DNA 分析

4.1 小量質體 DNA 之抽取

使用 GeneMark （Taiwan） 的 Plasmid Miniprep Purification Kit進行DNA純化。

挑取生長於平板培養基上的單一菌落至4 ml 的 LB 培 養液中，於 37℃ 培養箱震盪培養約 16 小時。取1.5 ml 菌 液至微量離心管中，以室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘沉澱菌 體，去除上清液後再加入 1.5 ml 的菌液，重複上述步驟。加 入冰的 200 μl solution I(GeneMark，Taiwan)，劇烈震盪使菌 體能完全打散並均勻懸浮，再加入 200 μl Solution II

(GeneMark，Taiwan)，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動5 次，

不可振盪 (Do not vortex)，置於室溫 5 分鐘。再加入200 μl Solution III，亦溫和地上下混合搖勻五次，於室溫12,000 rpm 離心 5 分鐘，將 spin column 置入 collection tube 並吸取上 清液至 column 中，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去下層 液。加入700 μl Washing solution內含酒精(W9)，置於室溫 1 分鐘，以12,000 rpm離心 1 分鐘，倒去下層液。加入 700μl Wash Buffer 內含酒精(W9) ，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，

倒去下層液；再離心3分鐘，確定酒精完全移除。將 Elution

solution 事先在65~70℃ 預熱，並將spin column 移至新的微 量離心管上，加入 30 μl 預熱好的 Elution solution，置於室 溫1 分鐘，以 12,000 rpm 離心2 分鐘將ＤＮＡ收集下來，置 於 -20 ℃ 備用。

4.2 染色體 DNA 之抽取

使用GeneMark （Taiwan）的 Genomic DNA Purification Kit 進行染色體DNA純化。

實驗進行前，先以1.1ml的無菌水將proteinase K 溶解並儲 存於-20℃。取5 ml 菌液至微量離心管中，以室溫 12,000 rpm 離心 2 分鐘沉澱菌體，以700 μl Extraction Solution resuspend bacterial pellet，加入20 μl proteinase K stock solution，溫和的

震盪混合。置於56℃之水浴槽(water-bath)或培養箱（incubator）

3小時。再加入 700 μl Binding Solution，震盪混合均勻，繼續 置於56℃反應，直至細胞完全分解。將溶液過spin column，

將 spin column 置入 collection tube，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去下層液。加入700 μl Washing solution 清洗三次，

置於室溫 1 分鐘，以12,000 rpm離心 1 分鐘，倒去下層液。

以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，確定酒精完全移除。丟棄collect tube，將column置入新的1.5 ml離心管，加入預熱60-70℃之

Elution solution，置於室溫1 分鐘，以 12,000 rpm 離心1分鐘 將ＤＮＡ收集下來，置於 -20 ℃ 備用。

4.3 洋菜膠體電泳分析 (Agarose gel electrophoresis) 取洋菜粉 (Agarose) 加熱溶於0.5 倍的 TAE 電泳緩衝 溶液中，配置成１%的膠體後，待膠體冷卻至 50~60℃ 時，

倒入鑄膠槽中並插入齒梳 (comb)。待洋菜膠體冷卻凝固後，

拔掉comb，將膠體置於水平電泳槽內，倒入 0.5 倍的 TAE 電泳緩衝溶液。將樣品DNA 與1/6 體積的 6 倍的 loading dye 混合均勻後，加入1% 膠體之溝槽(well) 中，並於同一片 膠體的另一溝槽中注入適量之 DNA marker(約100 ng) 以茲 對照。以 50 或 100 伏特經通電適量時間後，取出膠體，將 其浸泡於含 0.5 μg /ml ethidium bromide (EtBr) 之水溶液

中，（核酸在膠體中可經 ethidium bromide (EtBr) 染色， EtBr 會嵌入核酸鹼基中，以紫外線照射，則核酸吸收紫外線波長 的光線，再經 EtBr放出可見波長的光線，藉以觀察核酸的位 置）。浸泡待十分鐘後，取出膠體並置於 UV 透射光源板上 觀察並拍照存檔。可藉由與 DNA marker 已知的片段大小進 行比較，推算出樣品中的 DNA 片段的量與分子大小。

4.4 限制酶切割與DNA之回收

取適量純化好的質體或染色體DNA置於1.5ml的微量離心 管中，利用限制酶可辨認特定序列的特性，將 DNA與所需要 的一至兩種限制酶及合適的限制酶緩衝液混合，加入1 μl 的 10倍酵素反應緩衝液 (TaKaRa)32 和 1 μl 的限制酶酵素 (TaKaRa)後，加入無菌水至 10 μl，於 37℃或其他適當的溫 度進行切割反應。反應後，即可做電泳分析，將 1%瓊脂 (agarose) 凝膠與 1 倍的 TAE 溶液 (40 mM Tris-acetate，1 mM EDTA) 置於電泳槽中，將切割完的質體與染劑 (30%

glycerol，0.25% bromophenol blue，0.25% xylene cyanol) 混合 均勻，注入1% 的瓊脂凝膠的凹槽中，並以 1 kb DNA ladder (MDBio,Inc.) 作為標準分子量的依據，在電壓 100 Volt 的狀 態下分離 DNA，當下層的染劑 (bromophenol blue) 到達距凝 膠底部約 0.5 ~ 1 公分時，便可停止分離。在使用 ethidium bromide 進行染色後可於長波 UV 光下觀察DNA 片段，利 用刀片將含有所要 DNA 片段連同瓊脂凝膠切下，放入微量 離心管中，準備進行 DNA 片段的回收。使用 Viogene Gel-M gel extraction system (Cat. EG-1001) 回收DNA 片段。首先加 入 0.5 ml 的 GEX buffer，在 60℃ 下放置 10 分鐘，讓瓊

脂凝膠溶解，之後將溶液加入 column 之中，以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒除過濾液，然後在 column 中加入 0.5 ml 的 WF buffer 後以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒除過濾液。接下 來加入 0.7 ml的 WS buffer，以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒 除過濾液後再離心 3 分鐘風乾。將 column 置入一新的微量 離心管，加入 30 μl 的無菌水在室溫下靜置 1 分鐘以溶 DNA，最後以 10,000 Xg 離心 1 ~ 2 分鐘後即可得含有 DNA 片段的水溶液，存於 -20 ℃備用。

5. 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction; PCR)：

首先取 2μl 的質體或染色體 DNA 加入微量離心管，再加入 適當的引子各1 μl （20 mM），加入 38.1 μl 無菌水， 5 μl 10X PCR Buffer，1.5μl 50mM MgCl2，1μl dNTP 和 0.4 μl Tag DNA

Polymerase （Invitrogen, Brazil; 或 Genet Bio, Korea），總體積 為 50μl。蓋上微量離心管蓋子，均勻混合後，6000 rpm 離心 20 秒。將微量離心管置入 Applied Biosystems 2720中進行反應。反 應條件為 94 ℃, 5 分鐘 1 個循環，94 ℃, 30秒、55 ℃ 45秒、

72℃ 30秒，共 30 個循環，最後為 72 ℃ 10 分鐘。反應結束 後，取PCR 產物 5 μl 混合 1 μl 的 6X dye，均勻混合後，取 5 μl

至洋菜膠體齒槽中，以 50-100V 的電壓進行電泳後以 EtBr 染 色， 25 分鐘後以 UV 光激發，拍照觀察。

我們使用附錄5所列的primer，OXA-23、 OXA-51-like、

OXA-24-like、 OXA-58-like、 SIM-1、 IMP-type、VIM-type 各 種乙內醯胺酶基因及ISAba1插入序列的存在與否。ISAba1與 blaOXA-23及bla_OXA-66的位置圖見附錄九。

6. 定序與序列比對

將分離的純化質體 DNA，送交明新生物科技公司進行自動基 因定序。後將所得之基因序列輸入至美國National Center for Biotechnology Information (NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 網站比對。比對之步驟，先進入NCBI 首頁，點選進入BLAST 之

“Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)”選項，再點選“Nucleotide”

之比對選項，輸入欲比對之核苷酸序列，即可迅速確認出抗藥基 因之種類( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )

7. 脈衝式膠體電泳 (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 7.1 菌體包埋與細菌溶解

首先開啟水浴槽，設定溫度在56℃，並配製菌體包埋用瓊 脂(1% SeaKemGold (SKG) agarose in TE buffer)置於56℃水浴 槽備用。取適量之菌落與400 μl cell suspecsion buffer

，

再取400 μl 1.0％洋菜膠體溶液與菌液混合，再吸取 100 μl 混合菌液 注入製膠模型中，待靜置4℃下15 分鐘使包埋有菌體之膠片 (plug) 凝固。將凝固好之包埋菌體膠片從模具中取出，並置 入5 ml Lysis solution (1M Tris – HCl、0.5M EDTA、0.006M NaCl、1.0% sodium lauroyl sarcosine( SLS ) ) 加 25 μl proteinase K 溶液，置入56℃培養箱振盪處理2小時，使破壞 細胞膜讓DNA 釋出。

7.2 膠塊清洗

使用半自動清洗方式：清洗程式如附錄四。

7.3 限制酵素消化切割 （Restriction Digestion）

先以70%酒精消毒單側刃之刀片及膠體切割台後，取出清 洗好的膠塊（包括PFGE分析用標準marker菌株H9812的Plug 在內）切出一寬2 mm X 長10mm之細長狀膠條(slices)，放入 裝有200 μl限制酵素專用緩衝液的1.5ml微量離心管中，置在

室溫下5-10分鐘。移除上述緩衝溶液，再加入200 μl已含有酵

素AscI(10 units)的限制酵素專用緩衝液，放置37℃水浴槽2小 時。之後取出酵素專用緩衝液，置換成200 μl的0.5 x TBE緩衝 液。

7.4 電泳操作流程

配置2400 ml的.XTris-Borate EDTA（TBE）緩衝液[10X TBE溶液 120 ml＋ 2280 ml 二次水（D.D.W.）]；取其中150 ml與1.5g SKG agarose加熱溶製成1%電泳用膠，置於56℃水浴 槽備用。將剩餘250 ml的0.5X TBE緩衝液倒入電泳槽中，開 啟脈衝是電泳裝置CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories,

Hercules, CA, USA)電源、幫浦（流速70 ml/min）及冷卻裝置，

使緩衝液溫度降至14℃。組裝好電泳膠鑄膠臺（gel casting stand）並以水平桌調整水平；齒梳（comb）緊密接觸鑄膠臺 底部的撐膠板（gel platform）。將已被酵素消化之細長狀膠 條（slices）取出，用吸水紙盡量吸乾附著於其上之緩衝液，

再將細長狀膠條依序平貼於齒梳（comb）；將PFGE分析用標 準marker菌株放置於適當位置，其餘孔位放置樣本菌株。之 後將齒梳直立放置在鑄膠台(gel casting stand)上，倒入融化回 溫至56℃的% SeaKem Gold agarose電泳用膠，放置室溫20-30

分鐘或4℃ 15分鐘待冷卻凝固後即可進行電泳。

電泳條件設定如下：

Acinetobacter baumannii Initial switch time 2.2 seconds

Final switch time 54.2 seconds Run time 21 hours

Angle X Voltage Gradient 6.0 volts/cm

Temperature 14℃

Ramping factor Linear

7.5 染色與照相

電泳結束，關閉電泳裝置取出膠片，置於1 μl/ml溴化乙苯 非啶溶液（ethidium bromide）染色1020分鐘，並以二次水 DDW）褪染20-30分鐘。膠片最後放置在UV平台上觀察，並 以數位影像系統擷取DNA圖譜影像儲存成數位檔案（*.tif 檔），以供後續進行圖譜分析比對。

7.6 結果分析比對

傳統的的PFGE分析法，可依酵素處理各菌株電泳後之片 段的大小與數目，根據Tenover 等學者發表的判讀方式 (Tenover et al. 1995)，進行各菌株PFGE 分析後之片段型式 (fragment patterns)，若多於≧7 條片段之差異，則歸為不同類

型；若介於4~6 條片段之差異，則歸為不同亞型；若≦3 條 片段之差異，則歸為同一類型。即可分析菌株間相關的親源 性與流行病學上之關連性。並再依片段型式之差異，重新排 列菌株樣品順序再進行同樣條件之電泳分析，以利在親源性 關連與分類區分上之判讀。

本研究使用疾病管制局第三分局的Bionumeric軟體進行 分析，70%以上的相似度可判讀為同一cluster，85%以上的相 似度可以判讀為密切相關的次群體。

第三章 研究結果

第一節 鮑氏不動桿菌抗藥性的持續上升

本院抗carbapneme 鮑氏不動桿菌分離率從 2002 年的 2.2%

增加到 2006 年 29.6%，呈現顯著之差異(表 1)。在引起院內感 染的鮑氏不動桿菌部分也有相同趨勢從2006 年的 36%上升到 2007 年的 58.2%。其中 2006 年總共分離到 221 株抗 carbapnem 鮑氏不動桿菌，檢體部位以 sputum 104 筆(47.0%)最多，其次 為 urine 35 筆(15.8%)，pus 36 筆(16.3%)，從 blood 分離得到 只有 8 筆(3.6%)。其中從 ICU 病人分離得到有 84 筆(38%)，從 普通病人分離得到有 76 筆(34.4%)，從慢性呼吸照護單位分離 51 筆(23.1%)，從門診分離到 10 筆(4.5%)。

2006 年所分離之 221 株抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌，依 紙錠擴散法結果顯示，對其他藥物之感受性分別為：

levofloxacin 4.1%(9/221)；ciprofloxacin 4.1%(9/221)；

ceftazidime 4.1%(9/221)；cefepime 5.0%(11/221)；

ampicillin/sulbactam 23.1%(51/221)；piperacillin/tazobactam 2.7%(6/221)；aztreonam 0% (0/221)；gentamicin 3.2%(7/221)；

amikacin 19.4%(43/221)；trimethoprim/sulfamethazole 0.9%(2/221)。

2007 年 01 月到 09 月總共分離到 476 株鮑氏不動桿菌，

收集每一位病患第一次分離得到的不重複抗carbapenem 鮑氏 不動桿菌175 株

，

這 175 隻菌株之採檢部位、病人所在單位、

及抗生素敏感性詳見表2-4。最多的檢體來自於 sputum 108 筆 (61.7%)，其次為 urine 28 筆(16%)，pus 18 筆(10.3%)，blood 8 筆（4.6%）。對其它抗生素的敏感性分別為 amikacin 9.1%，

gentamicin 5.7%，ceftazidime 2.3%，cefepime 3.4%，aztreonam 0%，ampicillin/sulbactam 13.7%，piperacillin/tazobactam 1.1%，

trimethroprim/sulfamethozale 2.9%，ciprofloxacin 3.4%，及 levofloxacin 4.6%。這 175 株中，有 94 株(53.7%)是從加護病 房分離得到，50 筆(28.6%)是從普通病房分離得到，19 筆(10.9%) 從慢性呼吸照護病房得到，8 筆(4.6%)從急診得到，4 筆(2.3%) 從門診病人分離得到。鮑氏不動桿菌的檢體來源多數來自加 護病房及普通病房呼吸道檢體（表4）。

我們從 2007 年 01 月到 09 月分離得到的 175 株不重複抗 imipenem 鮑氏不動桿菌，挑選 28 株，進行後續研究。這 28 株細菌中，有27 株為住院 72 小時候從病人身上分離得到，

其中一株院外病史不明。這28 株抗 imipenem 之鮑氏不動桿 菌之檢體來源為痰的有11 株，尿液 6 株，膿 5 株，腹水 2 株，

在文檔中 中部某區域醫院抗carbapenem鮑氏不動桿菌抗藥性之分子生物學研究; Investigation of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates in a District Hospital in Taiwan (頁 35-0)