第四章 實驗結果
第二節 台灣蒲公英之分子鑑定及其易誤、混用藥材的鑑別
二、 台灣蒲公英及其易誤、混用藥材之 ITS 序列比對…
台灣蒲公英及其易誤、混用藥材之 ITS 序列於 NCBI GenBank 資料庫搜尋 中草藥已登錄之基因序列(Taraxacum formosanum EF114672，Taraxacum
officinale AY862576，Ixeridium laevigatum AY862582，Youngia japonica
AY862580，Ixeris chinensis AY862578，Emilia sonchifolia var. javanica EU057987)比對，以 BLAST 設計 nuclear ribosomal DNA ITS2 之 Forward primer F3-TF 及 Backward primer B3-TF 引子。.
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圖 2-28 台灣蒲公英引子設計
三、利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR) 鑑別台灣蒲公英 正品藥材
萃取台灣蒲公英以及其他誤用物的核酸，以這些純化後之核酸作為模
版 DNA，分別使用所設計之引子對進行物種專一性的聚合酶連鎖反應 來 測試所設計的引子：F3-TF 及 B3-TF 對於台灣蒲公英(T. formosanum) 核酸 分子的專一性，結果如同圖 2-29 所示，以台灣蒲公英核酸作為模版 DNA 進行 PCR 反應後，可於瓊脂膠電泳後的膠體上觀察到明顯的放大訊號，其 放大後之產物大小約為 250 個鹼基對(base pair，bp)。而以台灣蒲公英誤用
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之 植 物 ： 西 洋 蒲 公 英(T. officinale) 、 刀 傷 草 (I laevigatum) 、 黃 鵪 菜 (Y.
japonica)、兔兒菜(I. chinensis)以及紫背草(E. sonchifolia var. javanica)為 PCR
反應的模板 DNA 時，則無法於電泳後之瓊脂膠上發現放大訊號，顯示本實 驗所設計之引子可專一性地放大台灣蒲公英核酸分子特定片段，具有鑑別 台灣蒲公英與其他易誤用植物的能力。為確定放大後之產物是否與台灣蒲公英的核酸特定序列吻合，將 PCR 反應後的產物構築至 pGEM-T vector 上後，質體構築的結果如圖 2-30，利 用限制酶 EcoRI 切割後，可得到兩個核酸片段，分別為大小約 3 kb 的 pGEM-T vector 與大小約 250 bp 的 insert DNA，後者即為與 vector 接合的 PCR 放大產物。Insert 片段經定序後，將序列以 BLAST 軟體與 NCBI 基因
資料庫作比較，發現其與資料庫中的台灣蒲公英 ITS2 序列 (GenBank accession no：AY862577)有 99.5%的相似，顯示本實驗所設計之引子具有專 一性辨別台灣蒲公英核酸的能力。
接著，我們檢驗F3-TF 與 B3-TF 對於 PCR 反應中，台灣蒲公英核酸分 子的敏感性。將萃取純化後台灣蒲公英核酸，稀釋成不同的濃度：120 ng、
20 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg，以作為模板 DNA，並利用上述之引子 對進行 PCR 反應。由圖 2-31 可發現，當核酸濃度低於 1 pg 時，無任何 PCR 反應後的放大訊號，可於瓊脂膠電泳上觀測到，顯示本實驗所設計之引子 對，其對於台灣蒲公英核酸偵測的濃度極限為 1 pg。結合上述結果，本實
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驗所使用的引子同時具備專一性與敏感性，足可作為一個分辨台灣蒲公英 與誤用植物的新工具。
圖 2-29 台灣蒲公英引子 PCR 之電泳圖
Electrophoresis of PCR products from species-specific primer amplification using F3-TF and B3-TF， which were designed for identifying Taraxacum formosanum based on its nuclear ribosomal DNA (nrDNA) ITS2 region sequence. Lanes 1-6 indicates Taraxacum formosanum， Taraxacum officinale， Ixeridium laevigatum， Youngia japonica， Ixeris chinensis，and Emilia sonchifolia var. javanica， respectively.
Lane 7: blank. M: DNA marker.
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圖 2-30 PCR ITS2 建構質體經 EcoRI 水解後之產物電泳圖
Cloning of the Taraxacum formosanum PCR amplified DNA fragment of 250 bp into
pGEM-T vector. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lane 1，insert DNA (250 bp of DNA
fragment amplified by species-specific PCR); lane 2，pGEM-T vector only; lane 3， 250 bp of
insert DNA was cloned into pGEM-T vector and the recombinant plasmid digested at two
sites with EcoRI.
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圖 2-31 以 F3-TF 及 B3-TF 引子對不同濃度之台灣蒲公英模版 DNA 進行 PCR 反應的結 果
PCR sensitivity using allele-specific primers. The allele-specific primers， F3-TF and B3-TF，
were used with genomic DNA from Taraxacum formosanum for the PCR reaction. The PCR reactions were performed after adding various amounts of Taraxacum formosanum genomic DNA. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lane 2-7 were amplified with 120 ng、20 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg of extracted genomic DNA， respectively. Lane 1: blank.
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四、利用聚合酶連鎖反應鑑別市售台灣蒲公英藥材
依據上述結果，我們利用所設計之引子對 F3-TF 與 B3-TF，針對購自 9 家不同中藥店及 1 家青草藥店，共十家業者自稱為蒲公英的藥材樣品，進 行 PCR 反應，以鑑別台灣蒲公英的使用情況。將上述樣品經萃取純化其核 酸並進行 PCR 反應，以瓊脂膠電泳觀察反應訊號。由圖 2-32 結果可發現，
只有第 10 號樣品核酸可被本實驗之引子對放大，而其他 9 組樣品則無任何 放大訊號，顯示中藥店皆未使用台灣蒲公英，而青草藥店使用台灣蒲公英，
同時也證明本實驗所開發之鑑定方法，可作為日後台灣蒲公英正品與偽品 植物相混用之良好平台。
圖 2-32 十家市售台灣蒲公英樣品之 PCR 結果
Species-specific PCR for identifying Taraxacum formosanum among ten collected
commercial plant species. Lane M，100 bp DNA ladder marker; lanes 1-10 PCR amplification
products using DNA extracted from ten collected commercial samples that were reputed to be
Taraxacum formosanum; lane N，negative control; lane P，positive control.
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第 三 節 建 立 恆 溫 圈 環 式 核 酸 擴 增 法 (LAMP) 快 速 鑑 定 台 灣 蒲公英正品藥材
一、恆溫圈環式核酸擴增法之引子設計與反應性測試 (一)、引子設計
以引子開拓者 V3 軟體設計一組共 4 條的 LAMP 引子，其中包含 2 條 可使 LAMP 的反應起始的外引子(outer primer；即 F3 及 B3)，及 2 條可讓 LAMP 的反應持續進行的 inner primers (FIP 及 BIP)共 4 條高特異性的 LAMP 引子
表2-4 LAMP 引子序列表
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(二)、恆溫圈環式核酸擴增法之反應性測試與反應產物分析
透過 LAMP 所放大的核酸有許多大小不一的片段，因此在 DNA 電泳 後會出現 ladder pattern 的結果，如圖 2-33。圖 2-33 中，Lane N 為不含蒲公 英核酸的 negative control 組；Lane P 為 LAMP 產物。將 SYBR Green 染劑 加入產物中可以直接以肉眼觀察結果，左側為不含蒲公英核酸的 negative control 組，無螢光產生。右側為 LAMP 產物，則有螢光產生(圖 2-33)。
圖 2-33 台灣蒲公英 LAMP 反應產物之檢測
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二、LAMP 引子的專一性測試 (Specificity of LAMP primers)
取正品蒲公英與其 5 種易誤、混用藥材，如西洋蒲公英藥材之 Genomic DNA，加入經設計之高特異性台灣蒲公英鑑別之 LAMP 引子，於 65℃條件 下藉由 Bst DNA polymerase 催化，進行 LAMP 反應。經 1% 洋菜膠電泳結 果如圖 2-34，只有台灣蒲公英有 DNA ladder pattern 的訊號出現，顯示我們 所設計的 LAMP 特異性佳，可初步用於台灣蒲公英真偽藥材的分子鑑定之 用。
圖 2-34 台灣蒲公英 LAMP 反應產物之測試
M: DNA marker；Lane N:Negative control；Lane1:Taraxacum formosanum；Lane2:Taraxacum officinale；Lane3:Ixeridium laevigatum；Lane4:Youngia japonica；Lane5:Ixeris Chinensis；
Lane6:Emilia sonchifolia var.javanica
。132
三、LAMP 引子的靈敏性測試 (Sensitivity of LAMP primers)
為瞭解所設計的 LAMP 引子之靈敏度，將抽取出來的台灣蒲公英核酸 進行一系列稀釋，並於相同的條件下進行 LAMP 反應。另外，也利用 LAMP 引子中的外引子 F3 與 B3，做為傳統 PCR 反應的引子，同樣進行核酸放大 的實驗。由圖2-35 結果顯示，LAMP 反應可於最低約 1 pg 的核酸濃度中進 行，相較於圖2-36 的結果，當核酸濃度低於 1 ng 時，即無明顯核酸放大訊 號，其靈敏度前者明顯優於後者。將 SYBR Green 染劑加入 LAMP 產物中 以肉眼觀察綠色螢光，其結果與圖 2-34 之 1% 洋菜膠電泳相同。
圖 2-35 台灣蒲公英 LAMP 反應的靈敏性測試
Lane N 為 negative control；Lane1:120 ng；Lane2:20 ng；Lane3:1 ng；Lane4:100 pg；Lane5:10
pg；Lane6:1 pg；Lane7:100 fg；Lane8:10 fg；Lane9:1 fg。
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圖 2-36 以 LAMP 外引子 F3 及 B3 對不同濃度之台灣蒲公英模版 DNA 進行 PCR 反應的 結果
Lane N 為 negative control；Lane1:120 ng；Lane2:20 ng；Lane3:1 ng；Lane4:100 pg；
Lane5:10 pg；Lane6:1 pg。
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四、恆溫圈環式核酸擴增法與 PCR 方法鑑別市售台灣蒲公英藥材
分別抽取由北中南各地購入之市售蒲公英藥材 Genomic DNA，比較 LAMP 方法與 PCR 方法鑑定如圖 2-37、圖 2-38。LAMP 方法之鑑定與 PCR 鑑別方法所得結果是一致的。
.
圖 2-37 LAMP 方法鑑定市售蒲公英藥材之真偽
Lane M, 1 kb of DNA ladder marker; lane N, genomic DNA of Ixeris chinensis ; lane
1-10, ten commercial plants of Taraxacum formosanum from various herbal markets.
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圖 2-38 PCR 方法鑑定市售蒲公英藥材之真偽
Lane M, 1 kb of DNA ladder marker; Lane N, genomic DNA of Ixeris chinensis ; Lane
1-10, ten commercial plants of Taraxacum formosanum from various herbal markets.
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第五章 討論
根據「新修本草」最初記載的蒲公英為多種同屬植物之全草，因此台 灣蒲公英、西洋蒲公英和中國產蒲公英皆為蒲公英屬植物，經由蒲公英植 物形態，主要以總苞向下反轉與否，判斷是否為台灣蒲公英或西洋蒲公英，
若為全草乾品萎凋後則不易明確區別，而且台灣蒲公英與中國產蒲公英總 苞皆不反轉，因此乾品之外觀形態僅可做為初步鑑定之參考，而以台灣蒲 公英與西洋蒲公英等誤用植物間不同的瘦果，也可作為鑑別的方法。
由於核酸檢驗法具有專一性、穩定性、微量、準確、易操作及快速等 優點，特別適合近緣品種、破碎與腐爛藥材、標本、古化石等珍貴樣品的 鑑定，達到快速篩選高品質藥材，並建立生藥質量標準。近年來中國大陸 已開始注重珍貴及瀕危藥材之維護，正積極發展中草藥之 DNA 分子標誌研 究，同時亦對原生藥、中成藥及其基源，進行真偽優劣的鑑定。
生物體內用於核醣體轉譯時所需的 5.8S rRNA，是由 5.8S rDNA 基因轉 錄而來，而分佈於該基因上游與下游之 ITS1 及 ITS2 基因，其序列具重複 性、多分歧性及共演化之特性（
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），因此常被用於物種之分類及親源分析。ITS1-5.8S rDNA-ITS2 的 DNA 片段長度從 550 bp~850 bp
(83-85)
，而經由 GenBank 設計所比對選取之高特異性的 DNA 片段，能夠做為同種或不同 種物種的鑑別之依據。因此，本研究首先藉由比對 GenBank 資料庫中，蒲 公英與其易混用藥材間的 ITS 基因序列，找出其中差異較大的區域，以作137
為引子設計的依據。比對結果，雖然發現台灣蒲公英與 Taraxacum 屬的其 他近緣物種內的 ITS1 與 ITS2 核酸序列無太大的差異(變異度約為 4.70%及 4.88%)，然而台灣蒲公英與及其誤、混用藥材的序列差一則較大，以 ITS2 的序列變化而言，其 ITS2 的種間差異性(interspecies variation)範圍約為 27.02%至 59.45%，因此便可進一步針對 ITS2 與其他蒲公英易混用藥材之 ITS2 加以比對，設計一組高特異性之台灣蒲公英引子對，藉以區辨其他誤 用藥材的 ITS2 序列。取設計好的一對引子進行台灣蒲公英與其易混用藥材 的聚合酶連鎖反應，發現僅台灣蒲公英藥材的 Genomic DNA 可以擴增出約 250 bp 大小的 ITS2 片段反應產物，將產物定序並分析比對 DNA 序列，證 實該序列確為台灣蒲公英之 ITS 序列，顯見這組引子對具有鑑別台灣蒲公 英的專一性及靈敏度。並能藉此鑑別出台灣蒲公英與其易混用的 5 種藥材。
以上述的 PCR 方法鑑定，約需耗費 3 到 4 個小時的時間，而為尋求更 省時與便利的鑑定方法，我們應用可於恆溫進行的的恆溫圈環式核酸擴增 法，使用台灣蒲公英與其混用藥材之 ITS2 基因組為 DNA 分子標誌，以引 子開拓者V3 軟體設計一組共 4 條的 LAMP 引子，其中包含 2 條可使 LAMP 的反應起始的外引子(outer primer；即 F3 及 B3)，及 2 條可讓 LAMP 的反 應持續進行的 inner primers (FIP 及 BIP)共 4 條高特異性的 LAMP 引子
；
原 則上，LAMP 引子需全部黏合並擴增到目標的 DNA 片段反應才能算完成反 應；將該設計完成的這組 LAMP 引子對，加入含蒲公英模板 DNA 的反應138
溶液中，經 65℃進行反應後，取 LAMP 產物，經瓊脂膠核酸電泳後，由 EtBr 溶液中染色，可經由 UV 燈觀察出膠上呈現出 LAMP 反應特有的 ladder 訊 號，由此可證實，本研究中所設計的這組 LAMP 引子對，具有高專一性地 放大蒲公英 ITS2 的核酸片段。
再者，針對該引子之核酸需求的敏感度，本研究發現所設計的引子，
對於含較少目標核酸的溶液中仍能進行核酸放大的反應。於敏感度試驗 中，將台灣蒲公英的核酸稀釋成不同的濃度，最高為100 ng，最低則為 1 fg，
並於相同的 LAMP 反應條件下，觀察核酸放大情形。結果發現該引子對的 靈敏度可至約 1 pg 之標的核酸的添加量。相較於前述的 PCR 反應鑑定台灣 蒲公英，其 LAMP 反應靈敏度約高於 PCR 反應近 1000 倍。
LAMP 反應後，經瓊脂膠核酸電泳後，同樣浸泡 EtBr 染色，於 UV 燈 下觀察到相同的 ladder 訊號，且訊號的產生與反應溶液中的蒲公英核酸濃 度有關，當核酸濃度於 1 pg 時，LAMP 反應依然可不受影響進行，傳統 PCR 反應，如 PCR-RFLP、RAPD 或 ARMS，則無法達到與 LAMP 反應的靈敏 度，於核酸濃度低於 1 ng 時，便無法順利進行反應，顯見 LAMP 反應之靈 敏度遠勝傳統 PCR 法，十分具有作為快速物種鑑定方法的潛力。
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第六章 結論
根據文獻報導目前台灣市售的蒲公英基源，常被以形態相似的其他菊 科植物替代，此等混用或誤用的基源乾品，不易由外觀區別，而其主成分
根據文獻報導目前台灣市售的蒲公英基源，常被以形態相似的其他菊 科植物替代，此等混用或誤用的基源乾品，不易由外觀區別，而其主成分