研究背景與理論介紹

層析是利用混合物中各別物質在流動相與靜止相中分佈不同而 造成分離的分析技術，一般流動相可是氣體或液體，靜止相則為液體 或固體。回溯層析的歷史至 1903 年[42]，蘇俄植物學家 Mikhail Tswett，第一次發表了有關層析的演說，說明他利用白堊柱將綠色葉 子中的各種植物色素分離的情形，當時他的實驗操作方法為，將混合 這些化合物的樣品溶液通過一根玻璃管柱，其內已填充了細顆粒的碳 酸鈣，被分離的物種在管柱中顯現有顏色的層帶，這也是它命名此法 為「層析法」的由來，在當時，由於線上偵測（on-line detection）技 術尚未發展，故當時的科學家必須倚靠肉眼來觀察樣品於玻璃管柱中 分離的情形。

早期的液相層析法，包括 Tswett 原先的研究[43]，是用直徑 1 到 5 公分，長度 50 到 500 公分的玻璃管柱進行分析操作，為確保合理 的流速，固體靜相中的粒子之直徑通常在150 到 200 μm 的範圍，雖 然科學家們早已了解減小填充物粒子的大小可以增加管柱效率，然

因而，古典液相層析法所使用的簡單玻璃管柱便必須以不鏽鋼管等耐 高壓管柱取代[47-49]，同時，線上偵測樣品流動訊號的偵測系統便也 開始發展起來[50]。層析法所用的偵測器，是一種將管柱流出物中樣 品成份含量與含量變化轉換成訊號輸出的裝置。在以上所述的耐高壓 不鏽鋼管柱開始使用後，從此，層析管柱就如同個黑盒子似的，將樣 品與動靜相包覆於其內，分離的結果仰賴樣品流出管柱抵達管外偵測 器時所接收到的訊號，樣品在管內的真實流動情形便無法被直接觀察 到了。這樣的狀況不僅發生在液相層析管柱中，承襲液相層析法所發 展出來的氣相層析所使用的分析管柱，大多為外壁塗佈聚醯亞胺的融 熔二氧化矽毛細管柱，也是屬於不透光的材質，所以樣品在毛細管柱 內的移動情形亦無法被觀察到，而在層析操作者無法直接觀察到層析 管柱中的分離情形之後，爾後所發展出來解釋樣品分離現象的說法，

可能因此而產生錯誤。

圖3-1 說明了三種物質 A、B、C 是如何在管柱中藉著以液體為動 相的層析法來分離。假設三物質之濃度相同，而對偵測器之訊號靈敏 度也一樣，在樣品注入的同時，傳統單通道偵測器便開始啟動，利用

寬度較窄、波高較高，反之，滯留時間較長的樣品，其所得的層析波 上述之教科書內所言：『The breadth of a band increases as it moves

column.』[1]；究竟哪一種說法才是正確的解釋呢？為了找出答案，

在本章節之研究中，我們設計一系列實驗，藉著詳細且完整的實驗數 據討論來找出影響層析波峰變寬的真正主因。

針對本研究欲探討的議題，其實在以往文獻中便已有線索可循：

Gelderloos 等人曾在文獻中指出[20]，樣品空間上波峰寬度變寬的程 度與管柱位置有較直接相關，而非滯留因子之大小。根據 Tamura 等 人所發表文獻[31,53]中的實驗數據可看出，隨著樣品沖堤距離增加，

樣品確實是會受到擴張現象影響而導致其空間波峰寬度變大，但是，

不同 k 值（滯留因子）樣品間的差異並不大[54]，甚至，若管柱內所 填充的靜相顆粒太大，管柱效率較差，則不同k 值樣品間的空圖波型 則幾乎相同，且樣品從管柱前端移動至管柱末端之沖堤過程中波峰寬 度變寬程度更為顯著，這些蛛絲馬跡都在暗喻，一般傳統所得到的管 外時圖（層析圖）並不能直接反應樣品於管柱內的空間分佈情形，但 是由於並無文獻提出數據針對此議題做詳細探討，故啟發了本研究之 實驗動機。

3.2 實驗

樣品迴圈、自製之 HPLC 管柱、WCD 系統[13,38,39]和 UV/Vis 偵測 器（偵測器波長選擇為435 nm）。本實驗中 WCD 系統內所使用的濾 波片為435 nm 濾波片。

3.2.2 藥品

本研究選擇的染料樣品是Anthrarufin，購自 Aldrich（WI, USA），

其分子量 240.41，最大吸收波長 425 nm，溶於丙酮中使成為樣品溶 液，濃度為 150 mg L^-1。動相組成包含HPLC 級甲醇溶劑跟去離子水，

甲醇溶劑與丙酮皆購自Aldrich，去離子水為經過 Millipore （Bedford, MA, USA） Milli-Q 處理之 18.2 M Ω 水。

3.2.3 實驗步驟

動相以甲醇和去離子水做 15 種不同比例混合（列於表 3-1），然 後再以1 mL min^-1的流速對20 μL 的樣品進行等位沖堤，在樣品注入 管柱的同時，立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集樣品流經管 柱過程的波峰訊號（包含管內空圖和管內時圖）以及管外訊號（管外 時圖），在不同動相沖堤樣品的條件下，樣品停留於管柱內所需的總 滯留時間長度不同，為了收集適量的數據來進行往後的分析處理，則

在管柱內停留的時間也就越長，如此一來，數據取點間距時間亦必須 拉長，15 種動相沖堤實驗所分別搭配的數據取點間距時間列於表 3-1，分別以編號 1 到 15 表示。