第四章 實驗結果
第一節 材料與儀器
二、 儀器與化學品
1. Agarrose I (AMRESCO) 2. NaCl (AMRESCO)
3. Agar, Bacteriological (AMRESCO) 4. tryptone (GERBU)
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5. DNA Contaminate Removal Solution (TaKaRa)
6. Promega pGEM-T Vector Systems（including pGEM-T Vector，T4 DNA ligase，and 2X buffer）
7. Taq DNA polymerase (Protech) 8. 1kb DNA ladder marker
9. Plasmid DNA extraction kit (Geneaid) 10. Pro-Taq DNA polymerase (PRO TECH)
11. 限制酶(Restriction Enzyme) EcoR I (TaKaRa) 12. 10mM dNTP Mixer (New England Biolabs) 13. Bst DNA polymerase (New England Biolabs) 14. 10 mM dNTP (Biovan)
15. SYBR Green (Invitrogen) 16. Yeast Extract (BioVan)
17. TEA Buffer：Tris (GERBU), EDTA (GERBU), Acetic Acid (SHOWA) 18. Bromophenol blue
19. Ethidium Bromide (EtBr)
20. DNA Loading Buffer (TaKaRa) 21. Rnase A (10 mg/mL)
22. 液態氮 23. 二次水
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(二)、儀器設備
1. 超音波震盪器：Power Sonic 410
2. PCR 儀器(BIO-RAD DNA Engine Peltier Thermal Cycler) 3. NanoVue (GE Health, USA)
4. 電泳槽 Advance Mupid-2plus
第二節 實驗方法
一、台灣蒲公英 Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (ITS) 之序 列鑑定
(一)、植物之基因體 DNA 的萃取
植物 Genomic DNA 的抽取根據 Geneaid’s genomic extraction mini kit (Geneaid) 手冊之操作步驟進行，步驟如下：
Step 1：Tissue Dissociation
↓研缽和研棒先洗淨晾乾後包上錫箔紙滅菌
↓以少許二次水將研缽和研棒清洗
↓以少許 DNA Contaminate Removal Solution 將研缽和研棒清洗，再以專用 試紙擦淨
↓將樣品之葉片剪碎，各置於研缽中，加入液態氮研磨至粉末狀
↓各取 20 mg(最多 25 mg)裝入 eppendorf 中，寫上名稱排列號碼(各做 2 管)
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Step 2:Lysis
↓加 400 μL GP1 buffer 和 5 μL RNase A (10 mg/ml) 至 eppendorf 中 vortex
↓放入乾浴 65℃ 10 分鐘。每 5 分鐘拿起搖晃均勻，同時將後面步驟所需的 elution buffer(每個 Sample 50 μL )裝於 eppendorf 中預熱
↓加 100 μL GP2 buffer，vortex，放置冰上 3 分鐘
↓將混合物倒入 Filter Column(Filter Column + collection tube)，離心 13000 rpm 1 分鐘
↓將下清液以 200 μL pipet 吸入新的 eppendorf 中(約 350-400 μL )，Filter Column 丟棄
↓加 1.5 倍的 GP3 buffer(525~600 μL )，迅速 vortex 5 秒鐘
↓加 700μL 的混合物至 GD Column，離心 13000 rpm 2 分鐘
↓再將下面液體吸上來一次，離心 13000 rpm 2 分鐘
↓倒掉下面液體，加入剩餘混合物，重複以上兩個步驟
↓將所有液體倒乾淨後加 400 μL W1 buffer 至 GD Column
↓離心 13000 rpm 0.5 分鐘後倒掉下面液體
↓加 600 μL Wash buffer 至 GD Column
↓離心 13000 rpm 0.5 分鐘後倒掉下面液體
↓離心 13000 rpm 3 分鐘
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以下三個步驟在濾液仍有色素時做
↓加 400 μL 乙醇(96-100%)至 GD Column
↓離心 13000 rpm 30 秒後倒掉下面液體
↓離心 13000 rpm 3 分鐘
↓將 GD Column 放置新的 eppendorf 中
↓加 50 μL 之前所預熱好的 elution buffer
↓靜置 3 分鐘
↓離心 13000 rpm 2 分鐘
↓再將下面液體吸上來一次，靜置 3 分鐘
↓離心 13000 rpm 2 分鐘
↓所得即為台灣蒲公英與誤用品之 Genomic DNA
將管柱沖出之 Genomic DNA，經 SpinVac 乾燥後，於-20℃的冰櫃中保存。
以分光光度計測定於波長 260 nm 之吸光值估算 DNA 的濃度。
(二)、ITS 基因片段的增幅
1. PCR 反應將 ITS 基因片段擴增：
取 50 ng 的藥材 Genomic DNA，進行 PCR 反應將 ITS 基因片段擴增 出。PCR 反應總體積 50 μL 反應液包含 1μL template DNA、10 μM 引子各 1 μL，引子序列如下：
113
F3-TF (5’-GCGTCGCCCCCATCATAG-3’) B3-TF (3’-AATCCTACTACGAAGCTGG-5’)
再加入1μL 的 10 mM dNTP、5 μL 的 PCR buffer、40 μL 的 ddH
2
O 及 1 μL Taq DNA polymerase。反應溫度由循環溫控儀 (Thermocycler) 控制，流程為起 始變性溫度 95℃5 分鐘，一個循環後，變性溫度 95℃1 分鐘，鏈合溫度 58℃1 分鐘；延展溫度 72℃1 分鐘，循環 30 個週期；最後展延溫度 72℃10 分 鐘，結束循環後溫度降回4℃。之後取 PCR 反應產物 5 μL，與 bromophenol blue 染劑混勻後，注入 1% Agarose gel 中，以 100 V 電壓進行電泳分析。確 認核酸放大 ITS 基因片段訊號。
2. ITS 基因片段的質體構築
將 PCR 產物 3 μL 加入 1 μL 的 pGEM T-vector 及無菌水，將反應溶液 確實混勻，置於室溫反應 5 分鐘，以完成 DNA 的接合反應，獲得一個大小 約 3.25 kb 的重組質體。之後再轉型入大腸桿菌中 (E. coli Top 10F')，將轉 型之大腸桿菌塗盤，置於 37℃培養 18 小時後，挑菌培養於含 Ampicillin 之 液態 LB 培養基中，置於 37℃培養 18 小時，用限制酶 EcoR I 切割後，得 到兩個核酸片段，委託生技公司加以定序，以確認其序列的正確性。序列 比對則以美國國家衛生研究院 NCBI Genbank 中的 BLAST 功能進行比對。
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二、
恆溫圈環式核酸擴增法
(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP )
鑑定
(一)、LAMP 引子之設計
LAMP 引子的設計則根據本實驗所選殖的台灣蒲公英正品及誤混用藥
材之ITS 序列，進行專一性引子設計。專一性引子以引子開拓者 V3 軟體(The primer Explorer V3 software，Eiken Chemical Co. Ltd. Tokyo，Japan) 進行分
析與設計。選取ITS2 序列來設計恆溫環式核酸增幅反應所需的兩條外引子 (F3、B3)、兩條內引子(FIP、BIP)共四條引子，其中 FIP 為 F1c (c 表互補序 列)與 F2 兩條引子的連結，而 BIP 則為 B1c 與 B2 兩條引子的連結 (圖 2-14)。
各引子的序列見表 2-1 所示。
圖 2-14 LAMP primers design
Primer name Length (bp) Sequences (5’-3’)
F3
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(二)、LAMP 反應之進行
恆溫圈環式核酸增幅法 (LAMP)的試驗中，先加入 50 ng / μL)已萃取的
植物Genomic DNA 置於 0.2 mL 離心管中，再分別加入 4 μL 的內引子(inner primers) FIP 與 BIP (10 μM/each)，和 0.5 μL 的外引子(outer primers) F3 與 B3 (10 μM/each)，以及 0.5 μL 的 10 mM dNTP，2.5 μL 10X Bst buffer 及 10 μL d.d.water。於 LAMP 反應前，先將離心管置於 95℃下反應 5 分鐘後，隨即 於冰上冷却約 1 分鐘，再加入 1 μL 的 Bst DNA polymerase (New England Biolabs)，此步驟可幫助樣品核酸的變性，使 LAMP 引子能順利於目標基因 黏合，以利後續之LAMP 反應的進行。接著於 60℃進行 LAMP 反應 1 小時 後，再於 80℃作用 10 分鐘終止反應。反應結果以 1% 瓊脂膠於 150V 電壓 條件下進行 25 分鐘電泳，隨後以 Ethidium Bromide 染色 5 分鐘，再以純水 洗淨脫色後置於紫外光燈箱上觀察結果。
(三)、LAMP 特異性(Specificity)測試
以恆溫圈環式核酸增幅法 (LAMP) 相同的試驗，分別加入已萃取之台 灣蒲公英及其誤、混用藥材(西洋蒲公英、兔兒菜、黃鵪菜、刀傷草、紫背 草)植物的 Genomic DNA，進行 LAMP 之反應，觀察反應結果。
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(四)、LAMP 敏感性(Senstivity)測試
萃取後的台灣蒲公英 genomic DNA 經 NanoVue 分光光度計(GE Health，USA)定量後，將之以滅菌水稀釋為 100 ng、20 ng、1 ng、100 pg、
10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg 等濃度後，進行 LAMP 反應。反應產物以 1%洋菜膠進行電泳後，浸泡 EtBr 於 UV 光下呈色觀察。LAMP 產物亦加入 SYBR Green，於 UV 光觀察是否有綠色螢光產生。
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第四章 實驗結果
第一節 蒲公英與易混用藥材及市售品之植物型態比較
一、蒲公英及其易混用藥材之植物型態比較 (一)、台灣蒲公英（T. formosanum Kitamura）
台灣蒲公英葉叢生於根際，排列成蓮座狀，葉片呈狹披針形，倒向羽 狀深裂，葉緣具規則之齒裂，葉頂裂片三角戟狀，花梗由根莖先端長出，
頭狀花序，單一，頂生。 (圖 2-15)，瘦果紡錘形，長約 3 mm，具 5 大肋，
10 小肋。果之上方具有瘤狀突起，果頂具長約 7 mm 之喙，冠毛白色，約 6 mm (12) (圖 2-16)。
圖 2-15 台灣蒲公英植物外觀
圖 2-16 台灣蒲公英瘦果外觀
(二)、西洋蒲公英（T. officinale Weber）
西洋蒲公英葉叢生根際，葉片呈線狀披針形，羽狀深裂，裂片有不規 則細小齒裂，葉頂端尖銳。花梗由根莖先端長出，頭狀花序，單一，頂生，
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花黃 (圖 2-17)。瘦果紡錘形，長約 3 mm，具 5 大肋，10 小肋。果之全部 具有瘤狀突起，果頂具長約8 mm 之喙，冠毛白色，約 6 mm (12) (圖 2-18)。
圖 2-17 西洋蒲公英植物外觀 圖 2-18 西洋蒲公英瘦果外觀
(三)、兔兒菜（Ixeris chinensis (Thunb.) Nakai）
根生葉大而叢生，莖生葉小而互生，葉片披針形，葉全緣或舒鋸齒緣 (圖 2-19)，花為疏聚散狀圓錐花序，黃色，舌狀花(12) (圖 2-20)。
圖 2-19 兔兒菜植物外觀 圖 2-20 兔兒菜花外觀
(四)、黃鵪菜(Youngia japonica L.)
黃鵪菜，基部分枝，基生葉蓮座狀，倒披針形，琴狀羽分裂(圖 2-21)。
頭花排列為繖房狀(圖 2-22)。
圖 2-21 黃鵪菜植物外觀 圖 2-22 黃鵪菜乾燥植物外觀
(五)、刀傷草（Ixeridium laevigatum (Bl.)Sch.）
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根生葉呈披針形，莖生葉數枚，頭狀花序，成繖房狀排列(圖 2-23)。瘦 果披針形，長約3 mm，黃褐色，具 10 肋。果頂之喙長約 1 mm，冠毛污 黃白色，約3 mm(12) (圖 2-24)。
圖 2-23 刀傷草乾燥植物外觀 圖 2-24 刀傷草瘦果外觀
(六)、紫背草(Emilia sonchifolia (L.) DC. var. javanica (Burm. f.) Mattfeld) 紫背草葉互生，業莖背長呈紫紅色，疏散房狀花序。瘦果為狹矩圓錐
形，長約3 mm，具 5 大肋。果頂具無長喙，冠毛白色，約 8 mm(12) (圖 2-26)。
圖 2-25 紫背草乾燥植物外觀
圖 2-26 紫背草瘦果外觀
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二、市售品之植物型態比較
市售鮮品及藥材購自台灣北、中、南中藥店及青草藥店，購買之店家 如表2-2。經檢視鮮品及乾品之藥材，比對其外觀形態性狀
(3,12,13,56)
，確認 業者自稱蒲公英之4 種鮮品及 5 種乾品為兔兒菜，另有 10 種乾品不是兔 兒菜(圖 2-27)，故以此 10 種乾品進行恆溫圈環式核酸擴增法鑑定。表 2-2 蒲公英市售品收集店家
青草店名 鮮品 乾品1 乾品 2 1 Ο蘭百草店 1-1 兔兒菜 1-2 兔兒菜 1-3 蒲公英 2 Ο強百草店 2-1 兔兒菜 2-2 兔兒菜 2-3 蒲公英
3 Ο賢青草行 3-3 蒲公英
4 Ο山青草行 3-1 兔兒菜 3-2 兔兒菜
5 ΟΟ煌青草行 4-3 蒲公英
6 Ο仲堂中藥行 5-3 蒲公英
7 Ο村青草行 4-1 兔兒菜 4-2 兔兒菜
8 Ο明中草藥行 6-3 蒲公英
9 弘Ο青草店 7-3 蒲公英
10 一Ο青草店 8-3 蒲公英
11 Ο記漢藥青草店 9-3 蒲公英
12 Ο順青草店 10-3 蒲公英
13 Ο益青草店 5-2 兔兒菜
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圖 2-27 十家蒲公英藥材乾品
1、Ο 蘭百草店藥材乾品 2、Ο強百草店藥材乾品 3、Ο賢青草行藥材乾品
4、ΟΟ煌青草行藥材乾品 5、Ο仲堂中藥行藥材乾品 6、Ο明中草藥行藥材乾品
7、弘 Ο 青草店藥材乾品 8、一 Ο 青草店藥材乾品 9、Ο 記漢藥青草店藥材乾品
10、Ο 順青草店藥材乾品
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第二節 台灣蒲公英之分子鑑定及其易誤、混用藥材的鑑別
一、分光光度計測定值估算 DNA 的濃度
萃取出的 Genomic DNA，以分光光度計測定於波長 260 nm 之吸光值估 算 DNA 的濃度。
DNA 的濃度 台灣蒲公英 135 ng / μL 西洋蒲公英 205.5 ng / μL 兔兒菜 1016 ng / μL 黃鵪菜 611 ng / μL 刀傷草 533 ng / μL 紫背草 245 ng / μL
表2-3 DNA 估算的濃度
二、台灣蒲公英及其易誤、混用藥材之 ITS 序列比對
台灣蒲公英及其易誤、混用藥材之 ITS 序列於 NCBI GenBank 資料庫搜尋 中草藥已登錄之基因序列(Taraxacum formosanum EF114672，Taraxacum
officinale AY862576，Ixeridium laevigatum AY862582，Youngia japonica
AY862580，Ixeris chinensis AY862578，Emilia sonchifolia var. javanica EU057987)比對，以 BLAST 設計 nuclear ribosomal DNA ITS2 之 Forward primer F3-TF 及 Backward primer B3-TF 引子。.
123
圖 2-28 台灣蒲公英引子設計
三、利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR) 鑑別台灣蒲公英 正品藥材
萃取台灣蒲公英以及其他誤用物的核酸，以這些純化後之核酸作為模
版 DNA，分別使用所設計之引子對進行物種專一性的聚合酶連鎖反應 來 測試所設計的引子：F3-TF 及 B3-TF 對於台灣蒲公英(T. formosanum) 核酸 分子的專一性，結果如同圖 2-29 所示，以台灣蒲公英核酸作為模版 DNA 進行 PCR 反應後，可於瓊脂膠電泳後的膠體上觀察到明顯的放大訊號，其 放大後之產物大小約為 250 個鹼基對(base pair，bp)。而以台灣蒲公英誤用
124
之 植 物 ： 西 洋 蒲 公 英(T. officinale) 、 刀 傷 草 (I laevigatum) 、 黃 鵪 菜 (Y.
japonica)、兔兒菜(I. chinensis)以及紫背草(E. sonchifolia var. javanica)為 PCR
反應的模板 DNA 時，則無法於電泳後之瓊脂膠上發現放大訊號，顯示本實 驗所設計之引子可專一性地放大台灣蒲公英核酸分子特定片段，具有鑑別 台灣蒲公英與其他易誤用植物的能力。為確定放大後之產物是否與台灣蒲公英的核酸特定序列吻合，將 PCR 反應後的產物構築至 pGEM-T vector 上後，質體構築的結果如圖 2-30，利 用限制酶 EcoRI 切割後，可得到兩個核酸片段，分別為大小約 3 kb 的 pGEM-T vector 與大小約 250 bp 的 insert DNA，後者即為與 vector 接合的 PCR 放大產物。Insert 片段經定序後，將序列以 BLAST 軟體與 NCBI 基因
資料庫作比較，發現其與資料庫中的台灣蒲公英 ITS2 序列 (GenBank accession no：AY862577)有 99.5%的相似，顯示本實驗所設計之引子具有專 一性辨別台灣蒲公英核酸的能力。
接著，我們檢驗F3-TF 與 B3-TF 對於 PCR 反應中，台灣蒲公英核酸分 子的敏感性。將萃取純化後台灣蒲公英核酸，稀釋成不同的濃度：120 ng、
20 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg，以作為模板 DNA，並利用上述之引子 對進行 PCR 反應。由圖 2-31 可發現，當核酸濃度低於 1 pg 時，無任何 PCR 反應後的放大訊號，可於瓊脂膠電泳上觀測到，顯示本實驗所設計之引子 對，其對於台灣蒲公英核酸偵測的濃度極限為 1 pg。結合上述結果，本實
125
驗所使用的引子同時具備專一性與敏感性，足可作為一個分辨台灣蒲公英 與誤用植物的新工具。
圖 2-29 台灣蒲公英引子 PCR 之電泳圖
Electrophoresis of PCR products from species-specific primer amplification using F3-TF and B3-TF， which were designed for identifying Taraxacum formosanum based on its nuclear ribosomal DNA (nrDNA) ITS2 region sequence. Lanes 1-6 indicates Taraxacum formosanum， Taraxacum officinale， Ixeridium laevigatum， Youngia japonica， Ixeris chinensis，and Emilia sonchifolia var. javanica， respectively.
Lane 7: blank. M: DNA marker.
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圖 2-30 PCR ITS2 建構質體經 EcoRI 水解後之產物電泳圖
Cloning of the Taraxacum formosanum PCR amplified DNA fragment of 250 bp into
pGEM-T vector. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lane 1，insert DNA (250 bp of DNA
fragment amplified by species-specific PCR); lane 2，pGEM-T vector only; lane 3， 250 bp of
insert DNA was cloned into pGEM-T vector and the recombinant plasmid digested at two
sites with EcoRI.
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圖 2-31 以 F3-TF 及 B3-TF 引子對不同濃度之台灣蒲公英模版 DNA 進行 PCR 反應的結 果
PCR sensitivity using allele-specific primers. The allele-specific primers， F3-TF and B3-TF，
were used with genomic DNA from Taraxacum formosanum for the PCR reaction. The PCR reactions were performed after adding various amounts of Taraxacum formosanum genomic DNA. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lane 2-7 were amplified with 120 ng、20 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg of extracted genomic DNA， respectively. Lane 1: blank.
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四、利用聚合酶連鎖反應鑑別市售台灣蒲公英藥材
依據上述結果，我們利用所設計之引子對 F3-TF 與 B3-TF，針對購自 9 家不同中藥店及 1 家青草藥店，共十家業者自稱為蒲公英的藥材樣品，進 行 PCR 反應，以鑑別台灣蒲公英的使用情況。將上述樣品經萃取純化其核
依據上述結果，我們利用所設計之引子對 F3-TF 與 B3-TF，針對購自 9 家不同中藥店及 1 家青草藥店，共十家業者自稱為蒲公英的藥材樣品，進 行 PCR 反應，以鑑別台灣蒲公英的使用情況。將上述樣品經萃取純化其核