第四章 實驗結果
第二節 台灣蒲公英之分子鑑定及其易誤、混用藥材的鑑別
四、 利用聚合酶連鎖反應鑑別市售台灣蒲公英藥材
依據上述結果，我們利用所設計之引子對 F3-TF 與 B3-TF，針對購自 9 家不同中藥店及 1 家青草藥店，共十家業者自稱為蒲公英的藥材樣品，進 行 PCR 反應，以鑑別台灣蒲公英的使用情況。將上述樣品經萃取純化其核 酸並進行 PCR 反應，以瓊脂膠電泳觀察反應訊號。由圖 2-32 結果可發現，
只有第 10 號樣品核酸可被本實驗之引子對放大，而其他 9 組樣品則無任何 放大訊號，顯示中藥店皆未使用台灣蒲公英，而青草藥店使用台灣蒲公英，
同時也證明本實驗所開發之鑑定方法，可作為日後台灣蒲公英正品與偽品 植物相混用之良好平台。
圖 2-32 十家市售台灣蒲公英樣品之 PCR 結果
Species-specific PCR for identifying Taraxacum formosanum among ten collected
commercial plant species. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lanes 1-10 PCR amplification
products using DNA extracted from ten collected commercial samples that were reputed to be
Taraxacum formosanum; lane N，negative control; lane P，positive control.
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第 三 節 建 立 恆 溫 圈 環 式 核 酸 擴 增 法 (LAMP) 快 速 鑑 定 台 灣 蒲公英正品藥材
一、恆溫圈環式核酸擴增法之引子設計與反應性測試 (一)、引子設計
以引子開拓者 V3 軟體設計一組共 4 條的 LAMP 引子，其中包含 2 條 可使 LAMP 的反應起始的外引子(outer primer；即 F3 及 B3)，及 2 條可讓 LAMP 的反應持續進行的 inner primers (FIP 及 BIP)共 4 條高特異性的 LAMP 引子
表2-4 LAMP 引子序列表
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(二)、恆溫圈環式核酸擴增法之反應性測試與反應產物分析
透過 LAMP 所放大的核酸有許多大小不一的片段，因此在 DNA 電泳 後會出現 ladder pattern 的結果，如圖 2-33。圖 2-33 中，Lane N 為不含蒲公 英核酸的 negative control 組；Lane P 為 LAMP 產物。將 SYBR Green 染劑 加入產物中可以直接以肉眼觀察結果，左側為不含蒲公英核酸的 negative control 組，無螢光產生。右側為 LAMP 產物，則有螢光產生(圖 2-33)。
圖 2-33 台灣蒲公英 LAMP 反應產物之檢測
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二、LAMP 引子的專一性測試 (Specificity of LAMP primers)
取正品蒲公英與其 5 種易誤、混用藥材，如西洋蒲公英藥材之 Genomic DNA，加入經設計之高特異性台灣蒲公英鑑別之 LAMP 引子，於 65℃條件 下藉由 Bst DNA polymerase 催化，進行 LAMP 反應。經 1% 洋菜膠電泳結 果如圖 2-34，只有台灣蒲公英有 DNA ladder pattern 的訊號出現，顯示我們 所設計的 LAMP 特異性佳，可初步用於台灣蒲公英真偽藥材的分子鑑定之 用。
圖 2-34 台灣蒲公英 LAMP 反應產物之測試
M: DNA marker；Lane N:Negative control；Lane1:Taraxacum formosanum；Lane2:Taraxacum officinale；Lane3:Ixeridium laevigatum；Lane4:Youngia japonica；Lane5:Ixeris Chinensis；
Lane6:Emilia sonchifolia var.javanica
。132
三、LAMP 引子的靈敏性測試 (Sensitivity of LAMP primers)
為瞭解所設計的 LAMP 引子之靈敏度，將抽取出來的台灣蒲公英核酸 進行一系列稀釋，並於相同的條件下進行 LAMP 反應。另外，也利用 LAMP 引子中的外引子 F3 與 B3，做為傳統 PCR 反應的引子，同樣進行核酸放大 的實驗。由圖2-35 結果顯示，LAMP 反應可於最低約 1 pg 的核酸濃度中進 行，相較於圖2-36 的結果，當核酸濃度低於 1 ng 時，即無明顯核酸放大訊 號，其靈敏度前者明顯優於後者。將 SYBR Green 染劑加入 LAMP 產物中 以肉眼觀察綠色螢光，其結果與圖 2-34 之 1% 洋菜膠電泳相同。
圖 2-35 台灣蒲公英 LAMP 反應的靈敏性測試
Lane N 為 negative control；Lane1:120 ng；Lane2:20 ng；Lane3:1 ng；Lane4:100 pg；Lane5:10
pg；Lane6:1 pg；Lane7:100 fg；Lane8:10 fg；Lane9:1 fg。
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圖 2-36 以 LAMP 外引子 F3 及 B3 對不同濃度之台灣蒲公英模版 DNA 進行 PCR 反應的 結果
Lane N 為 negative control；Lane1:120 ng；Lane2:20 ng；Lane3:1 ng；Lane4:100 pg；
Lane5:10 pg；Lane6:1 pg。
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四、恆溫圈環式核酸擴增法與 PCR 方法鑑別市售台灣蒲公英藥材
分別抽取由北中南各地購入之市售蒲公英藥材 Genomic DNA，比較 LAMP 方法與 PCR 方法鑑定如圖 2-37、圖 2-38。LAMP 方法之鑑定與 PCR 鑑別方法所得結果是一致的。
.
圖 2-37 LAMP 方法鑑定市售蒲公英藥材之真偽
Lane M, 1 kb of DNA ladder marker; lane N, genomic DNA of Ixeris chinensis ; lane
1-10, ten commercial plants of Taraxacum formosanum from various herbal markets.
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圖 2-38 PCR 方法鑑定市售蒲公英藥材之真偽
Lane M, 1 kb of DNA ladder marker; Lane N, genomic DNA of Ixeris chinensis ; Lane
1-10, ten commercial plants of Taraxacum formosanum from various herbal markets.
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第五章 討論
根據「新修本草」最初記載的蒲公英為多種同屬植物之全草，因此台 灣蒲公英、西洋蒲公英和中國產蒲公英皆為蒲公英屬植物，經由蒲公英植 物形態，主要以總苞向下反轉與否，判斷是否為台灣蒲公英或西洋蒲公英，
若為全草乾品萎凋後則不易明確區別，而且台灣蒲公英與中國產蒲公英總 苞皆不反轉，因此乾品之外觀形態僅可做為初步鑑定之參考，而以台灣蒲 公英與西洋蒲公英等誤用植物間不同的瘦果，也可作為鑑別的方法。
由於核酸檢驗法具有專一性、穩定性、微量、準確、易操作及快速等 優點，特別適合近緣品種、破碎與腐爛藥材、標本、古化石等珍貴樣品的 鑑定，達到快速篩選高品質藥材，並建立生藥質量標準。近年來中國大陸 已開始注重珍貴及瀕危藥材之維護，正積極發展中草藥之 DNA 分子標誌研 究，同時亦對原生藥、中成藥及其基源，進行真偽優劣的鑑定。
生物體內用於核醣體轉譯時所需的 5.8S rRNA，是由 5.8S rDNA 基因轉 錄而來，而分佈於該基因上游與下游之 ITS1 及 ITS2 基因，其序列具重複 性、多分歧性及共演化之特性（
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），因此常被用於物種之分類及親源分析。ITS1-5.8S rDNA-ITS2 的 DNA 片段長度從 550 bp~850 bp
(83-85)
，而經由 GenBank 設計所比對選取之高特異性的 DNA 片段，能夠做為同種或不同 種物種的鑑別之依據。因此，本研究首先藉由比對 GenBank 資料庫中，蒲 公英與其易混用藥材間的 ITS 基因序列，找出其中差異較大的區域，以作137
為引子設計的依據。比對結果，雖然發現台灣蒲公英與 Taraxacum 屬的其 他近緣物種內的 ITS1 與 ITS2 核酸序列無太大的差異(變異度約為 4.70%及 4.88%)，然而台灣蒲公英與及其誤、混用藥材的序列差一則較大，以 ITS2 的序列變化而言，其 ITS2 的種間差異性(interspecies variation)範圍約為 27.02%至 59.45%，因此便可進一步針對 ITS2 與其他蒲公英易混用藥材之 ITS2 加以比對，設計一組高特異性之台灣蒲公英引子對，藉以區辨其他誤 用藥材的 ITS2 序列。取設計好的一對引子進行台灣蒲公英與其易混用藥材 的聚合酶連鎖反應，發現僅台灣蒲公英藥材的 Genomic DNA 可以擴增出約 250 bp 大小的 ITS2 片段反應產物，將產物定序並分析比對 DNA 序列，證 實該序列確為台灣蒲公英之 ITS 序列，顯見這組引子對具有鑑別台灣蒲公 英的專一性及靈敏度。並能藉此鑑別出台灣蒲公英與其易混用的 5 種藥材。
以上述的 PCR 方法鑑定，約需耗費 3 到 4 個小時的時間，而為尋求更 省時與便利的鑑定方法，我們應用可於恆溫進行的的恆溫圈環式核酸擴增 法，使用台灣蒲公英與其混用藥材之 ITS2 基因組為 DNA 分子標誌，以引 子開拓者V3 軟體設計一組共 4 條的 LAMP 引子，其中包含 2 條可使 LAMP 的反應起始的外引子(outer primer；即 F3 及 B3)，及 2 條可讓 LAMP 的反 應持續進行的 inner primers (FIP 及 BIP)共 4 條高特異性的 LAMP 引子
；
原 則上，LAMP 引子需全部黏合並擴增到目標的 DNA 片段反應才能算完成反 應；將該設計完成的這組 LAMP 引子對，加入含蒲公英模板 DNA 的反應138
溶液中，經 65℃進行反應後，取 LAMP 產物，經瓊脂膠核酸電泳後，由 EtBr 溶液中染色，可經由 UV 燈觀察出膠上呈現出 LAMP 反應特有的 ladder 訊 號，由此可證實，本研究中所設計的這組 LAMP 引子對，具有高專一性地 放大蒲公英 ITS2 的核酸片段。
再者，針對該引子之核酸需求的敏感度，本研究發現所設計的引子，
對於含較少目標核酸的溶液中仍能進行核酸放大的反應。於敏感度試驗 中，將台灣蒲公英的核酸稀釋成不同的濃度，最高為100 ng，最低則為 1 fg，
並於相同的 LAMP 反應條件下，觀察核酸放大情形。結果發現該引子對的 靈敏度可至約 1 pg 之標的核酸的添加量。相較於前述的 PCR 反應鑑定台灣 蒲公英，其 LAMP 反應靈敏度約高於 PCR 反應近 1000 倍。
LAMP 反應後，經瓊脂膠核酸電泳後，同樣浸泡 EtBr 染色，於 UV 燈 下觀察到相同的 ladder 訊號，且訊號的產生與反應溶液中的蒲公英核酸濃 度有關，當核酸濃度於 1 pg 時，LAMP 反應依然可不受影響進行，傳統 PCR 反應，如 PCR-RFLP、RAPD 或 ARMS，則無法達到與 LAMP 反應的靈敏 度，於核酸濃度低於 1 ng 時，便無法順利進行反應，顯見 LAMP 反應之靈 敏度遠勝傳統 PCR 法，十分具有作為快速物種鑑定方法的潛力。
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第六章 結論
根據文獻報導目前台灣市售的蒲公英基源，常被以形態相似的其他菊 科植物替代，此等混用或誤用的基源乾品，不易由外觀區別，而其主成分 與藥理特性與蒲公英的差異，可能直接影響療效及用藥的安全性。
本論文運用 DNA 分子標誌研究，藉由比對 GenBank 資料庫上台灣蒲 公英與其易混用藥材間的 ITS2 基因序列，找出差異較大的區域，設計一對 可作為分子鑑定之引子。該引子對可直接進行台灣蒲公英與其易混用藥材 的聚合酶連鎖反應，其擴增出之 PCR 產物約為 250 bp 大小的 ITS2 片段，
將產物定序並分析確為台灣蒲公英 DNA 序列，顯示 Species-specific PCR Primers 可成功的鑑別出台灣蒲公英與其易混用的 5 種藥材。
此外，針對中藥材台灣蒲公英與其易混用藥材西洋蒲公英等之 ITS2 基 因組，設計高特異性的 LAMP 引子，同時藉由最佳化反應條件，並分析方 法的檢測靈敏度和特異性，觀察中藥材正品及易混用藥材的 LAMP 檢測效 果，建立 LAMP 之基因體鑑別方法。
本研究所設計之 LMAP 引子可專一地放大含台灣蒲公英模板 DNA 的 反應溶液，且可於核酸濃度1 pg 下進行 LAMP 反應，其敏感性遠遠勝過傳 統 PCR 法，顯見本研究已成功地建立了台灣蒲公英中藥材檢驗系統。
由於市場上所使用的蒲公英相當混亂，因此需要建立快速且簡易的方 法以保障消費者用藥安全；根據一項市場調查，市面上所販售的蒲公英有
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94.7% (36/38)都不是台灣蒲公英，而是西洋蒲公英、兔兒菜、黃鵪菜、刀傷 草、紫背草等植物，透過本篇研究，我們除建立台灣蒲公英與常見易混用 藥材檢測方法為模式研究，未來亦可應用於其他藥材或其他誤混用藥材的 鑑定上，加速完成其他中藥材真偽之檢驗系統之 LAMP 方法的建立，以確 保中草藥使用安全。
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第七章 參考文獻
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