乙內醯胺酶等電點聚焦分析

氨基酸為兩性物質，至少含有一個酸基（carboxyl）及一 個鹼基（α-amino）。這些游離的基團在pH變化時，可因為釋

出或接收質子而可呈現酸或鹼性。因此氨基酸可以以帶有正 電荷（cation）、負電荷（anion），或兩性離子（zwitterion）

等三種狀態存在。若氨基酸在某一pH值下其淨電荷為零，其 在電場中將不移動，此pH值為它的pI值（等電點）。也因為 淨電荷為零，淨電斥力不存在，大部份蛋白質於pI值的環境 下，溶解度會最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，

蛋白質分子所帶淨電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會 凝結。因此，將pH調到等電點的大小，大部份的蛋白質會沉 澱。利用這種現象，我們可以估算某蛋白質的等電點；另一 方面，也可以應用在電泳，達到分離蛋白質混合物的目的，

這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric focusing），簡稱為

IEF。

萃取細菌之乙內醯胺酶進行電泳，電泳結束後再利用 nitrocefin 為受質來呈色，並量測距離 (Bush and Singer, 1989)。最後根據一些已知 pI 值 (等電點) 的乙內醯胺酶為 標準值，畫出回歸曲線，求得新測距離之對應pI 值。再根據 已發表文獻各個乙內醯胺酶之 pI 值可判斷可能的乙內醯胺 酶種類 (van Loon et al., 2004)。等電點聚焦會因為酵素在膠片 上電泳時可能受到干擾，移動的位置或回歸曲線計算結果會 有誤差，因此等電點值只能供參考，遺傳物質需靠聚合酶連 鎖反應與 DNA 定序才能確認。

3.2 乙內醯胺酶粗萃取液製備

將單一菌落接種於10 ml LB 培養液 (添加抗生素CTX，5 μl /ml )中37 ℃隔夜培養後，取0.5 ml 菌液加上9.5 ml LB 置 於37℃培養箱4 小時，將菌液以2800 rpm、15 分鐘離心，去 除上清液。加入 250 μl的 0.2 M、pH 5.5 的sodium citrate (清 洗雜質) 及250 μl 的dd H²O ，最後取500 μl 置於新的

eppendoff，即為細菌懸浮液。將細菌懸浮液置於冰上，並以 14 μm 超音波震盪器將菌體打碎後，以 12000rpm、4℃，離心 5 分鐘，目的為將打碎後的菌體使之沉澱，取上清液即為乙內

醯胺酶粗萃取液 (Bush and Singer, 1989)。

3.3 乙內醯胺酶含量測試

將 2 μl 的0.5 mM nitrocefin （Oxoid） 滴入 96 well 的 microplate 中，取 2 μl 乙內醯胺酶粗萃取液使之混合，每 5 秒觀察呈色反應，如 5 秒內立即呈色，則跑等電點聚焦電泳 時，乙內醯胺酶粗萃取液取 2 μl 即可；如 5 秒內無呈色反 應，再加入 2 μl 乙內醯胺酶粗萃取液，觀察呈色反應，以此 類推。而跑等電點聚焦電泳時，乙內醯胺酶粗萃取液量取總 和。

3.4 等電點聚焦電泳（isoelectric focusing）

先將電泳槽（Pharmacia Biotech Multiphor Ⅱ）預冷，維 持 16℃，在電泳槽中央滴上適量的礦物油，均勻塗抹後將膠 片放上，膠片完全服貼在電泳槽表面，不可有氣泡。將陰極 電極條以 1 M NaOH潤濕，陽極電極條以 1 M H3PO4 潤濕後

分別置於膠片上下兩端。取適量的乙內醯胺酶粗萃取液滴於 膠片 precast polyacrylamide gel（Amersham Biosciences）上，

架上電極，使電極與電極條接觸，打開電源供應器（Pharmacia Biotech）調至 1500 伏特、50 安培、25瓦，進行電泳 90 分 鐘。

3.5 呈色反應

將 0.5mM nitrocefin 與無菌水稀釋後滴入空的無菌培養 皿中，將拭鏡紙對摺後置入培養皿中使其潤濕，再將拭鏡紙 打開攤平在IEF膠片上，觀察粉紅色形成位置 (Matthew et al., 1979) 。利用一些已知 pI 值的乙內醯胺酶作為標準值，將膠 片上所測得的粉紅色公分數，使用 Microsoft EXCEL 2003 software 將其換算成 pI 值。實驗中所使用已知 pI 值的乙內 醯胺酶分別如下：TEM-1（pI 5.4），CTX-M-3 （pI 8.4）， TEM-4

（pI 5.9）， SHV-2（pI 7.6）， SHV-5（pI 8.2）， CTX-M-14

（pI 7.9）。

3.6 比對各種pI值

依據前述方法所得到的pI值跟文獻所報告過的各個乙內 醯胺酶的pI 值進行比較，可以判斷可能的乙內醯胺酶種類。

等電點聚焦會因為酵素在膠片上電泳時可能受到干擾，移動 的位置或回歸曲線計算結果會有誤差，因此等電點值只能供 參考，遺傳物質需靠聚合酶連鎖反應與 DNA 定序才能確認。