第二章 材料方法
第二節 研究設計
7. 脈衝式膠體電泳
首先開啟水浴槽，設定溫度在56℃，並配製菌體包埋用瓊 脂(1% SeaKemGold (SKG) agarose in TE buffer)置於56℃水浴 槽備用。取適量之菌落與400 μl cell suspecsion buffer
，
再取400 μl 1.0％洋菜膠體溶液與菌液混合，再吸取 100 μl 混合菌液 注入製膠模型中，待靜置4℃下15 分鐘使包埋有菌體之膠片 (plug) 凝固。將凝固好之包埋菌體膠片從模具中取出，並置 入5 ml Lysis solution (1M Tris – HCl、0.5M EDTA、0.006M NaCl、1.0% sodium lauroyl sarcosine( SLS ) ) 加 25 μl proteinase K 溶液，置入56℃培養箱振盪處理2小時，使破壞 細胞膜讓DNA 釋出。7.2 膠塊清洗
使用半自動清洗方式：清洗程式如附錄四。
7.3 限制酵素消化切割 （Restriction Digestion）
先以70%酒精消毒單側刃之刀片及膠體切割台後，取出清 洗好的膠塊（包括PFGE分析用標準marker菌株H9812的Plug 在內）切出一寬2 mm X 長10mm之細長狀膠條(slices)，放入 裝有200 μl限制酵素專用緩衝液的1.5ml微量離心管中，置在
室溫下5-10分鐘。移除上述緩衝溶液，再加入200 μl已含有酵
素AscI(10 units)的限制酵素專用緩衝液，放置37℃水浴槽2小 時。之後取出酵素專用緩衝液，置換成200 μl的0.5 x TBE緩衝 液。
7.4 電泳操作流程
配置2400 ml的.XTris-Borate EDTA（TBE）緩衝液[10X TBE溶液 120 ml＋ 2280 ml 二次水（D.D.W.）]；取其中150 ml與1.5g SKG agarose加熱溶製成1%電泳用膠，置於56℃水浴 槽備用。將剩餘250 ml的0.5X TBE緩衝液倒入電泳槽中，開 啟脈衝是電泳裝置CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA, USA)電源、幫浦（流速70 ml/min）及冷卻裝置，
使緩衝液溫度降至14℃。組裝好電泳膠鑄膠臺（gel casting stand）並以水平桌調整水平；齒梳（comb）緊密接觸鑄膠臺 底部的撐膠板（gel platform）。將已被酵素消化之細長狀膠 條（slices）取出，用吸水紙盡量吸乾附著於其上之緩衝液，
再將細長狀膠條依序平貼於齒梳（comb）；將PFGE分析用標 準marker菌株放置於適當位置，其餘孔位放置樣本菌株。之 後將齒梳直立放置在鑄膠台(gel casting stand)上，倒入融化回 溫至56℃的% SeaKem Gold agarose電泳用膠，放置室溫20-30
分鐘或4℃ 15分鐘待冷卻凝固後即可進行電泳。
電泳條件設定如下：
Acinetobacter baumannii Initial switch time 2.2 seconds
Final switch time 54.2 seconds Run time 21 hours
Angle X Voltage Gradient 6.0 volts/cm
Temperature 14℃
Ramping factor Linear
7.5 染色與照相
電泳結束，關閉電泳裝置取出膠片，置於1 μl/ml溴化乙苯 非啶溶液（ethidium bromide）染色1020分鐘，並以二次水 DDW）褪染20-30分鐘。膠片最後放置在UV平台上觀察，並 以數位影像系統擷取DNA圖譜影像儲存成數位檔案（*.tif 檔），以供後續進行圖譜分析比對。
7.6 結果分析比對
傳統的的PFGE分析法，可依酵素處理各菌株電泳後之片 段的大小與數目，根據Tenover 等學者發表的判讀方式 (Tenover et al. 1995)，進行各菌株PFGE 分析後之片段型式 (fragment patterns)，若多於≧7 條片段之差異，則歸為不同類
型；若介於4~6 條片段之差異，則歸為不同亞型；若≦3 條 片段之差異，則歸為同一類型。即可分析菌株間相關的親源 性與流行病學上之關連性。並再依片段型式之差異，重新排 列菌株樣品順序再進行同樣條件之電泳分析，以利在親源性 關連與分類區分上之判讀。
本研究使用疾病管制局第三分局的Bionumeric軟體進行 分析，70%以上的相似度可判讀為同一cluster，85%以上的相 似度可以判讀為密切相關的次群體。