第四章 實驗結果
第二節 分子鑑定之文獻考察
四、 運用基因晶片技術在中草藥分子鑑定研究
片上。然後提取樣本 DNA 進行擴增，螢光標記後與晶片雜交。若樣本中存 在與之互補的序列即可檢測出來
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。由於中藥在加工、儲存過程中，DNA 會發生不同程度的降解，影響模 板品質，因此在用 RAPD、RFLP 等方法進行指紋鑑定時往往難以作出穩定 的 DNA 指紋圖譜。要進行 PCR 實驗時，亦需要有良好的實驗設備，對操 作者亦需長時間的訓練。對於 PCR 本身的實驗步驟繁雜，其靈敏度受到模
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板 DNA 的限制，且 DNA 來源需純化步驟，否則將影響實驗結果。
除了傳統 PCR 是一般最為人所知的核酸擴增技術外，尚有其他的核酸 擴增技術法被陸續開發及應用，諸如依賴性核酸序列擴增法(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、自主序列複製系統(Self-sustained sequence replification，SSR)。以上這些由傳統 PCR 方法所衍生發展出的應 用方法，皆有專一、快速擴增少量核酸的優點，但是這些方法皆需特殊且 精確度高的溫度控制循環儀器或相關循環溫控設備，或易有偽陽性，所要 求的核酸濃度及純度較高及增幅的效率不高等缺點。
恆溫圈環式核酸擴增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP ) 是日人 Notami 等於 2000 年研發提出的一種核酸擴增技術
(11)
。該方法有操 作簡單、僅需可以進行恆溫反應的水浴槽(water bath tank)或加熱器等即可進 行檢測(72)
，極為適合田間快速篩檢、小規模簡易實驗室或田野分子流行病 學之調查及較大規模流行病的檢疫工作。其技術原理乃是利用兩對特殊設 計的引子(Primers)包含 outer primer (F3，B3)、inner primer (FIP，BIP)兩種 和具有鏈置換活性(Strand displacement activity)的 DNA 聚合酶如 Bst DNA ploymerase，使反應過程中在模板(template)股兩端引子結合處，循環產生環 狀單鏈結構，因此確保 primers 可以在等溫條件下，可成功與模板 DNA 結 合進行鏈置換核酸擴增。比較傳統PCR 方式而言，LAMP 核酸擴增技術並 不需要反覆對模板 DNA 進行熱變性(denaturation)，而節省反覆升降溫的費106
時程式，而且催化核酸擴增的聚合酶 Bst DNA ploymerase，其最適作用溫度 是在60-65℃之間，配合引子之 Tm 值控制在 60-65℃，因而省去了 Annealing 的步驟。在此恆溫操作條件下，其被擴增的核酸分子會產生stem-loop 的結 構，而該結構 self-priming 的發生會使 DNA 片段長度呈對數展延，過程中 不間斷釋出起始或中間反應的 DNA 片段，而造成標的核酸的快速放大。
LAMP 反應的時間極短，約在 20-60 分鐘即可產生足量的核酸以供檢測。而 終 止 反 應 的 同 時 ， 可 以 以 下 方 法 簡 測 ： 副 產 物( 焦 磷 酸 鎂 Magnesium Pyrophosphate 沉澱)的濁度鑑定
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、電泳的進行，或藉由螢光染劑 SYBR Green I 的添加而顯色變化，其螢光強度檢測可以即時定量 PCR (Real-Time PCR)進行，或直接以肉眼判斷檢體的陰、陽性，即可對不同來源之基因體 鑑別。圖 2-13 LAMP Primer 在特定基因序列上的結合位置。
LAMP 技術自開發以來已廣泛應用於病毒與細菌的檢測、動物胚胎性
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別鑑定及轉基因食品鑑定等方面應用廣泛
(74-80)
。另外，亦有成功應用LAMP 技術於藥用植物之分子鑑定上的研究，如日人 Sasaki 等利用 LAMP 技術快 速鑑定 Panax ginseng 及 Panax japonicus、 Curcuma longa 及 Curcumaaromatica、 Lophophora williamsii 及 Lophophora diffusa 與瓜類 Cucumis melo
之不同保存 shelf-life 品種的鑑定(81)
等。綜合以上的研究，顯見 LAMP 技術已廣泛應用於各領域的研究。應用 這些已建構成熟的分子技術或分子標記，未來可以開發出其他更具快速、
穩定、低成本及高精確度的中藥材基因體鑑定方法，普遍使用於產業界，
以確實做好中藥品質管制，同時保障用藥安全。