抗生素敏感性試驗

抗藥性的偵測可由表現型和基因型的方法進行。一般臨床微 生物實驗室測試抗藥性表現型最常用的方法有兩種；一個是定性 型之抗生素紙錠擴散方法 (disk diffusion)，測量抑制環的大小，

另一個是定量型之稀釋方法 (broth or agar dilution)，測量抗生素 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration; MIC)。基因型的

測試是在偵測細菌是否具有抗藥機制，如抗藥基因 (resistance gene)，或藥物作用目標之基因突變 (target mutation)。大多數國家 所採用表現型的測試方法及抗生素藥物敏感性之判斷是依據美 國臨床檢驗室標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 所設定之準則，來決定所測試菌株對不同抗生素 之敏感性，包含感受性(susceptible)，中間性 (intermediate)，及抗 藥性 (resistant) 之臨床指標 (clinical breakpoint)，其目的是用來 預測用藥後之臨床結果。但臨床指標不包含感受性降低。感受性 降低是最近幾年來逐漸在被重視的一個微生物指標

(microbiological breakpoint)，其目的是用來指認出用臨床指標判 斷仍為感受性，但已具有抗藥機制之細菌。敏感性試驗的方法包 括以下：

2.1 瓊脂紙錠擴散試驗

將單一菌落接種於 4 ml 的 LB 液態培養基中，於 37℃ 培 養箱震盪培養隔夜後，將菌液濃度調至 0.5 McFarland (1.5×10⁸ CFU/ml )，以棉花棒沾菌作四方向均勻塗抹在 Mueller-Hinton Agar，再將含有抗生素的圓型紙錠平放在 agar 上，37°C下培養 16~18 小時，以尺量抑制環大小對照 CLSI 判讀。抗生素紙錠抑 制圈判讀依據美國國家臨床實驗室標準委員會所建議的抗生素

敏感性試驗判讀標準為依據，如鮑氏不動桿菌對 imipenem 10 μg 紙錠抑制圈直徑 ≧16 mm 為感受性，14~15 mm 為

intermediate，≦ 13mm 為抗藥性。

2.2 自動化微生物分析儀敏感性測試

將菌株次培養之後，交由芮弗士醫事檢驗所，使用該公司之 Phoenix 自動化微生物分析儀 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 進行再一次之鑑定及敏感性測試（版本

V5.15A/V4.31A）。簡要作法如下：

將菌株從冷凍庫中取出，接種於含有 5% sheep 紅血球的 Colombia agar，於37℃進行培養16～24小時。之後將細菌調成0.5 McFarland 濃度，在30分鐘內到入測試盤，在倒入測試盤的30分 鐘內放進機器進行鑑定及敏感性測試。測試標準依照CLSI對最低 抑菌濃度（MIC）之判讀標準，如鮑氏不動桿菌對imipenem之MIC

≦4 μg/ml為感受性，8 μg/ml為中間性，≧16 μg/ml為抗藥性。

2.3 E-test 最低抑菌抗生素濃度

以E-test之方法來加以實驗分析28株對imipenem有抗藥性鮑 氏不動桿菌菌株對imipenem及tigecycline之最低抑菌濃度

(minimum inhibitory concentration，MIC) 之數值，藉以更加了解 各菌株對imipenem之抗藥程度及carbapenem-resistant 鮑氏不動

桿菌對新抗生素tigecycline之感受性。

首先，製作Mueller Hinton Agar (MHA)(DIFCO) 培養基，

與分裝每管2 毫升之Mueller Hinton Broth (MHB)(DIFCO) 液 體培養基。挖取適量菌量之菌落接種於2毫升MHB 液體培養基 中，置入37℃培養箱中100 rpm 振盪培養30 分鐘後，再以MHB

稀釋適量濃度 (OD550=0.3) 之菌液。再以無菌棉棒沾取菌液均 勻塗於MHA 培養基中，並以鑷子夾取 imipenem 及 tigecycline 的 E-test 最低抑菌抗生素濃度條 (AB Bio Disk) 貼於塗完菌液 之培養基中央。完成後，置入37℃培養箱中培養16 小時後，進 行判讀。對imipenem MIC的判讀標準，依循國際臨床實驗室標準 協會 (CLSI) 公佈之判定標準，大於16 μg/ml 即為抗藥性菌株。

鮑氏不動桿菌對tigecycline最低抑菌濃度的判讀標準依美國食品 藥物管理局建議對Enterobacteriaceae之判讀標準，≦2 μg/ml為感 受性。

2.4 瓊脂稀釋法（Agar dilution method）

瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入經熱融化並冷卻 至50℃左右的定量Mueller-Hinton agar (MH agar) 中，製作成含不 同抗菌藥物濃度的 agar plate，再接種測試細菌，培養16-20小時

後，觀察細菌生長情況，可以抑制細菌生長的 agar plate 中的最 低藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。本法的優點是可在一個 平板上同時進行多株細菌的MIC測定，結果可靠；缺點是製作含 抗菌藥物的 agar plate 費時費力。

2.4.1 培養基製備：

使用MH agar，按商品說明書進行配製，pH 7.2~7.4。

2.4.2 含藥瓊脂平板製備：

根據實驗設計，將已經倍數稀釋的不同濃度的imipenem ( U.S. Pharmacopeia ) 分別加入已加熱溶解，並在45~50℃水 浴中平衡的MH agar 中，充分混混合均勻後傾倒於經過滅菌 的培養皿，agar 厚度為3~4 mm。調製成含imipenem濃度為1 μg/ml， 2 μg/ml， 4 μg/ml，8 μg/ml，16 μg/ml，32 μg/ml，

64 μg/ml，128 μg/ml，及 256 μg/ml的agar plate。

2.4.3 細菌溶液製備與接種：

製備濃度相當於0.5 McFarland 標準的細菌懸浮液，再1：

10稀釋，以多點接種器（Denley Multipoint Inoculator）吸取 製備好菌液（約1~2 μl）接種於含不同 imipenem 濃度的 agar plate，每點菌數約為10⁴ CFU，形成直徑為5~8 mm的菌斑。接 種好後放置35℃培養箱中培養16~20小時，觀察結果。

2.4.4 結果判斷：

將 agar plate 放置於暗色、不會反光物體的表面判斷檢驗 結果。以能抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度

（MIC）。

3. 乙內醯胺酶等電點聚焦分析（Isoelectric focusing analysis)