口，然後將長 18 公分、外徑 8 毫米、內 徑3 毫米的玻璃管柱放入上述之不鏽鋼管柱中，在這樣的設計下，光 線可以從不鏽鋼管其中一側的開口進入，穿透過玻璃管柱後，再從另

米，如圖2-2A），此 male nuts 內嵌有一外徑 6.35 毫米、內徑 3 毫米

的不鏽鋼管，當male nuts 擠壓 O 型環時，此不鏽鋼管會透過 O 型環

與玻璃管連結成一內徑3 毫米、長度 25 公分之空心管路，如此一來，

便可將層析系統中所使用之靜相填充於其內；而為了使靜相不會流

失，不鏽鋼管末端必需先接上一Swagelok nut（圖 2-2B），然後連接

內含擋板（frit，0.45 μm）的 external column end connector（圖 2-2C），

此即完成自製HPLC 管柱本體。此管柱前後端加上欲連接至梯度沖堤 幫浦（前）以及 UV/Vis 偵測器（後）的中間不鏽鋼線路後，一套耐 高壓、耐酸鹼、又具有透光性質的HPLC 管柱便完成。 當管柱完成後，以針式幫浦測試其耐壓程度，確定能承受一般 HPLC 實驗之所需後，便委託建宏層析企業股份有限公司[37]以高壓 填充的方法將10 μm ODS 靜相注入管柱中，使之成為一逆相高效能 層析管柱。由於靜相是填充於兩組擋板之間，所以整個管柱長度即兩 擋板間的距離，也就是25 公分；靜相 10 μm ODS、內徑 3 毫米、長 度25 公分的管柱是相當常見的 HPLC 管柱規格。 2.1.1.2 WCD 系統

公司[40]所提供的光學掃描器（型號 CanoScan 5000）拆解下來，其 內部包含三組平面鏡和一片聚焦的透鏡，透過這個光學盒簡單設計的

光學路徑，21 公分寬的光線可以被收集在一組寬度 6 公分的 CCD（型

號Toshiba models T8E21）上，然後轉換成電訊號於銜接的個人電腦

（如圖2-3 所示），連接光學盒與個人電腦之線路以及操作界面由虹

光公司的 楊得志先生設計；燈源亦拆解自同一光學掃描器，其放射

光譜如圖2-4 所示，燈源屬冷陰極螢光燈管（cold cathode fluorescence

lamp），具高發光效率、管徑細等優點，廣泛應用於平面顯示器中， 由於其在435 nm 及 540 nm 左右有相當強的放射，我們以這兩波段分 別為光源進行吸收光譜實驗，請裕群光電科技股份有限公司[41]製作 適用之濾波片，在不同實驗中，使用特定波長的濾波片，置放於燈源 後、偵測器前，以避免多餘的不必要波長之光線進入偵測器中，濾波 片之一是435 奈米干射型濾波片（interference filter），穿透波長中心 435 nm，可穿透之波峰寬度範圍約 50 nm，穿透度約 90%，另一是 540 奈米濾波片，穿透波長中心540 nm，可穿透之波峰寬度範圍約 70 nm，穿透度約 95%。XYZ 軸調整機座分為兩個部分，第一部份可架 設燈源、管柱，第二部份架設光學盒（含濾波片），兩個部份總共可

造，待完成後，XYZ 軸調整機座置放於光學桌面上，以避免實驗操 作時之震動影響實驗準確度，實物照片見圖2-5。 在本實驗中，光線必須通過有填充靜相的管柱後抵達位於光學盒 內 的 CCD 上，雖然填充之靜相並不透明，光線可以擴散反射 （diffuse-reflection）的方式穿越於靜相空隙間（如圖 2-6），雖然以此 方式所收集的穿透（transmittance）光線來進行分析並不是一般常見 的吸收光譜測量之方法，但是根據文獻[18,19]，仍有不少研究團隊以 此種模式進行管內分離行為的觀察，此即表示以此種方式進行分析， 亦可以精確地表現樣品於管柱內之移動行為。 樣品吸收訊號的處理方法如下：樣品尚未注入管柱前，先收集光 源通過含有初始條件（initial condition）動相之管柱後抵達 CCD 的訊 號，令其為P0，樣品注入的同時，再次啟動 WCD 系統收集樣品在通 過管柱過程中所有光線強度訊號，令其為 P，吸收值 A=log(P0/P)，此 為根據 CCD 所收集之電訊號來計算樣品通過管柱過程中之吸收訊號 的方法。在稍後論文中將會提到，本系統在校正樣品訊號時，其訊號 值與樣品濃度遵守吸收光譜學中所提之比耳定律，故本研究接下來將

2.1.1.3 WCD 系統操作界面設定

進行實驗前，必須先設定好銜接 WCD 之個人電腦中的操作界面

（圖2-7），例如：樣品取樣時間、曝光時間等參數，使 WCD 獲得樣

品吸收訊號，以下會逐一介紹操作界面之設定原則。

(a) 取樣時序 (sampling timing)

擷取樣品所需花費之時間包含三個部份（圖2-8），第一是數據取 點間距時間（A），第二是偵測器曝光時間（B），第三是電腦取數據 所需時間（C）。A 數值所佔之比例相當大，同時也是唯一在每次實驗 操作前都必須重新設定之WCD 系統參數。本研究中，由於數據處理 軟體（microsoft excel）的欄數最大值為 256 欄，故為了避免擷取過 量的實驗數據，導致數據處理效率降低，在每次沖堤實驗啟動前，必 須根據樣品受靜相滯留程度與幫浦流速等實驗條件，輸入適當的數據 取點間距時間，使WCD 系統隨固定時間間隔取點，最後獲得總量不 超過200 組的樣品吸收訊號數據。例如，若一組層析實驗所需沖堤時 間約 10 分鐘的話，則可設定數據取點間距時間為 3 秒，如此一來， 整個流析過程的數據取點數量便不會超過200 組。B 數值是以百分比

靜相會導致光源訊號大幅減弱，進而影響訊號解析度，故本研究所選 擇的曝光時間長度（B 數值）固定為最大值 1600%（57.6 ms）。A 數 值與 B 數值為操作者在實驗開始前所設定之參數，在同一次流析實 驗中，此兩數值之總和為固定值，但電腦擷取數據時間 C 則會受到 處理環境的干擾所影響，若取樣過程中電腦內其他運作軟體過多的 話，C 數值便會增大且浮動程度亦會增加，不過由於每次取點的時間 皆會被電腦確實地記錄下來，故即便擷取樣品所需花費之時間會隨著 電腦穩定度而稍有差異，依舊不會影響到訊號分析的正確性。 (b) 取樣點數(sampling points) 此欄可以選擇訊號收集點的數量，總共有五個選項：670、1340、 2680、5360、10720，觀察範圍達 21 公分的 WCD 系統裡，其光學盒 內線形CCD 上有 10720 個像素（即 10720 個訊號收集點），若以相鄰 2 點做平均積分處理，會得到 5360 個訊號收集點；以相鄰 4 點、8 點、 16 點做平均積分，分別會有 2680、1340、670 個訊號收集點。本實 驗的每一組訊號波形皆由 670 個點所組成，其空間解析度為 0.3 mm （21 cm/670 個點），對本實驗所需已足夠，並且，以相鄰 16 點做平

(c) 取樣模式(sampling mode) 光學盒內的 CCD 有塗佈材料，可以過濾掉不同波長的光線，因 此，由取樣模式可以選擇光源通過 CCD 的波段，選擇模式有 5 種， 分別為 Red、Green、Blue、Color、Gray，在本實驗中，因光學盒已 加上適當的濾波片，使符合樣品吸收波長之波段的光線通過，所以， 本研究中選擇〝Gray〞為取樣模式，即 CCD 不需濾掉任何波長的光， 盡可能讓所有可用的光線都能到達偵測器，提高偵測訊號的靈敏度。 2.1.2 藥品

Tartrazine(黃色四號合成色素)，dye content approx. 90%，分子量

534.36，最大吸收波長 430 nm，購自於 SIGMA(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)。

Anthrarufin，購自於 Aldrich (WI, USA)，其分子量 240.41，最大

吸收波長 425 nm，溶於丙酮中使成為樣品溶液。動相組成為甲醇與

水。甲醇與丙酮皆屬 HPLC 級溶劑，亦購自 Aldrich。實驗用水為經

分析，便可得數種不同的實驗數據類型，此段落將對本研究中所獲得 的各種類圖譜進行定義。 由於本研究當中使用 2 組偵測系統（WCD 與傳統 UV/Vis 偵測 器），所以在這裡我們先定義(圖 2-10)：以 UV/Vis 偵測器收集訊號時， 為固定一個偵測管柱出口的位置，隨時間來擷取樣品通過偵測位置的 訊號，故所得的圖形橫座標單位為時間、縱座標單位為訊號強度，此 類型數據即稱之為時圖（temporal profile），且由於此組數據是在管柱 外之環境所收集而得，故又稱管外（post-column）時圖。使用 WCD 系統時，可以同時偵測大範圍的樣品分佈，如同瞬間拍照的技術，獲 取樣品在一維管柱空間中的訊號強度值，獲得的圖譜橫座標為管柱位 置、縱座標為訊號強度，此類型之數據稱為空圖（spatial profile），且 由 於 此 數 據 是 在 管 柱 內 之 環 境 所 獲 得 ， 故 亦 可 稱 之 為 管 內 （on-column）空圖。 WCD 系統除了可以獲得管柱內樣品的空圖訊號，若將固定一訊 號收集點所獲得的訊號強度隨著時間累積起來的話，亦可獲得橫座標 單位為時間的管內時圖數據（圖2-11）。

T1、T2、T3…Tn等流析時間時〝拍攝〞到樣品於管柱內的空圖波峰訊

號 Peak1、Peak2、Peak3…Reakn，找出以上空圖波峰之頂點分別位於

管柱位置N1、N2、N3…Nn處，再將T1、T2、T3…Tn與N1、N2、N3…Nn 等數據同時表現於同一張關係圖上，此樣品流析時間與空圖波峰頂點 位置關係圖即稱之為樣品遷移路徑圖，遷移路徑圖中所繪製出的數據 趨勢線則稱為遷移曲線（migration curve）。 2.1.4 波型指標參數 空圖與時圖波形的指標參數為： (1)波高：實驗波形的最大訊號值，空圖波高之對應符號為 h(s)、 時圖波高之對應符號為h(t)。 (2)波峰半高寬：實驗波形最大值之 1/2 高度處，波峰左右兩側的 寬度，空圖半高寬所對應之符號為 W1/2(s)、時圖半高寬所對應之符號 為W1/2(t)。 (3)波峰面積：本實驗採用積分法來估計波形下所涵蓋的波面 積，此方法將兩組訊號值以及兩訊號值的時間或距離差距以梯形面積

其中 ym 代表第一個訊號值，xm 為 ym 對應的位置；ym+1 代表第二個 訊號值，xm+1 為 ym+1 對應的位置，若 xm 與 xm+1 間隔差距越小， 則累加結果會越接近真實面積，空圖面積所對應之符號為 A(s)、時圖 面積所對應之符號為A(t)。 (4)空圖數據取點時間：WCD 系統獲得空圖波峰時的電腦記錄時 間，其所對應之符號為tp′。 (5)時圖波峰位置：時圖波峰最高點所對應的樣品流析時間，其所 對應的符號為tp*。 實驗波形（包含管內空圖波形、管內時圖波形、管外時圖波形） 所得的各項指標參數之符號的定義整理於表2-2。 2.1.5 實驗流程 實驗裝置架設完畢之後，先調整機台與多通道偵測器的相關位置 與角度，使燈源之光線能夠通過填充管柱並進入偵測器，然後根據電 腦操作界面上呈現的光訊號強度，進行機台之 XYZ 軸微調，以達最 佳化狀態（如圖 2-14），所謂最佳化狀態是指光源強度穩定且左右兩

充靜相之管柱。 （2）依照實驗條件設定幫浦沖堤程式。 （3）設定電腦操作界面。 （4）注入樣品，並將儀器蓋上黑布避免受其他光源干擾。 （5）開動幫浦進行實驗並同時以 2 組偵測系統收集樣品訊號。 （6）從電腦操作界面上看到訊號恢復至原本狀態即表示樣品已 流出管路，此時停止收集訊號。 （7）進行數據處理。 2.1.6 實驗條件 2.1.6.1 管柱耐壓性測試 管柱尚未填充靜相前進行以下測試實驗：以不鏽鋼管路連接針式 幫浦與管柱，首先將去離子水灌入針式幫浦中，然後填入特製耐高壓 管柱中，待管柱內充滿去離子水後，將管柱另外一端出口密閉，使管 柱內環境形成一密閉空間，然後以定壓操作的方法逐步緩慢地提升管

程中，動相所產生的背壓只要低於此最高耐壓數值以下，玻璃管柱便 不會壞損。 2.1.6.2 比耳定律測試 在一般的分子吸收測量實驗中，物質之吸收訊號強度會遵守比耳 定律：

A abc

=

(2-2) a 為吸光係數（absorptivity），b 為光線通過樣品溶液之路徑長度，c 為樣品濃度。由於，在本研究中所使用來計算吸收值的光線其實屬於 擴散反射穿透光線，分析方法並非一般常見的吸收光譜法，故需進行 比耳定律測試實驗，以確保本研究中 WCD 系統所獲得的實驗數據為 可採用之吸收訊號。 將Tartrazine 溶於甲醇：水=1：1（V/V）的溶液中，配製成 10、 50、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000、1500、 2000 mg L-1的樣品溶液，在注入樣品前先將管柱內打滿甲醇：水=1： 1 的溶液，測量光線穿過管柱後抵達偵測器之光強度 P0，然後再分批 將 Tartrazine 樣品溶液打入管柱內，收集光線通過後之訊號 P，將此

看出，靠近自製管柱上可觀測視窗之兩側的光源訊號較弱較不穩定， 故在此比耳定律測試實驗中，我們選擇第 250-450 個偵測點位置所獲 得的樣品吸收值來做平均，使獲得樣品在管柱內的平均吸收值，再將 樣品濃度與平均吸收值關係作圖，便可得檢量線，以測試本 WCD 系 統所獲得之吸收訊號是否合乎比耳定律。本實驗中，WCD 系統所使 用的濾波片為435 nm 濾波片。 2.1.6.3 WCD 系統再現性測試 為測量機台之穩定性與再現性，將Anthrarufin 溶於丙酮中，配製 成濃度150 mg L-1的樣品溶液，注入管柱之樣品體積為20 μL，以組 成比例為甲醇：水=93：7（V/V）的動相對樣品進行等位沖堤（isocratic elution），沖堤流速 1 mL min-1，樣品進樣後立即開啟 WCD 偵測系統 收集樣品於管柱中移動過程之樣品空間分佈訊號，數據取點間距時間 為 1.3 秒，並同時開啟 UV/Vis 偵測器收集樣品流出管柱後的吸收度 訊號（偵測器波長選擇為435 nm），重複 5 次實驗後，選擇樣品移動 至管柱位置約 10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處的五組空圖訊號 波形指標 (波高、波峰半高寬、波峰取點時間與波峰面積)來進行再

2.2 實驗結果與討論 2.2.1 管柱耐壓性測試 測試結果是此特殊設計之玻璃管柱能承受至少 200 kg cm-2 的壓 力而不產生損壞洩漏，甚至以瞬間加壓的方式使管內壓力飆升至200 kg cm-2 後再瞬間洩壓，都不會對玻璃管柱造成損壞，一般常用的 HPLC 實驗條件中，壓力鮮少超過此限，故確定此特殊設計之玻璃管 柱可進行往後之層析實驗。 2.2.2 比耳定律測試 本實驗所得之檢量線如圖2-15 所示，在低濃度條件下（300 mg L-1 以 下 ）， 樣 品 吸 收 度 與 濃 度 成 線 性 正 比 關 係 （ 趨 勢 線 迴 歸 係 數 R2=0.986），但於高濃度條件下，偵測系統所觀察到的樣品吸收度與 濃度之線性關係會產生偏差，所以在往後進行實驗時，所使用的樣品 濃度不可過高，避免收集到偏離比耳定律的樣品吸收訊號，而造成實 驗結果的討論方向發生錯誤。 2.2.3 WCD 系統再現性測試

動過程中其波形面積變化之相對標準偏差值（RSD）。結果顯示，5 組重複實驗中，樣品在移動過程中之空圖波峰面積相對標準偏差值約 0.90%-1.41%。接下來，進一步地選出 5 組重複實驗中，樣品移動到 管柱13.0 公分處之空圖波峰數據來詳細探討，分別將其波高 h(s)、波 峰半高寬 W1/2(s)、波峰數據取點時間 tp′與空圖波峰面積 A(s)數據進行 RSD 值計算，所得結果列於表 2-3。計算結果顯示，空圖波形指標 RSD 值皆小於 1.24%，以上結果表示機台穩定性良好，允許繼續進行 往後實驗。 2.3 結論 本研究所使用之偵測系統屬於一穩定性高、再現性好的大範圍觀 測系統，搭配自製的玻璃管柱，讓我們可以清楚的觀察到樣品在有填 充靜相之管柱內的移動行為。接下來的章節中，將介紹多種在層析管 柱中發生的分離行為，藉以釐清一些現有錯誤的層析觀念，對層析領 域之理論研究與教學提供一己之力。

圖2- 1 實驗裝置圖

其中，燈源、濾波片、光學盒等零件架設於XYZ 軸調整機座上，

圖2- 2 自製 HPLC 管柱結構圖

管柱規格：總長度25 公分、內徑 3 毫米。其中，中間 18 公分長度範

圖2- 3 詳細實驗裝置圖

光學盒內部包含三組平面鏡和一片聚焦透鏡，透過圖示內之光學路 徑，21 公分寬的光線可以被收集在一組寬度 6 公分的 CCD 上，然後 轉換成電訊號於個人電腦以供數據處理。

Lamp emission 400 440 480 520 560 600 Wavelength(nm) R e la ti v e In te n s it y 圖2- 4 燈源的放射圖譜 燈源屬冷陰極螢光燈管，拆解自光學掃描器，其在435 nm 及 540 nm 左右有相當強的放射。

圖2- 5 全管柱偵測系統實物照片 全管柱偵測系統包含光學盒、燈源、濾波片、XYZ 軸調整機座以及 處理訊號之個人電腦，除個人電腦以外，其餘零件皆架設於光學桌面 上，以降低實驗操作時之震動所造成的實驗誤差。燈源及濾波片由於 零件較不明顯，故於本圖中並未以箭頭指出其位置。 光學桌 XYZ 軸調整機座 自製HPLC 管柱 光學盒

圖2- 6 擴散反射穿透（diffuse-reflection transmittance）現象 由於管柱內所填充的靜相屬不透光物質，故光線穿過管柱抵達光學盒 的模式，屬擴散反射穿透現象。

圖2- 7 電腦操作界面圖 操作界面上可設定之參數包含：1.數據取點間距時間；2.偵測器曝光 時間；3.取樣點數；4.取樣模式。除了數據取點間距時間於每次實驗 前須重新輸入以外，在本研究中，偵測器曝光時間固定為 1600%（57.6 ms）、取樣點數固定為 670 個、取樣模式固定為〝Gray〞。

1

2

3

4

圖2- 8 數據取點時間說明圖 A：數據取點間距時間（實驗設定參數） B：偵測器曝光時間（實驗設定參數） C：電腦取數據所需時間（浮動值） A 數值與 B 數值為操作者在實驗開始前所設定的固定參數，C 數值受 電腦內部處理環境影響而有浮動不固定之特性。

圖2- 9 實驗所得之吸光值空時矩陣 WCD 包含 670 個偵測點，若記錄 150 組線性層析實驗數據的話， 便共有約 10 萬個數值（670×150=100,500），全部放在 excel 的 worksheet 中，縱軸代表管柱空間位置，橫軸代表 WCD 擷取數據 時間，字型選用 9 號字，欄寬降為 3，列高降為 7，螢幕 display 下降到 40%，如此一來，可將大部分數據同時呈現在螢幕上。由 圖上的明暗（樣品吸收度介於0.03-0.1 為綠色、0.1-0.25 為橘色、

圖 2- 10 管外時圖和管內空圖的定義

管外時圖是以傳統單通道偵測器收集樣品流出管柱後的訊號結果，所

得圖表橫座標單位為時間；管內空圖是以 WCD 系統同時偵測大範圍

圖2- 11 管內時圖的定義

沖堤過程中，WCD 系統持續收集大範圍之樣品空間分佈訊號，但選 擇其中一固定管柱位置為偵測點，累積隨時間而得的訊號，可得此橫 座標單位為時間的管內時圖。

圖2- 12 遷移路徑圖與遷移曲線之定義

WCD 在 T1、T2、T3…Tn等流析時間時獲得樣品於管柱內的空圖波峰

訊號 Peak1、Peak2、Peak3…Reakn，找出以上空圖波峰之頂點分別位

於管柱位置 N1、N2、N3…Nn處，再將 T1、T2、T3…Tn與 N1、N2、

圖2- 13 積分法求波形面積的示意圖 計算波形下涵蓋的面積，將 (xm, ym) 與 (xm+1, ym+1) 所涵蓋的梯形面 積算出，再將梯形面積累加即可逼近波形面積，若 xm 與 xm+1 間隔 差距越小，則經由累加得到的面積越接近真實面積。 y x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9

圖2- 14 光源最佳化狀態

實驗裝置架設完畢後，根據電腦操作界面上所呈現的光訊號強度來微 調機台的角度與方向，使獲得最佳化狀態：光源強度穩定且左右兩端 強度對稱。

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 500 1000 1500 2000 2500 Concentration (mg L-1) Ab s . 圖2- 15 Tartrazine 之檢量線 樣品配製成10-2000 mg L-1等14 組不同濃度的樣品溶液，注入管柱， 以全管柱偵測系統測量其管內平均吸收值（WCD 中，第 250-450 個 偵測點位置之平均吸收度），將樣品濃度與其平均吸收值做圖，便可 得 此 檢 量 線 ，300 mg L-1 以 下 濃 度 之 吸 收 訊 號 呈 良 好 線 性 關 係 （R2=0.986）。

R

2

=0.986

(a) (b)

(c) (d)

(a) (b) RSD=1.18% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 11 12 13 14 15 16 Column (cm) A (S) (ab s -c m ) RSD=1.20% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 11 12 13 14 15 16 Column (cm) A (S ) (a bs -c m ) (c) (d) RSD=1.40% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 11 12 13 14 15 16 Column (cm) A (S ) (a bs -c m ) RSD=0.90% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 11 12 13 14 15 16 Column (cm) A (S) (ab s -c m ) (e) RSD=1.41% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 11 12 13 14 15 16 Column (cm) A (S) (ab s -c m )

表2- 1 WCD 系統曝光時間對照表 Exposure (%) time (ms) 100 3.6 200 7.2 300 10.8 400 14.4 500 18.0 600 21.6 700 25.2 800 28.8 900 32.4 1000 36.0 1100 39.6 1200 43.2 1300 46.8 1400 50.4 1500 54.0 1600 57.6

表2- 2 實驗所得波形指標參數符號表 管內空圖波形 符號 定義 單位 tp′ 空圖數據取點時間 min h(s) 空圖波峰頂點所對應的波高 Abs W1/2(s) 空圖波峰半高寬度 cm W1/2(s)17 於管柱 17 公分處之空圖波峰半高寬度 cm A(s) 由積分法算出的空圖波峰面積 Abs-cm 時圖波形 符號 定義 單位 tp* 時圖波峰頂點位置 min h(t) 時圖波峰頂點所對應的波高 Abs W1/2(t) 時圖波峰半高寬度 min A(t) 由積分法算出的時圖波峰面積 Abs-min

表2- 3 WCD 再現性測試條件實驗中， 樣品達管柱13 公分處的空圖訊號波形指標 波形指標 波高 h(s)(Abs) 波峰半高寬 W1/2(s)(cm) 波峰取點時間 tp′（min） 波峰面積 A(s)(Abs-cm) Run 1 0.293 2.54 1.55 0.850 Run 2 0.294 2.54 1.53 0.868 Run 3 0.294 2.54 1.52 0.864 Run 4 0.295 2.54 1.55 0.868 Run 5 0.291 2.57 1.53 0.842 RSD 0.430% 0.578% 0.687% 1.24%

第三章 影響層析波峰變寬原因之探討 3.1 研究背景與理論介紹 層析是利用混合物中各別物質在流動相與靜止相中分佈不同而 造成分離的分析技術，一般流動相可是氣體或液體，靜止相則為液體 或固體。回溯層析的歷史至 1903 年[42]，蘇俄植物學家 Mikhail Tswett，第一次發表了有關層析的演說，說明他利用白堊柱將綠色葉 子中的各種植物色素分離的情形，當時他的實驗操作方法為，將混合 這些化合物的樣品溶液通過一根玻璃管柱，其內已填充了細顆粒的碳 酸鈣，被分離的物種在管柱中顯現有顏色的層帶，這也是它命名此法 為「層析法」的由來，在當時，由於線上偵測（on-line detection）技 術尚未發展，故當時的科學家必須倚靠肉眼來觀察樣品於玻璃管柱中 分離的情形。 早期的液相層析法，包括 Tswett 原先的研究[43]，是用直徑 1 到 5 公分，長度 50 到 500 公分的玻璃管柱進行分析操作，為確保合理 的流速，固體靜相中的粒子之直徑通常在150 到 200 μm 的範圍，雖 然科學家們早已了解減小填充物粒子的大小可以增加管柱效率，然

因而，古典液相層析法所使用的簡單玻璃管柱便必須以不鏽鋼管等耐 高壓管柱取代[47-49]，同時，線上偵測樣品流動訊號的偵測系統便也 開始發展起來[50]。層析法所用的偵測器，是一種將管柱流出物中樣 品成份含量與含量變化轉換成訊號輸出的裝置。在以上所述的耐高壓 不鏽鋼管柱開始使用後，從此，層析管柱就如同個黑盒子似的，將樣 品與動靜相包覆於其內，分離的結果仰賴樣品流出管柱抵達管外偵測 器時所接收到的訊號，樣品在管內的真實流動情形便無法被直接觀察 到了。這樣的狀況不僅發生在液相層析管柱中，承襲液相層析法所發 展出來的氣相層析所使用的分析管柱，大多為外壁塗佈聚醯亞胺的融 熔二氧化矽毛細管柱，也是屬於不透光的材質，所以樣品在毛細管柱 內的移動情形亦無法被觀察到，而在層析操作者無法直接觀察到層析 管柱中的分離情形之後，爾後所發展出來解釋樣品分離現象的說法， 可能因此而產生錯誤。 圖3-1 說明了三種物質 A、B、C 是如何在管柱中藉著以液體為動 相的層析法來分離。假設三物質之濃度相同，而對偵測器之訊號靈敏 度也一樣，在樣品注入的同時，傳統單通道偵測器便開始啟動，利用

寬度較窄、波高較高，反之，滯留時間較長的樣品，其所得的層析波 峰寬度較寬，而波峰高度較小，在闡述層析波形差異如此劇烈的原因 時，有些文獻或者教科書是以圖 3-1 上方的圖示方法來做進一步說明 [1,51,52]：樣品在管柱內移動過程中，波峰寬度變寬的程度與其整體 流析時間長度成正比，滯留時間越長的樣品，在管柱內允許產生更多 的擴張（dispersion），故空間上波峰寬度變寬程度越是顯著，因此， 在圖3-1 內，三種物質在沖堤過程中，對靜相滯留作用力小的樣品 A， 由於停留在管柱內時間較短，故空間波峰較窄，被沖堤出管柱後所得 之層析波形亦相對的較窄、波高較高，而對靜相滯留作用力大的樣品 C 來說，由於停留在管柱內時間較長，樣品擴張導致其空間波型較 寬，故被沖堤出管柱後所得之層析波形便較矮較寬，這樣的解釋方法 看似合理，但事實上，這並不是層析圖譜上波峰波型會產生差異的真 正原因。根據 Pai 所發表的文獻中曾經提過[12]，在數據處理試算表 （excel）中可輸入假想之層析參數來模擬樣品於層析管柱內所發生的 行為，在數組模擬結果中我們發現，不管樣品在管柱內受到靜相滯留 的力量是大是小，其樣品於管柱內的空間分佈幾乎都相同，並沒有如

column.』[1]；究竟哪一種說法才是正確的解釋呢？為了找出答案， 在本章節之研究中，我們設計一系列實驗，藉著詳細且完整的實驗數 據討論來找出影響層析波峰變寬的真正主因。 針對本研究欲探討的議題，其實在以往文獻中便已有線索可循： Gelderloos 等人曾在文獻中指出[20]，樣品空間上波峰寬度變寬的程 度與管柱位置有較直接相關，而非滯留因子之大小。根據 Tamura 等 人所發表文獻[31,53]中的實驗數據可看出，隨著樣品沖堤距離增加， 樣品確實是會受到擴張現象影響而導致其空間波峰寬度變大，但是， 不同 k 值（滯留因子）樣品間的差異並不大[54]，甚至，若管柱內所 填充的靜相顆粒太大，管柱效率較差，則不同k 值樣品間的空圖波型 則幾乎相同，且樣品從管柱前端移動至管柱末端之沖堤過程中波峰寬 度變寬程度更為顯著，這些蛛絲馬跡都在暗喻，一般傳統所得到的管 外時圖（層析圖）並不能直接反應樣品於管柱內的空間分佈情形，但 是由於並無文獻提出數據針對此議題做詳細探討，故啟發了本研究之 實驗動機。 3.2 實驗

樣品迴圈、自製之 HPLC 管柱、WCD 系統[13,38,39]和 UV/Vis 偵測

器（偵測器波長選擇為435 nm）。本實驗中 WCD 系統內所使用的濾

波片為435 nm 濾波片。

3.2.2 藥品

本研究選擇的染料樣品是Anthrarufin，購自 Aldrich（WI, USA），

其分子量 240.41，最大吸收波長 425 nm，溶於丙酮中使成為樣品溶

液，濃度為 150 mg L-1。動相組成包含HPLC 級甲醇溶劑跟去離子水，

甲醇溶劑與丙酮皆購自Aldrich，去離子水為經過 Millipore （Bedford,

MA, USA） Milli-Q 處理之 18.2 M Ω 水。

3.2.3 實驗步驟 動相以甲醇和去離子水做 15 種不同比例混合（列於表 3-1），然 後再以1 mL min-1的流速對20 μL 的樣品進行等位沖堤，在樣品注入 管柱的同時，立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集樣品流經管 柱過程的波峰訊號（包含管內空圖和管內時圖）以及管外訊號（管外 時圖），在不同動相沖堤樣品的條件下，樣品停留於管柱內所需的總 滯留時間長度不同，為了收集適量的數據來進行往後的分析處理，則

在管柱內停留的時間也就越長，如此一來，數據取點間距時間亦必須 拉長，15 種動相沖堤實驗所分別搭配的數據取點間距時間列於表 3-1，分別以編號 1 到 15 表示。 3.3 結果與討論 15 組動相以 1 mL min-1的流速對樣品進行等位沖堤後，傳統單通 道偵測器所收集到的管外層析圖譜如圖3-2 所示，15 組實驗所得之 k 值範圍介於0.54-7.27，據層析圖譜結果所計算而得的 k 值、樣品移動 速度以及其時圖波型指標結果皆詳列於表 3-2。由以上結果可看出， 在逆相層析管柱中，動相極性越大，樣品對靜相的滯留作用力便越 強、樣品移速減緩、滯留時間加長，此結果吻合傳統認知：樣品k 值 越大，其層析圖譜上之波峰的波寬越寬、波高越矮。 15 組沖堤實驗過程中，以 WCD 系統觀察所得之樣品移動至管柱 約 10.4、11.7、13.0、14.3、15.6 公分處的空圖波峰取出來作討論比 較，結果如圖 3-3(a)-(o)所示，由圖可見，樣品在管柱中，不管滯留 時間差異有多顯著，其空間波形的變化似乎不大，並沒有類似層析時 圖所得之趨勢：k 值越大，波型越趨矮寬。甚至，當樣品對靜相的滯

末端處（17 公分）的樣品空圖波峰半高寬度 W1/2(s)17 列表比較（表 3-3），由這些數據便可看出，層析圖譜所表現之波峰寬度趨勢並不能 直接反應樣品真正在管柱中的空間寬度。接下來，將詳細探討空圖數 據與時圖數據之關係。 3.3.1 空圖數據之探討 空圖波峰寬度隨k 值增加而變窄之現象的成因相當複雜，其中一 原因，是由於樣品受靜相滯留的力量不同，導致樣品初進入填有靜相 的層析管柱時，其被靜相「壓縮」的程度不同，當樣品對靜相滯留作 用力越大（k 值越大），其壓縮程度則越為顯著，故在空間上所產生 的波峰形狀越窄越高；曾有文獻指出[19,55]，樣品在進入填充有靜相 的層析管柱後，其瞬間在空間上的分佈範圍會不同，在管柱入口端 處，不同 k 值之物質的空間波峰寬度會與 1 k +1成正比，k 與 1 k +1的關 係如圖 3-4 所示，本研究中，k 值大於 1 的實驗數據確實有近似這樣 的趨勢：隨k 值增加、樣品空間波峰寬度變窄。據 Pai 實驗室畢業學 生所提之碩士論文內容[55]，層析樣品於管柱內空間波峰標準偏差 (s)

σ

與管柱長度L 之關係式如下：

0 (s )

σ

代表樣品一進入管柱後的初始空間標準偏差，其應與 1 k +1成正比 關係；D 為樣品之擴張係數（dispersion coefficient）；

Δ

t

為偵測器之 解析度代表符號，在使用同一組偵測系統的實驗條件下，此值為定 值；u 為動相沖堤流速。本章節裡，理論公式中所使用的各項參數， 其符號之定義整理於表3-4。公式（3-1）點出，樣品在層析管柱內遷 移過程中，其空間波峰寬度變化至少受 3 種力量所影響：第一，樣品 注入管柱的起始狀態；第二，樣品受擴張效應之影響；第三，樣品受 滯留效應之影響。本實驗中，以 WCD 系統所獲得的 15 組空圖數據 與 1 k +1、D 或 2 k (k +1) 皆不成正比關係，這是由於，樣品在管柱內移動 過程中，其空間波寬最初是受初始狀態之影響，但隨著樣品在管柱內 持續遷移，其受另外兩種力量影響漸趨增加；在填充良好的層析管柱 中，由於樣品受擴張效應影響程度小（本章節之 15 組實驗所得的擴 張係數皆小於0.01 cm2 s-1，遠小於FIA 系統中流動樣品之擴張係數， 動輒100 cm2 s-1以上），導致波峰寬度變化逐漸遠離 1 k +1，而漸趨向 2 k (k +1) 之關係式(見圖 3-4)，此結果與本研究中所得數據相符，即 k=1 時，空間波寬有最大值之趨勢出現；我們認為，若使用填充效率差的 層析管柱進行實驗的話，則樣品在管柱內遷移過程中受擴張影響程度

空間波峰寬度便可能較k 值小的樣品略寬一些。不管如何，可以確定 的是，空圖所表現出來的趨勢與層析時圖所表現出來的趨勢是完全不 同的，所以，接下來進行兩種類型之圖表的數據探討。 3.3.2 空時圖數據比較 為了彰顯空時圖數據之明顯差異，將表格3-3 中，實驗編號 1-15 等 15 組時圖波寬與空圖波寬分別除上實驗編號 1 之時圖波寬與空圖 波寬，藉此數據觀察當實驗條件從k=0.54 增加至 k=7.27 時，管外時 圖波寬增加程度與管內空圖波寬增加程度之差異，兩者比較結果整理 於圖3-5，k=7.27 的管外時圖層析波峰半高寬度約為 k=0.54 樣品之波 峰的4.6 倍，但是管內空圖波寬的差異卻在 20%以內，以上結果便已 顯露出，圖 3-1 用來解釋層析波峰變寬的說法是不完全正確的，層析 波峰變寬的原因並非因為樣品在管柱中擴張成較寬之波型而導致。那 麼，真正影響層析波峰變寬的原因是什麼呢？答案是樣品從含有靜相 的管柱中被釋放出管外的速度。傳統偵測器在獲得訊號的過程中，是 透過一偵檢器之容槽（例如吸收光譜之流動容槽）來收集樣品存在於 動相中的吸收訊號，當樣品對靜相的滯留作用力提升時，其整體平均

寬。至於，當 k 值增加層析時圖波峰之高度降低的原因也可以此類 推，當樣品釋放至偵測容槽的速度變慢，每單位時間內釋放的量便會 減少，則樣品訊號強度即產生減弱的趨勢。接下來將以完整的數據討 論來嚴謹地證實此說法之正確性。 據文獻指出[1]，樣品在抵達層析管柱末端（單通道偵測點位置） 時，其空間上之波峰寬度標準偏差

σ

( )s 與所獲得的層析波峰寬度標準 偏差值

σ

( )t 之關係如下列公式所示： ( ) ( )

/

s t R

L t

σ

σ

=

_(3-2) 其中符號所代表之意義見圖 3-6，其中 L 為管柱長度，tR為樣品注入 管柱後移動至管柱末端偵測點所需的時間，稱為滯留時間，而 tM 稱 為無感時間（dead time），即對靜相無滯留力量的溶劑抵達管柱出口 端偵測點所需時間，L/tR代表樣品移動速度，據公式（3-2）所示，當 樣品之空間波寬標準偏差

σ

( )s 值固定時，其層析時圖之波寬標準偏差 ( )t

σ

會與樣品移動速度成反比。根據圖 3-3 之空圖數據，可將樣品在 管柱移動過程中的遷移路徑圖畫出，結果如圖 3-7，其遷移曲線（於

故為了證實層析時圖之波寬確實會與樣品移動速度成反比，將樣品移 動速度的倒數對實驗所得之層析時圖的波峰半高寬作圖，結果如圖 3-9，由圖可證，層析時圖波峰之寬度確實與移動速度成反比關係， 當樣品之移動速度慢（um值小）的時候，由於樣品通過單通道管外偵 測器所需時間長，故實驗所得之層析時圖波峰寬度亦來的較寬；當樣 品之遷移速度快（um值大）時，由於樣品在較短時間內便可以完全通 過管外偵測器，故實驗所得之層析時圖波峰寬度便來的較窄，且這個 趨勢不僅從管外層析時圖數據可看出，管內時圖數據亦有相同趨勢： 將管柱 17 公分位置視為一固定偵測點，以 WCD 系統收集流析過程 中樣品通過此偵測點時之訊號，可獲得管內時圖，接著將k 值從 0.54 至7.27 等 15 組實驗條件所獲得的管內時圖波寬分別除上 k=0.54 之管 內時圖波寬，藉此計算結果觀察當樣品 k 值從 0.54 增加至 7.27 時之 管內時圖波寬增大程度，再將此數據與圖 3-5 所計算而得之管外時圖 波寬增加程度做對照，結果見圖3-10，可以發現，不管是管外時圖或 者是管內時圖，其波峰皆隨著樣品移動速度變慢而有相同程度變寬的 趨勢。

1

s t

k

m

m

k

=

+

(3-3)

1

1

m t

m

m

k

=

+

(3-4) ms 代表樣品存在於靜相中的質量、mm代表樣品存在動相中的質量、 mt即為兩者總和。由於樣品在抵達傳統單通道偵測器時，樣品是存在 於只有動相溶劑系統的偵檢器容槽中，故將所得之管內空圖波峰數據 乘上 1 k +1值便可發現，此值與管外層析時圖之波峰高度趨勢相同（見 表3-5，括弧內數字之變化趨勢），此即表示，在管外層析時圖譜中， 樣品波峰高度會隨著k 值改變而有不同的訊號強度。雖然說，由於樣 品存在於動相溶液與靜相溶液中的吸光靈敏度不同，兩相所得之吸收 值並沒有加成性，所以並不能以管內訊號波高乘上 1 k +1所得之值來代 表樣品存在動相中的絕對質量，但若僅探討樣品隨 k 值變化的程度 的話，此法應仍屬有效的討論方式。 3.3.3 時間效應 在第一章曾經提及，層析系統中亦存在「時間效應」（圖 3-11）， 層析圖譜中所展現的時間效應與在流動注入法（FIA）中所展現的時

稱之為時間效應」，由於此效應之存在，故據文獻指出[55,56]，在層 析系統中應會產生時移（temporal shift，

Φ

）等空時波峰質量中心產 生差距之現象，時移公式： 2 2

(

1)

k t

D k

u

Δ

Φ

2

+

≈

+

_(3-5) 其中，擴張係數的計算方法為[16,55,57]： 0 0 2 2 2 2 2 2 ( ) ( ) ( )

16

( )

2

32

m t s m t s

u

u W

D

t

t

σ

−

σ

−

σ

=

=

_(3-7) W(t)之定義見圖 3-6，為層析峰底部寬度。由於唯有溶劑前緣不受滯留 效應之影響（參考公式（3-1）），故擴張係數必須以溶劑訊號的管外 時圖結果來計算，故公式（3-7）中，

u

m

=

u

，及

t t

=

M 。 偵測器解析度

Δ

t

的計算方法為[55]： 0 2 ( ) 2 ( ) 2 2

2

1

[

s R

]

t m m R

Dt

t

u

u

kt

σ

Δ

=

σ

−

−

×

_(3-7) 將本研究中15 組數據所得之結果拿來計算時移，

σ

(s )₀ 的計算方法可 參考文獻[55]；由於計算 D 值與

Δ

t值必須仰賴不受靜相滯留力量的 溶劑波峰訊號，此訊號相當微弱，導致最後所獲得之 D 值與

Δ

t值相

即便時間效應對管外層析時圖波型影響很大，但由於管柱內樣品擴張 程度很小，故時移在層析系統中仍不明顯。 3.4 結論 根據以上實驗數據證實，圖 3-1 中，說明層析時圖波寬變寬的原 因是來自於樣品在空間上產生擴張之說法並非完全正確，正確的解釋 方法應該如圖3-12 與 3-13 所示，樣品在填充效率高之管柱內的移動 過程中，空間上波峰幾乎沒有產生寬度變化，且k 值最小的樣品與 k 值最大的樣品在移動至管柱相同位置時，其空間上波峰寬度差異亦不 大，但是由於樣品移動速度受動相極性改變影響，使得管外層析時圖 波峰寬度截然不同，而在管柱效率較差的層析管柱（例如填充顆粒較 大或者填充壓力較小等層析管柱[53]）內進行樣品分離，樣品在管柱 中的移動狀態如圖 3-13 所示，同一樣品在管柱內移動過程中之波峰 寬度變化較大，但是由於管柱效率較差，不同k 值的樣品在管柱內的 空間波寬差異更小，甚至，若管柱填充效能太差，導致樣品在管柱內 所產生之擴張情形相當嚴重的話，樣品空間寬度變化趨勢會與其停留 時間稍成正比關係（見公式 3-1），即k 值越大、樣品空間波寬亦稍為

寬造成的影響實在太大，導致樣品在空間上的任何作用力量都會在樣 品釋放出管柱後被忽略。 本研究所提之解釋層析圖譜寬度變化的說法，可以用來解釋一些 非線性層析實驗中難以理解的實驗結果，在某些非線性層析條件下， 滯留時間較長的樣品之層析波峰寬度卻較那些滯留時間短的樣品來 的窄[1,58-60]，根據本研究所提出的實驗結果來看，其原因是來自 於，當改變動相組成使較晚流析出來的樣品移速增加時，增加的程度 大於那些原本滯留時間短的樣品，也就是樣品移動速度忽然大幅提 升，而由於樣品移速與層析波峰寬度成反比關係（見圖3-9），此即表 示，這類樣品的層析波峰寬度會極小，如此一來，便造成這種『較晚 出來的樣品之波寬卻更窄』的假象了。 不可否認的，會影響層析波峰寬度變化的原因是相當廣泛的，舉 凡所有會發生在動靜兩相間的物理作用力、化學作用力都會對樣品之 層析行為產生變化，諸如此類的研究已發展數十年，相當完備，雖然 本研究中探討的方法與以往不同，但我們相信，未來層析教育工作者 在討論影響層析波峰寬度變化的原因時，本章節的內容將是不可忽視