中部某區域醫院抗carbapenem鮑氏不動桿菌抗藥性之分子生物學研究; Investigation of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates in a District Hospital in Taiwan

全文

(1)中國醫藥大學臨床醫學研究所. 碩士學位論文某區域醫院抗藥性 AB 菌之分生研究. 中國醫藥大學臨床學研究所碩士學位論文中部某區域醫院抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌抗藥性之分子生物學研究. Investigation of Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates in a District Hospital in Taiwan. 指導教授：吳禮字教. 授. 陳志銘中華民國九十七年七月. 研究生：. 陳志銘. 中華民國九十七年七月.

(2) Abstract The number of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates significantly increased in our hospital from 2002 to 2006. Twenty-eight clinical isolates of carbapenem-resistant A. baumannii were collected between January and September 2007. Isoelectric focusing and polymerase chain reaction (PCR) experiments were used for preliminary identification of the carbapenem-resistant β-lactamases. They were further identified by DNA sequencing. All of the isolates harbored blaOXA-66(100%) and twenty-six (92.9%) of the isolates were found to produce blaOXA-23. ISAba1 in upstream of blaOXA23 and blaOXA-66 were detected in 25 isolates and 28 isolates respectively. Typing of strains was performed using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), and 16 different genotypes were identified. Four clusters were identified and designated A, B, C and D according to the published interpretation criteria. Forteen isolates belonged to cluster A, and eight isolates belonged to cluster C. Our results indicate that the increase in the number of carbapenem-resistant β-lactamase-producing A. baumannii isolates in our hospital is due mainly to the dissemination of a cluster A epidemiologic strain with OXA-23 β-lactamase.. I.

(3) 中文摘要本院所分離之所有鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性從 2005 年之 2.6%上升到 2006 年的 29.6%。引起院內感染事件的鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性也從 2006 年的 36%上升到 2007 年的 58%。從 2007 年 01 月到 09 月，收集全院對 carbapenem 有抗藥性之鮑氏不動桿菌不重複菌株共 175 株。這 175 株細菌檢體來源的 6 成來自加護病房病人的呼吸道檢體，而且這 175 株細菌對其它常規檢驗之抗生素也多呈抗藥性，包括 ampicillin/sulbactam。隨機選取 175 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌中的 28 株進行後續研究，這 28 株中有 27 株為本院院內感染菌株。我們使用自動化微生物分析儀(Phoenix)進行最低抑菌濃度(MIC)之測試，結果顯示除 colistin 有 100%感受性(MIC 範圍 0.5-1 μg/ml)，其餘藥物之抗藥性皆超過 90%。使用等電點聚焦法及聚合酶鏈鎖反應法鑑別引起 carbapenem 抗藥性的乙內醯胺酶，之後依據 DNA 序列進一步確認乙內醯胺酶種類，發現所有 28 隻對 carbapenem 有抗藥性之鮑氏不動桿菌都具有 blaOXA-66(100%)，26 隻菌株具有 blaOXA-23（92.9%）。ISAba1 分別在 25 株具有 blaOXA-23 及 28 株具有 blaOXA-66 基因的上游被發現。另外取 8 株對 imipenem 具感受性之鮑氏不動桿菌，發現各有 6 隻菌株具有 blaOXA-23 或 blaOXA-66，在這些對 imipenem 具感受性之鮑氏不動桿菌中，只有一株細菌 blaOXA-23 前有. II.

(4) ISAba1 存在，有五株細菌 blaOXA-66 前有 ISAba1 存在，blaOXA-23 上游 ISAba1 存在情形在對 imipenem 具感受性及不具感受性兩者之間有明顯差異。我們將 28 株對 imipenem 不具感受性之鮑氏不動桿菌菌株使用脈衝式膠體電泳法進行基因分型，總共有 16 個基因分型。依據 Bionumeric 軟體的分析結果，可將這些菌株分成 4 個群集。其中 cluster A 有 14 株（50%），cluster C 有 8 株 (28.6%)。我們的研究結果顯示具有 carbapenem 抗藥性的鮑氏不動桿菌正在本院增加中，這些鮑氏不動桿菌多同時能產生 OXA-23 及 OXA-66，而且 blaOXA-23 前有也都有 ISAba1 存在。在本院流行對 imipenem 具抗藥性之鮑氏不動桿菌主要是 cluster A 及 cluster C 兩個流行菌株所組成。. III.

(5) 致謝. 這篇論文能順利完成，在這過程中需要感謝的人太多，先是有人鼓勵我要再進修，接著需要有醫院的許可及家人的支持，相關實驗的進行也多仰賴柏言、依婷、小牛等人協助進行。也要謝謝楊翠青老師及盧敏吉老師擔任口試委員並提供許多寶貴意見，改善論文缺失。還要特別謝謝指導教授吳禮字老師耐心的教導。也感謝疾病管制局第三分局邱乾順博士及佑雯協助相關PFGE的操作及判讀的指導及協助。二年時間雖然很短，但讓我學到不少東西。要謝謝的人太多了，無法一一列出，僅在此以本論文謝謝所有幫助過我的人。. IV.

(6) 目錄英文摘要 ---------------------------------------------------------------------------I 中文摘要 --------------------------------------------------------------------------II 致謝 ------------------------------------------------------------------------------ IV 目錄 ------------------------------------------------------------------------------- V 表目錄 ------------------------------------------------------------------------- VIII 圖目錄 ---------------------------------------------------------------------------- X 第一章前言 ---------------------------------------------------------------------- 1 第一節研究背景 ----------------------------------------------------- 1 1.1. 鮑氏不動桿菌簡介 --------------------------------------- 1. 1.2. 抗生素之簡介 ---------------------------------------------2. 1.3. 乙內醯胺類(β-lactam)抗生素--------------------------- 5. 1.4. 細菌抗藥性機制 ------------------------------------------ 6. 1.5. 乙內醯胺酶的介紹 --------------------------------------- 9. 1.6. Oxacillinase 簡介-----------------------------------------12. 第二節研究目的 ----------------------------------------------------13 第二章材料方法 ---------------------------------------------------------------14 第一節研究材料-----------------------------------------------------14 第二節研究設計-----------------------------------------------------15. V.

(7) 1. 菌株來源 -------------------------------------------------15 2. 抗生素敏感性試驗 -------------------------------------15 3. 乙內醯胺酶等電點聚焦分析 -------------------------20 4. DNA 分析------------------------------------------------24 5. 聚合酶鏈鎖反應 ----------------------------------------28 6. 定序與序列比對 ----------------------------------------29 7. 脈衝式膠體電泳 ----------------------------------------30 第三章研究結果 ---------------------------------------------------------------34 第一節鮑氏不動桿菌抗藥性的持續上升-----------------------36 第二節多重抗藥性之鮑氏不動桿菌-----------------------------37 第三節具有 OXA-23 及 OXA-66 之鮑氏不動桿菌-----------38 第四節 ISAba1 存在鮑氏不動桿菌 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游 ----------------------------------------------------------------38 第五節兩個主要鮑氏不動桿菌流行菌株-----------------------38 第四章討論 ---------------------------------------------------------------------40 第一節持續上升之抗藥性-----------------------------------------40 第二節多重抗藥性鮑氏不動桿菌--------------------------------41 第三節具有 OXA-23 及 OXA-66 之鮑氏不動桿菌-----------43 第四節同時存在 OXA-23 及 OXA-66 乙內醯胺酶-----------44. VI.

(8) 第五節 ISAba1 存在鮑氏不動桿菌 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游 ----------------------------------------------------------------45 第六節兩個主要的流行菌株--------------------------------------48 第七節研究限制-----------------------------------------------------48 第五章結論與建議 ------------------------------------------------------------51 第一節結論 ----------------------------------------------------------51 第二節建議 ----------------------------------------------------------53 參考文獻 ------------------------------------------------------------------------ 54 圖 ----------------------------------------------------------------------------------58 表 ----------------------------------------------------------------------------------60 附錄 -------------------------------------------------------------------------------73. VII.

(9) 圖目錄圖1：童綜合醫院2003到2007年鮑氏不動桿菌對impenem的抗藥性 -58 圖2：28株抗imipenem鮑氏不動桿菌AscI PFGE分型結果--------------59. VIII.

(10) 表目錄表 1：童綜合醫院 2002 到 2007 年鮑氏不動桿菌抗 imipenem 的比率 ------------------------------------------------------------------------60 表2：童綜合醫院2007年01到09月全部476株鮑氏不動桿菌分離部位及抗生素感受性 ------------------------------------------------------61 表3：童綜合醫院2007年01到09月175株抗imipenem鮑氏不動桿菌的分離部位及抗生素感受性 ------------------------------------------62 表 4：童綜合醫院 2007 年 01 到 09 月 175 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌的病人所在單位與分離部位關係 ---------------------------63 表 5：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌分離病房單位之分佈 ---------64 表 6：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌分離檢體之類別 ---------------65 表 7：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌各類抗生素最低抑菌濃度 ---66 表 8：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌對 imipenem 及 tigecycline 之最低抑菌濃度之分佈 ------------------------------------------------67 表 9：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌等電點聚焦分析法之結果 ---68 表 10：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌 OXA-type carbapenemase 之分佈情形 ------------------------------------------------------------69 表 11：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌 ISAba1 存在 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游之情形 ---------------------------------------------------------70. IX.

(11) 表 12：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌 AscI PFGE 分型結果(I)-----71 表 13：28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌 AscI PFGE 分型結果(II)----72. X.

(12) 第一章. 前言. 第一節研究背景 1.1. 鮑氏不動桿菌簡介不動桿菌（Acinetobacter）菌屬為革蘭氏陰性球桿菌，非葡萄糖. 發酵。是人類的伺機性感染菌，其中以鮑氏不動桿菌最常見。此細菌可以在醫院外環境與醫院中的環境存活，例如：食物、盆裁、水、呼吸道與血液透析儀器等，甚至乾燥表面 (如人體皮膚)。這隻細菌也可以是人類口咽部之正常菌叢，但在健康人身上通常只少量存在。在住院中病患，尤其住在加護病房之病患，或接受過抗生素治療之病患，此菌可能大量繁殖，而造成病人生病。依2007年台灣疾病管制局有關全國加護病房院內感染致病菌統計資料，鮑氏不動桿菌已經超過綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）成為加護病房院內感染最常見之致病菌（未發表資料）。常見的感染部位包括呼吸道、泌尿道與手術傷口感染，也可以引起導管相關血流感染。因為鮑氏不動桿菌可以對多種類的抗生素具有抗藥性，甚至對先前最常使用來治療嚴重鮑氏不動桿菌感染抗生素—carbapenem類抗生素（例如：imipenem/cilastatin，meropenem）也產生一定比例之抗藥性，因此治療不動桿菌所引起的感染症，尤其是鮑氏不動桿菌，已成為全球醫療人員關注的課題。. 1.

(13) 在1994 年美國便發表過引起院內感染的抗carbapenem 鮑氏不動桿菌(CRAB) (Go et al. 1994)，到了1998 年，在台大醫院中所分離到的鮑氏不動桿菌對大部份常用抗生素都具有抗藥性，包括 cephalosporins 、azteonam 、aminoglycosides 和 ciprofloxacin，即所謂多重抗藥性鮑氏不動桿菌 (MDRAB) 。依台大醫院資料顯示，對 carbapenem產生抗藥性的鮑氏不動桿菌從1993年的5.58％上升到2000 年的21.5％，對所有常規測試藥物（不包括tigecycline及colistin）產生抗藥性的鮑氏不動桿菌從1998 年的0％上升到到2000年的6.5％ (附錄六)(Hsueh et al. 2002)。再根據2007年疾病管制局所收集之全國醫學中心及區域醫院引起加護病房院內感染之鮑氏不動桿菌，其對 carbapenem的抗藥性已經從2003年的15%上升到2007年約50%(未發表資料)。因此我們不得不正視此細菌抗藥性之快速散播及它臨床上的嚴重性。. 2.

(14) 1.2 抗生素之簡介抗生素是微生物的代謝產物，這種代謝產物會對其它微生物的生長與繁殖產生抑制作用。理想的抗微生物藥劑應具有選擇性毒性，即藥物應該只對微生物有害而不會傷害宿主。一般來說，這種毒性是相對的而不是絕對的，而理想的藥物應在宿主可忍受的濃度下可殺死致病微生物。抗生素可依作用機轉大致分為下列五類(Neu 1992)(附錄七、附錄八)： 1.2.1 抑制細菌細胞壁的合成：這類藥物有β-lactam類及glycopeptide類藥物。這類藥物會破壞細胞壁合成，使細菌缺乏堅固的細胞壁保護，導致在普通的張力環境下菌體破裂而死亡。 1.2.2 抑制細菌細胞膜功能這類藥物主要是在細胞膜造成孔洞，使細菌體內的離子外流，再進一步造成細菌死亡。 1.2.3 干擾細菌蛋白質的合成：例如，aminoglycosides及紅黴素類藥物。細菌擁有70S核糖體，而哺乳類的細胞為80S核糖體，這兩種核糖體的次單位、化學組成和其功能專一性均有很大的差別。而此類的藥物只能抑制. 3.

(15) 細菌的核糖體，對哺乳類細胞則無作用。 1.2.4 阻斷細菌核酸（DNA及RNA）合成此類藥物屬於quinolone類，可以對DNA gyrase （topoisomerase II）及topoisomerase IV有抑制作用，使DNA 無法進行複製。當被破壞的DNA累積到一定量度，就會引起細菌死亡。 1.2.5 影響細菌之新陳代謝此類藥物主要是磺胺類藥物，磺胺類藥物會跟對胺基苯甲酸 (Para-aminobenzoic acid，PABA)競爭dihydropteroate合成酶，進而抑制葉酸前驅物的合成，而達到抑菌作用。哺乳類動物葉酸需由外界攝取，不會合成葉酸，所以磺胺藥不干擾人體細胞。. 4.

(16) 1.3 乙內醯胺類 (β-lactam)抗生素乙內醯胺類抗生素為目前臨床上最常被使用之抗生素，其主要特徵含有三個C原子及一個N原子所構築而成之 heteroatomic ring structure。乙內醯胺類抗生素的作用機轉主要是藉由抑制細菌細胞壁的合成，達到殺菌的效果。乙內醯胺類抗生素包括青黴素 (penicillin)、頭孢子菌素 (cephalosporin)、oxacephems (如：flomoxef)、carbapenems (如：imipenem 及meropenem)和monobactams (如：aztreonam) 類抗生素。 Carbapenems類抗生素屬於廣效性乙內醯胺 (Broad spectrum β-lactam) 抗生素，如 imipenem、meropenem 及 ertapenem 等。 Imipenem 是 Streptomyces cattleya 的合成產物，能競爭 penicillin-binding proteins的結合位置，並抑制 transpeptidase 作用 (Hashizume et al. 1984)，進而抑制細菌細胞壁的合成，造成細菌的死亡。因為能治療鮑氏不動桿菌及P. aeruginosa的感染症，臨床上常用於治療嚴重的院內呼吸道感染或嚴重的腹腔內感染。. 5.

(17) 1.4 細菌抗藥性機制細菌抗藥性的產生可能由於菌體的染色體突變，或經基因傳遞（gene transfer）的方式由其它菌體獲得，由染色體突變所產生的抗藥性基因較不易散播至其它菌體。抗藥性基因可藉由幾種方式在細菌間傳遞，如：細菌間彼此交換染色體的DNA（transformation）、或藉由噬菌體（bacteriophage）將外界抗藥性基因帶入（transduction）、或由質體（plasmid）互相交換抗藥性基因（conjugation）、或藉跳躍基因（transposons）插入質體或染色體的DNA 序列以傳遞抗藥性基因 (Neu 1992)。當細菌獲得抗藥性基因後，經由抗生素的篩選壓力（antibiotics selecting pressure），將具抗生素敏感性的菌種殺死後，具抗藥性的菌種才會大量繁衍 (Dever and Dermody 1991; Neu 1992)。細菌產生抗藥機制主要有五 (Jacobs et al. 1994; Bush et al. 1995; Alekshun and Levy 2007)： 1.4.1 改變抗生素的通透性 (antibiotic permeability)：細菌會藉由關閉孔道以減少藥物自細胞膜的外通透 (permeability) 至菌體內以減少抗生素堆積。如大腸桿菌 (Escherichia coli) 可藉由外膜蛋白 (outer membrane protein, Omp) 負責細胞外與外膜間隙間物質的交換，大腸桿菌可藉由增加. 6.

(18) OmpC 並降低 OmpF 的表現而產生抗藥性(Nikaido 1994)。 1.4.2 改變抗生素作用分子之結構：被抗生素辨識的細菌成份，統稱為 target molecules。細菌可藉由改變target molecules 之結構，以改變其與抗生素間之親和力。如vancomycin-resistant enterococci 是利用降低 vancomycin 與 peptidoglycan的D-Ala-D-Ala terminus 的親和力以對 vancomycin 產生抗性(Mascini and Bonten 2005)。 1.4.3 將抗生素運送至菌體外：細菌發展出許多套主動運輸系統 (active efflux) 可將抗菌藥物輸出至體外，目前主要可分為五類(Kumar and Schweizer 2005)： 1.4.3.1 Major facilitator superfamily (MFS) ：通常是single-component pump，例如Staphylococcus aureus 的 NorA。有時候也會跟外膜蛋白（outer membrane protein）或膜融合蛋白（membrane fusion protein）一起作用，如E. coli 的EmrAB–TolC。 1.4.3.2 ATP-binding cassette (ABC) superfamily：這一類的transporter包含有uptake及efflux運送系統。細菌利用水解ATP所得到能量，運送糖份、氨基酸、離子、藥物、多醣體及蛋白質。很少細菌世界由此系統產生抗藥性。. 7.

(19) 1.4.3.3 Small multidrug resistance (SMR) family：由於體積相對較小，大約110氨基酸及4個穿膜片段 (transmembrane segment)，通常會形成3或4聯體一起作用，如 S. aureus 的 Smr 及 E. coli 的 EmrE pump 系統。 1.4.3.4 Resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily: 編碼基因通常位在染色體上，在格蘭氏陰性細菌的抗藥性扮演重要角色。如E. coli 的AcrAB-TolC 系統及綠膿桿菌的 MexAB-OprM系統可將β-lactams 輸出菌體外。 1.4.3.5 Multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family: ＋. 長度大約450個氨基酸，包括12個穿膜片段。使用Na 濃度梯度當作能量來源，用來排出染料及fluoroquinolone類藥物。如Vibrio parahaemolyticus的NorM 及 E. coli的YdhE2. 1.4.4 改變菌體之代謝途徑以補償遭藥物攻擊的代謝路徑。 1.4.5 產生酵素將藥物分解：細菌會分泌酵素直接破壞抗生素，例如: 乙內醯胺酶。格蘭氏陰性細菌對乙內醯胺類藥物產生抗藥性主要原因即是藉著乙內醯胺酶的產生。. 8.

(20) 1.5 乙內醯胺酶的介紹細菌產生的乙內醯胺酶，有部分在抗生素使用前便存在，主要是細菌用以破壞環境黴菌所釋放的乙內醯胺，以利本身生存。乙內醯胺酶可藉由與乙內醯胺環形成非共價鍵的結合，再乙醯基化（acylation）的作用將乙內醯胺環打斷，最後水解（hydrolysis）釋放出被去活化的乙內醯胺抗生素結構，使抗生素失效。乙內醯胺酶是細菌分解乙內醯胺類抗生素結構最重要的酵素(Hayes and Wolf 1990)。乙內醯胺酶的分類主要根據其功能性分 (functional classification)，或分子層次之分類(molecular classification) 將乙內醯胺酶加以區分。Ambler (Ambler 1980)根據基因所在位置與胺基酸序列一致區域，將乙內醯胺酶分為四類。Class A、C和D屬於 active-site serine-β-lactamases，其酵素活性中心都具有 serine residue，利用此胺基酸與抗生素共價結合以分解抗生素。而 Class B 屬於metallo-β -lactamases，需要鋅離子的活化(Fisher et al. 1980)。 1.5.1 Class-A 的乙內醯胺酶：基因位於染色體或質體上，為 serine-β-lactamases 中最大的一群，屬於penicillinases，具有分解penicillin類藥物的能力，此類乙內醯胺酶不論在序列或結構上皆與penicillin-binding protein ( PBP )極為相似(Tipper and Strominger 1965; Massova and. 9.

(21) Mobashery 1998)。 1.5.2 Class-B 的乙內醯胺酶：基因位於染色體上，屬於 metallo-β-lactamases (MBLs)，需要一個催化的鋅原子( catalytic zine atom )存在才具有酵素活性，但其他二價離子亦可調控 metallo-β-lactamases 的活化，且其活性受 EDTA 抑制 (Naas and Nordmann 1994)。在1967 年於 Bacillus cereus 的染色體中被發現(Bicknell et al. 1983)，對廣效性乙內醯胺類抗生素，如第三或第四代的頭孢子素、carbapenem及其他乙內醯胺酶抑制劑/乙內醯胺類抗生素的組合具有耐受性 (tolerance)如。IMP family、VIM family 及 GIM-1、SPM-1 等 carbapenemases 皆屬於class B β-lactamases。 1.5.3 Class-C 的乙內醯胺酶：基因位於染色體上，屬於頭孢子素酶（cephalosporinases），此類酵素均為誘導型，多發生於革蘭氏陰性桿菌，有chromosomal及 plasmid-encoded。第三代頭孢子素原本被使用於治療 β-lactamase-producing 的病原菌，但從1980年代以後，臨床上已發現有 β-lactamase producing的病原菌可對第三代頭孢子素(如 ceftazidime、cefotaxime 、cefepime 及ceftriaxone)及 monobactams(如aztreonam) 具有抗性，以 AmpC enzymes 最為常 10.

(22) 見。 1.5.4 Class-D 的乙內醯胺酶：基因位於質體上，屬於 oxacillinases，具有分解青黴素類 5-methyl-3-phenylisoxazole-4-carboxy側鏈的能力。以OXA-type乙內醯胺酶為主。. 11.

(23) 1.6 Oxacillinase簡介 Carbapenem不會被一般D類β-lactamases所水解，但是部分不動桿菌屬菌株已經產生能水解carbapenem類藥物之oxacillinase，其中有些 oxacillinase已經被定序(sequenced)，證實為D類酵素。這些酵素包括，蘇格蘭的OXA-23來自，西班牙的O XA-24，-25，OXA-26來自比利時， OXA-27來自新加坡。陸續還有一些具有carbapenemase活性的OXA酵素也從世界各國的不動桿菌分離出來(盧孝國、黃玉成 2000)。一般來說單獨只有OXA的基因存在的情形下，oxacillinase產生的量不足以使細菌對carbapenem類藥物產生抗藥性。但若OXA基因上游存在有ISAba1，則oxacillinase的表現量會大幅上升，並進而使細菌對 carbapenem類藥物產生抗藥性(Turton et al. 2006)。目前此類酵素被分為8個次群體，第一群屬於OXA-23類，包括有 OXA-27及OXA-49。第二群包括有OXA-24、-25、-26、-40、及-72。第三群主要屬於OXA-51類。第四群則只有OXA-58。第五群是位在染色體上的OXA-55及Shewanella algae的OXA-SHE(AY066004)。第六群包括從K. pneumoniae質體上發現的OXA-48及Shewanella oneidensis染色體上發現的OXA-54。第七及第八分群分別由綠膿桿菌的OXA-50 及Ralstonia pickettii的OXA-60所代表(Walther-Rasmussen and Hoiby 2006)。. 12.

(24) 第二節研究目的鮑氏不動桿菌已經佔加護病房院內感染致病菌排名的第一名，而且對carbapenem的抗藥性已經到達約50%，我們必須正視這個問題。了解鮑氏不動桿菌的抗藥性機轉，將有助於我們治療上的藥物選擇，及避免抗藥性菌種的進一步散播。由具有OXA-type抗carbapenemase鮑氏不動桿菌引起之群聚感染事件已經被報導過(Dalla-Costa et al. 2003; Giordano et al. 2007)，但在台灣相關的報告則仍有限(Hu et al. 2007)。本院全院抗carbapenemase 鮑氏不動桿菌的出現比率從2002年的2.2%上升到2006年的29.6%(表 2，圖3)，呈現顯著的上升比率，在引起院內感染的致病菌方面抗 carbapenemase鮑氏不動桿菌也呈現同樣上升比率，從2006年的36%上升到2007年的58.2%。因此我們收集本院2007年所分離得到的抗 carbapenemase鮑氏不動桿菌，進行有關乙內醯胺酶，尤其是OXA-type carbapenemase的研究，以了解在台灣醫院中鮑氏不動桿菌所產生的 OXA-type carbapenemase對carbapenem抗藥性所扮演的角色，並了解 ISAba1在台灣鮑氏不動桿菌的分布情形。. 13.

(25) 第二章材料方法第一節研究材料 1. 培養基本實驗所使用的培養基，如附錄一。 2. 試劑與緩衝溶液本實驗所使用的試劑與緩衝溶液，如附錄二。 3. 藥品及酵素所有化學藥劑均購於 Merck、Sigma或 U.S. Pharmacopeia 公司，菌種培養基所使用的藥物購自 Difco 或 Accumedia。抗生素紙條購自 AB BIODISK。 4. PFGE 配製藥品，如附錄三 5. PFGE Plug Washing by Peristaltic Pump Method，如附錄四 6. 引子：本實驗所使用的引子，如附錄五。. 14.

(26) 第二節研究設計 1.菌株來源 1.1 菌株收集本實驗使用的鮑氏不動桿菌菌株分別收集自2007年1月至9月期間，童綜合醫院之病患檢體，經一般檢驗室生化檢驗和API 20E ( BioMerieux, Marcy 1 Etoile, France ) 等方法鑑定為鮑氏不動桿菌菌種。 1.2 菌種的培養與保存菌種之保存是將單一菌落接種於 4 ml 的Luria-Bertani (LB) 液態培養基中，於 37℃ 培養箱以 250 rpm 震盪培養隔夜後，將新鮮培養的菌液（OD600 = 0.8~1.0）與 30% 的甘油溶液 1：1 等體積比例混合均勻，儲存於 -80°C。. 2. 抗生素敏感性試驗抗藥性的偵測可由表現型和基因型的方法進行。一般臨床微生物實驗室測試抗藥性表現型最常用的方法有兩種；一個是定性型之抗生素紙錠擴散方法 (disk diffusion)，測量抑制環的大小，另一個是定量型之稀釋方法 (broth or agar dilution)，測量抗生素最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration; MIC)。基因型的. 15.

(27) 測試是在偵測細菌是否具有抗藥機制，如抗藥基因 (resistance gene)，或藥物作用目標之基因突變 (target mutation)。大多數國家所採用表現型的測試方法及抗生素藥物敏感性之判斷是依據美國臨床檢驗室標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 所設定之準則，來決定所測試菌株對不同抗生素之敏感性，包含感受性(susceptible)，中間性 (intermediate)，及抗藥性 (resistant) 之臨床指標 (clinical breakpoint)，其目的是用來預測用藥後之臨床結果。但臨床指標不包含感受性降低。感受性降低是最近幾年來逐漸在被重視的一個微生物指標 (microbiological breakpoint)，其目的是用來指認出用臨床指標判斷仍為感受性，但已具有抗藥機制之細菌。敏感性試驗的方法包括以下： 2.1 瓊脂紙錠擴散試驗將單一菌落接種於 4 ml 的 LB 液態培養基中，於 37℃ 培養箱震盪培養隔夜後，將菌液濃度調至 0.5 McFarland (1.5×108 CFU/ml )，以棉花棒沾菌作四方向均勻塗抹在 Mueller-Hinton Agar，再將含有抗生素的圓型紙錠平放在 agar 上，37°C下培養 16~18 小時，以尺量抑制環大小對照 CLSI 判讀。抗生素紙錠抑制圈判讀依據美國國家臨床實驗室標準委員會所建議的抗生素. 16.

(28) 敏感性試驗判讀標準為依據，如鮑氏不動桿菌對 imipenem 10 μg 紙錠抑制圈直徑 ≧16 mm 為感受性，14~15 mm 為 intermediate，≦ 13mm 為抗藥性。 2.2 自動化微生物分析儀敏感性測試將菌株次培養之後，交由芮弗士醫事檢驗所，使用該公司之 Phoenix 自動化微生物分析儀 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 進行再一次之鑑定及敏感性測試（版本 V5.15A/V4.31A）。簡要作法如下：將菌株從冷凍庫中取出，接種於含有 5% sheep 紅血球的 Colombia agar，於37℃進行培養16～24小時。之後將細菌調成0.5 McFarland 濃度，在30分鐘內到入測試盤，在倒入測試盤的30分鐘內放進機器進行鑑定及敏感性測試。測試標準依照CLSI對最低抑菌濃度（MIC）之判讀標準，如鮑氏不動桿菌對imipenem之MIC ≦4 μg/ml為感受性，8 μg/ml為中間性，≧16 μg/ml為抗藥性。 2.3 E-test 最低抑菌抗生素濃度以E-test之方法來加以實驗分析28株對imipenem有抗藥性鮑氏不動桿菌菌株對imipenem及tigecycline之最低抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration，MIC) 之數值，藉以更加了解各菌株對imipenem之抗藥程度及carbapenem-resistant 鮑氏不動. 17.

(29) 桿菌對新抗生素tigecycline之感受性。. 首先，製作Mueller Hinton Agar (MHA)(DIFCO) 培養基，與分裝每管2 毫升之Mueller Hinton Broth (MHB)(DIFCO) 液體培養基。挖取適量菌量之菌落接種於2毫升MHB 液體培養基中，置入37℃培養箱中100 rpm 振盪培養30 分鐘後，再以MHB 稀釋適量濃度 (OD550=0.3) 之菌液。再以無菌棉棒沾取菌液均勻塗於MHA 培養基中，並以鑷子夾取 imipenem 及 tigecycline 的 E-test 最低抑菌抗生素濃度條 (AB Bio Disk) 貼於塗完菌液之培養基中央。完成後，置入37℃培養箱中培養16 小時後，進行判讀。對imipenem MIC的判讀標準，依循國際臨床實驗室標準協會 (CLSI) 公佈之判定標準，大於16 μg/ml 即為抗藥性菌株。鮑氏不動桿菌對tigecycline最低抑菌濃度的判讀標準依美國食品藥物管理局建議對Enterobacteriaceae之判讀標準，≦2 μg/ml為感受性。. 2.4 瓊脂稀釋法（Agar dilution method）瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入經熱融化並冷卻至50℃左右的定量Mueller-Hinton agar (MH agar) 中，製作成含不同抗菌藥物濃度的 agar plate，再接種測試細菌，培養16-20小時 18.

(30) 後，觀察細菌生長情況，可以抑制細菌生長的 agar plate 中的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。本法的優點是可在一個平板上同時進行多株細菌的MIC測定，結果可靠；缺點是製作含抗菌藥物的 agar plate 費時費力。 2.4.1 培養基製備：使用MH agar，按商品說明書進行配製，pH 7.2~7.4。 2.4.2 含藥瓊脂平板製備：根據實驗設計，將已經倍數稀釋的不同濃度的imipenem ( U.S. Pharmacopeia ) 分別加入已加熱溶解，並在45~50℃水浴中平衡的MH agar 中，充分混混合均勻後傾倒於經過滅菌的培養皿，agar 厚度為3~4 mm。調製成含imipenem濃度為1 μg/ml， 2 μg/ml， 4 μg/ml，8 μg/ml，16 μg/ml，32 μg/ml， 64 μg/ml，128 μg/ml，及 256 μg/ml的agar plate。 2.4.3 細菌溶液製備與接種：製備濃度相當於0.5 McFarland 標準的細菌懸浮液，再1： 10稀釋，以多點接種器（Denley Multipoint Inoculator）吸取製備好菌液（約1~2 μl）接種於含不同 imipenem 濃度的 agar plate，每點菌數約為104 CFU，形成直徑為5~8 mm的菌斑。接種好後放置35℃培養箱中培養16~20小時，觀察結果。. 19.

(31) 2.4.4 結果判斷：將 agar plate 放置於暗色、不會反光物體的表面判斷檢驗結果。以能抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。 3. 乙內醯胺酶等電點聚焦分析（Isoelectric focusing analysis) 3.1 原理氨基酸為兩性物質，至少含有一個酸基（carboxyl）及一個鹼基（α-amino）。這些游離的基團在pH變化時，可因為釋出或接收質子而可呈現酸或鹼性。因此氨基酸可以以帶有正電荷（cation）、負電荷（anion），或兩性離子（zwitterion）等三種狀態存在。若氨基酸在某一pH值下其淨電荷為零，其在電場中將不移動，此pH值為它的pI值（等電點）。也因為淨電荷為零，淨電斥力不存在，大部份蛋白質於pI值的環境下，溶解度會最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，蛋白質分子所帶淨電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會凝結。因此，將pH調到等電點的大小，大部份的蛋白質會沉澱。利用這種現象，我們可以估算某蛋白質的等電點；另一方面，也可以應用在電泳，達到分離蛋白質混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric focusing），簡稱為. 20.

(32) IEF。萃取細菌之乙內醯胺酶進行電泳，電泳結束後再利用 nitrocefin 為受質來呈色，並量測距離 (Bush and Singer, 1989)。最後根據一些已知 pI 值 (等電點) 的乙內醯胺酶為標準值，畫出回歸曲線，求得新測距離之對應pI 值。再根據已發表文獻各個乙內醯胺酶之 pI 值可判斷可能的乙內醯胺酶種類 (van Loon et al., 2004)。等電點聚焦會因為酵素在膠片上電泳時可能受到干擾，移動的位置或回歸曲線計算結果會有誤差，因此等電點值只能供參考，遺傳物質需靠聚合酶連鎖反應與 DNA 定序才能確認。 3.2 乙內醯胺酶粗萃取液製備將單一菌落接種於10 ml LB 培養液 (添加抗生素CTX，5 μl /ml )中37 ℃隔夜培養後，取0.5 ml 菌液加上9.5 ml LB 置於37℃培養箱4 小時，將菌液以2800 rpm、15 分鐘離心，去除上清液。加入 250 μl的 0.2 M、pH 5.5 的sodium citrate (清洗雜質) 及250 μl 的dd H2O ，最後取500 μl 置於新的 eppendoff，即為細菌懸浮液。將細菌懸浮液置於冰上，並以 14 μm 超音波震盪器將菌體打碎後，以 12000rpm、4℃，離心 5 分鐘，目的為將打碎後的菌體使之沉澱，取上清液即為乙內. 21.

(33) 醯胺酶粗萃取液 (Bush and Singer, 1989)。 3.3 乙內醯胺酶含量測試將 2 μl 的0.5 mM nitrocefin （Oxoid）滴入 96 well 的 microplate 中，取 2 μl 乙內醯胺酶粗萃取液使之混合，每 5 秒觀察呈色反應，如 5 秒內立即呈色，則跑等電點聚焦電泳時，乙內醯胺酶粗萃取液取 2 μl 即可；如 5 秒內無呈色反應，再加入 2 μl 乙內醯胺酶粗萃取液，觀察呈色反應，以此類推。而跑等電點聚焦電泳時，乙內醯胺酶粗萃取液量取總和。 3.4 等電點聚焦電泳（isoelectric focusing）先將電泳槽（Pharmacia Biotech Multiphor Ⅱ）預冷，維持 16℃，在電泳槽中央滴上適量的礦物油，均勻塗抹後將膠片放上，膠片完全服貼在電泳槽表面，不可有氣泡。將陰極電極條以 1 M NaOH潤濕，陽極電極條以 1 M H3PO4 潤濕後分別置於膠片上下兩端。取適量的乙內醯胺酶粗萃取液滴於膠片 precast polyacrylamide gel（Amersham Biosciences）上，架上電極，使電極與電極條接觸，打開電源供應器（Pharmacia Biotech）調至 1500 伏特、50 安培、25瓦，進行電泳 90 分鐘。. 22.

(34) 3.5 呈色反應將 0.5mM nitrocefin 與無菌水稀釋後滴入空的無菌培養皿中，將拭鏡紙對摺後置入培養皿中使其潤濕，再將拭鏡紙打開攤平在IEF膠片上，觀察粉紅色形成位置 (Matthew et al., 1979) 。利用一些已知 pI 值的乙內醯胺酶作為標準值，將膠片上所測得的粉紅色公分數，使用 Microsoft EXCEL 2003 software 將其換算成 pI 值。實驗中所使用已知 pI 值的乙內醯胺酶分別如下：TEM-1（pI 5.4），CTX-M-3（pI 8.4）， TEM-4 （pI 5.9）， SHV-2（pI 7.6）， SHV-5（pI 8.2）， CTX-M-14 （pI 7.9）。 3.6 比對各種pI值依據前述方法所得到的pI值跟文獻所報告過的各個乙內醯胺酶的pI 值進行比較，可以判斷可能的乙內醯胺酶種類。等電點聚焦會因為酵素在膠片上電泳時可能受到干擾，移動的位置或回歸曲線計算結果會有誤差，因此等電點值只能供參考，遺傳物質需靠聚合酶連鎖反應與 DNA 定序才能確認。. 23.

(35) 4. DNA 分析 4.1 小量質體 DNA 之抽取使用 GeneMark （Taiwan）的 Plasmid Miniprep Purification Kit進行DNA純化。挑取生長於平板培養基上的單一菌落至4 ml 的 LB 培養液中，於 37℃ 培養箱震盪培養約 16 小時。取1.5 ml 菌液至微量離心管中，以室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘沉澱菌體，去除上清液後再加入 1.5 ml 的菌液，重複上述步驟。加入冰的 200 μl solution I(GeneMark，Taiwan)，劇烈震盪使菌體能完全打散並均勻懸浮，再加入 200 μl Solution II (GeneMark，Taiwan)，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動5 次，不可振盪 (Do not vortex)，置於室溫 5 分鐘。再加入200 μl Solution III，亦溫和地上下混合搖勻五次，於室溫12,000 rpm 離心 5 分鐘，將 spin column 置入 collection tube 並吸取上清液至 column 中，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去下層液。加入700 μl Washing solution內含酒精(W9)，置於室溫 1 分鐘，以12,000 rpm離心 1 分鐘，倒去下層液。加入 700μl Wash Buffer 內含酒精(W9) ，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去下層液；再離心3分鐘，確定酒精完全移除。將 Elution. 24.

(36) solution 事先在65~70℃ 預熱，並將spin column 移至新的微量離心管上，加入 30 μl 預熱好的 Elution solution，置於室溫1 分鐘，以 12,000 rpm 離心2 分鐘將ＤＮＡ收集下來，置於 -20 ℃ 備用。 4.2 染色體 DNA 之抽取使用GeneMark （Taiwan）的 Genomic DNA Purification Kit 進行染色體DNA純化。實驗進行前，先以1.1ml的無菌水將proteinase K 溶解並儲存於-20℃。取5 ml 菌液至微量離心管中，以室溫 12,000 rpm 離心 2 分鐘沉澱菌體，以700 μl Extraction Solution resuspend bacterial pellet，加入20 μl proteinase K stock solution，溫和的震盪混合。置於56℃之水浴槽(water-bath)或培養箱（incubator） 3小時。再加入 700 μl Binding Solution，震盪混合均勻，繼續置於56℃反應，直至細胞完全分解。將溶液過spin column，將 spin column 置入 collection tube，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去下層液。加入700 μl Washing solution 清洗三次，置於室溫 1 分鐘，以12,000 rpm離心 1 分鐘，倒去下層液。以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，確定酒精完全移除。丟棄collect tube，將column置入新的1.5 ml離心管，加入預熱60-70℃之. 25.

(37) Elution solution，置於室溫1 分鐘，以 12,000 rpm 離心1分鐘將ＤＮＡ收集下來，置於 -20 ℃ 備用。 4.3 洋菜膠體電泳分析 (Agarose gel electrophoresis) 取洋菜粉 (Agarose) 加熱溶於0.5 倍的 TAE 電泳緩衝溶液中，配置成１%的膠體後，待膠體冷卻至 50~60℃ 時，倒入鑄膠槽中並插入齒梳 (comb)。待洋菜膠體冷卻凝固後，拔掉comb，將膠體置於水平電泳槽內，倒入 0.5 倍的 TAE 電泳緩衝溶液。將樣品DNA 與1/6 體積的 6 倍的 loading dye 混合均勻後，加入1% 膠體之溝槽(well) 中，並於同一片膠體的另一溝槽中注入適量之 DNA marker(約100 ng) 以茲對照。以 50 或 100 伏特經通電適量時間後，取出膠體，將其浸泡於含 0.5 μg /ml ethidium bromide (EtBr) 之水溶液中，（核酸在膠體中可經 ethidium bromide (EtBr) 染色， EtBr 會嵌入核酸鹼基中，以紫外線照射，則核酸吸收紫外線波長的光線，再經 EtBr放出可見波長的光線，藉以觀察核酸的位置）。浸泡待十分鐘後，取出膠體並置於 UV 透射光源板上觀察並拍照存檔。可藉由與 DNA marker 已知的片段大小進行比較，推算出樣品中的 DNA 片段的量與分子大小。. 26.

(38) 4.4 限制酶切割與DNA之回收取適量純化好的質體或染色體DNA置於1.5ml的微量離心管中，利用限制酶可辨認特定序列的特性，將 DNA與所需要的一至兩種限制酶及合適的限制酶緩衝液混合，加入1 μl 的 10倍酵素反應緩衝液 (TaKaRa)32 和 1 μl 的限制酶酵素 (TaKaRa)後，加入無菌水至 10 μl，於 37℃或其他適當的溫度進行切割反應。反應後，即可做電泳分析，將 1%瓊脂 (agarose) 凝膠與 1 倍的 TAE 溶液 (40 mM Tris-acetate，1 mM EDTA) 置於電泳槽中，將切割完的質體與染劑 (30% glycerol，0.25% bromophenol blue，0.25% xylene cyanol) 混合均勻，注入1% 的瓊脂凝膠的凹槽中，並以 1 kb DNA ladder (MDBio,Inc.) 作為標準分子量的依據，在電壓 100 Volt 的狀態下分離 DNA，當下層的染劑 (bromophenol blue) 到達距凝膠底部約 0.5 ~ 1 公分時，便可停止分離。在使用 ethidium bromide 進行染色後可於長波 UV 光下觀察DNA 片段，利用刀片將含有所要 DNA 片段連同瓊脂凝膠切下，放入微量離心管中，準備進行 DNA 片段的回收。使用 Viogene Gel-M gel extraction system (Cat. EG-1001) 回收DNA 片段。首先加入 0.5 ml 的 GEX buffer，在 60℃ 下放置 10 分鐘，讓瓊. 27.

(39) 脂凝膠溶解，之後將溶液加入 column 之中，以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒除過濾液，然後在 column 中加入 0.5 ml 的 WF buffer 後以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒除過濾液。接下來加入 0.7 ml的 WS buffer，以 10,000 Xg 離心 30 秒，倒除過濾液後再離心 3 分鐘風乾。將 column 置入一新的微量離心管，加入 30 μl 的無菌水在室溫下靜置 1 分鐘以溶 DNA，最後以 10,000 Xg 離心 1 ~ 2 分鐘後即可得含有 DNA 片段的水溶液，存於 -20 ℃備用。. 5. 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction; PCR)：首先取 2μl 的質體或染色體 DNA 加入微量離心管，再加入適當的引子各1 μl（20 mM），加入 38.1 μl 無菌水， 5 μl 10X PCR Buffer，1.5μl 50mM MgCl2，1μl dNTP 和 0.4 μl Tag DNA Polymerase （Invitrogen, Brazil; 或 Genet Bio, Korea），總體積為 50μl。蓋上微量離心管蓋子，均勻混合後，6000 rpm 離心 20 秒。將微量離心管置入 Applied Biosystems 2720中進行反應。反應條件為 94 ℃, 5 分鐘 1 個循環，94 ℃, 30秒、55 ℃ 45秒、 72℃ 30秒，共 30 個循環，最後為 72 ℃ 10 分鐘。反應結束後，取PCR 產物 5 μl 混合 1 μl 的 6X dye，均勻混合後，取 5 μl. 28.

(40) 至洋菜膠體齒槽中，以 50-100V 的電壓進行電泳後以 EtBr 染色， 25 分鐘後以 UV 光激發，拍照觀察。我們使用附錄5所列的primer，OXA-23、 OXA-51-like、 OXA-24-like、 OXA-58-like、 SIM-1、 IMP-type、VIM-type 各種乙內醯胺酶基因及ISAba1插入序列的存在與否。ISAba1與 blaOXA-23及blaOXA-66的位置圖見附錄九。. 6. 定序與序列比對將分離的純化質體 DNA，送交明新生物科技公司進行自動基因定序。後將所得之基因序列輸入至美國National Center for Biotechnology Information (NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 網站比對。比對之步驟，先進入NCBI 首頁，點選進入BLAST 之 “Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)”選項，再點選“Nucleotide” 之比對選項，輸入欲比對之核苷酸序列，即可迅速確認出抗藥基因之種類( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ). 29.

(41) 7. 脈衝式膠體電泳 (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 7.1 菌體包埋與細菌溶解首先開啟水浴槽，設定溫度在56℃，並配製菌體包埋用瓊脂(1% SeaKemGold (SKG) agarose in TE buffer)置於56℃水浴槽備用。取適量之菌落與400 μl cell suspecsion buffer，再取400 μl 1.0％洋菜膠體溶液與菌液混合，再吸取 100 μl 混合菌液注入製膠模型中，待靜置4℃下15 分鐘使包埋有菌體之膠片 (plug) 凝固。將凝固好之包埋菌體膠片從模具中取出，並置入5 ml Lysis solution (1M Tris – HCl、0.5M EDTA、0.006M NaCl、1.0% sodium lauroyl sarcosine( SLS ) ) 加 25 μl proteinase K 溶液，置入56℃培養箱振盪處理2小時，使破壞細胞膜讓DNA 釋出。 7.2 膠塊清洗使用半自動清洗方式：清洗程式如附錄四。 7.3 限制酵素消化切割（Restriction Digestion）先以70%酒精消毒單側刃之刀片及膠體切割台後，取出清洗好的膠塊（包括PFGE分析用標準marker菌株H9812的Plug 在內）切出一寬2 mm X 長10mm之細長狀膠條(slices)，放入裝有200 μl限制酵素專用緩衝液的1.5ml微量離心管中，置在 30.

(42) 室溫下5-10分鐘。移除上述緩衝溶液，再加入200 μl已含有酵素AscI(10 units)的限制酵素專用緩衝液，放置37℃水浴槽2小時。之後取出酵素專用緩衝液，置換成200 μl的0.5 x TBE緩衝液。 7.4 電泳操作流程配置2400 ml的.XTris-Borate EDTA（TBE）緩衝液[10X TBE溶液 120 ml＋ 2280 ml 二次水（D.D.W.）]；取其中150 ml與1.5g SKG agarose加熱溶製成1%電泳用膠，置於56℃水浴槽備用。將剩餘250 ml的0.5X TBE緩衝液倒入電泳槽中，開啟脈衝是電泳裝置CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)電源、幫浦（流速70 ml/min）及冷卻裝置，使緩衝液溫度降至14℃。組裝好電泳膠鑄膠臺（gel casting stand）並以水平桌調整水平；齒梳（comb）緊密接觸鑄膠臺底部的撐膠板（gel platform）。將已被酵素消化之細長狀膠條（slices）取出，用吸水紙盡量吸乾附著於其上之緩衝液，再將細長狀膠條依序平貼於齒梳（comb）；將PFGE分析用標準marker菌株放置於適當位置，其餘孔位放置樣本菌株。之後將齒梳直立放置在鑄膠台(gel casting stand)上，倒入融化回溫至56℃的% SeaKem Gold agarose電泳用膠，放置室溫20-30. 31.

(43) 分鐘或4℃ 15分鐘待冷卻凝固後即可進行電泳。電泳條件設定如下： Acinetobacter baumannii Initial switch time. 2.2 seconds. Final switch time. 54.2 seconds. Run time. 21 hours. Angle. X. Voltage Gradient. 6.0 volts/cm. Temperature. 14℃. Ramping factor. Linear. 7.5 染色與照相電泳結束，關閉電泳裝置取出膠片，置於1 μl/ml溴化乙苯非啶溶液（ethidium bromide）染色1020分鐘，並以二次水 DDW）褪染20-30分鐘。膠片最後放置在UV平台上觀察，並以數位影像系統擷取DNA圖譜影像儲存成數位檔案（*.tif 檔），以供後續進行圖譜分析比對。 7.6 結果分析比對傳統的的PFGE分析法，可依酵素處理各菌株電泳後之片段的大小與數目，根據Tenover 等學者發表的判讀方式 (Tenover et al. 1995)，進行各菌株PFGE 分析後之片段型式 (fragment patterns)，若多於≧7 條片段之差異，則歸為不同類. 32.

(44) 型；若介於4~6 條片段之差異，則歸為不同亞型；若≦3 條片段之差異，則歸為同一類型。即可分析菌株間相關的親源性與流行病學上之關連性。並再依片段型式之差異，重新排列菌株樣品順序再進行同樣條件之電泳分析，以利在親源性關連與分類區分上之判讀。本研究使用疾病管制局第三分局的Bionumeric軟體進行分析，70%以上的相似度可判讀為同一cluster，85%以上的相似度可以判讀為密切相關的次群體。. 33.

(45) 第三章研究結果第一節鮑氏不動桿菌抗藥性的持續上升本院抗 carbapneme 鮑氏不動桿菌分離率從 2002 年的 2.2% 增加到 2006 年 29.6%，呈現顯著之差異(表 1)。在引起院內感染的鮑氏不動桿菌部分也有相同趨勢從 2006 年的 36%上升到 2007 年的 58.2%。其中 2006 年總共分離到 221 株抗 carbapnem 鮑氏不動桿菌，檢體部位以 sputum 104 筆(47.0%)最多，其次為 urine 35 筆(15.8%)，pus 36 筆(16.3%)，從 blood 分離得到只有 8 筆(3.6%)。其中從 ICU 病人分離得到有 84 筆(38%)，從普通病人分離得到有 76 筆(34.4%)，從慢性呼吸照護單位分離 51 筆(23.1%)，從門診分離到 10 筆(4.5%)。 2006 年所分離之 221 株抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌，依紙錠擴散法結果顯示，對其他藥物之感受性分別為： levofloxacin 4.1%(9/221)；ciprofloxacin 4.1%(9/221)； ceftazidime 4.1%(9/221)；cefepime 5.0%(11/221)； ampicillin/sulbactam 23.1%(51/221)；piperacillin/tazobactam 2.7%(6/221)；aztreonam 0% (0/221)；gentamicin 3.2%(7/221)； amikacin 19.4%(43/221)；trimethoprim/sulfamethazole 0.9%(2/221)。. 34.

(46) 2007 年 01 月到 09 月總共分離到 476 株鮑氏不動桿菌，收集每一位病患第一次分離得到的不重複抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌 175 株，這 175 隻菌株之採檢部位、病人所在單位、及抗生素敏感性詳見表 2-4。最多的檢體來自於 sputum 108 筆 (61.7%)，其次為 urine 28 筆(16%)，pus 18 筆(10.3%)，blood 8 筆（4.6%）。對其它抗生素的敏感性分別為 amikacin 9.1%， gentamicin 5.7%，ceftazidime 2.3%，cefepime 3.4%，aztreonam 0%，ampicillin/sulbactam 13.7%，piperacillin/tazobactam 1.1%， trimethroprim/sulfamethozale 2.9%，ciprofloxacin 3.4%，及 levofloxacin 4.6%。這 175 株中，有 94 株(53.7%)是從加護病房分離得到，50 筆(28.6%)是從普通病房分離得到，19 筆(10.9%) 從慢性呼吸照護病房得到，8 筆(4.6%)從急診得到，4 筆(2.3%) 從門診病人分離得到。鮑氏不動桿菌的檢體來源多數來自加護病房及普通病房呼吸道檢體（表 4）。我們從 2007 年 01 月到 09 月分離得到的 175 株不重複抗 imipenem 鮑氏不動桿菌，挑選 28 株，進行後續研究。這 28 株細菌中，有 27 株為住院 72 小時候從病人身上分離得到，其中一株院外病史不明。這 28 株抗 imipenem 之鮑氏不動桿菌之檢體來源為痰的有 11 株，尿液 6 株，膿 5 株，腹水 2 株，. 35.

(47) 中心靜脈導管 2 株，關節腔引流管及血液各 1 株。這 28 株細菌分離時病人所在病房單位在加護病房的有 16 位，在普通病房 7 位，在慢性呼吸照護病房 3 位，急診及門診各一位（表 5 及表 6）。. 第二節多重抗藥性之鮑氏不動桿菌 28 株抗 imipenem 之鮑氏不動桿菌對各種抗生素之最低抑菌濃度 MIC90 測量結果(微生物自動化分析儀)如下:amikacin >32 μg/ml，gentamicin >8 μg/ml，imipenem >8 μg/ml， meropenem >8 μg/ml，ceftazidime >16 μg/dl，cefotaxime >32 μg/ml，cefepime >16 μg/ml，ampicillin/sulbactam >16/8 μg/ml， piperacillin/tazobactam >2/38 μg/ml， trimethoprim/sulfamethazole >2/38 μg/ml， ciprofloxacin >2 μg/ml，及 levofloxacin >2 μg/ml（表 7）。用 E-test 測試對 imipenem 最低抑菌濃度，結果顯示 28 株細菌對 imipenem 的最低抑菌濃度均大於或等於 32 μg/ml。進一步用瓊脂稀釋法（agar dilution）法檢驗顯示最低抑菌濃度範圍 16～64 μg/ml。比較 E-test 及瓊脂稀釋法檢驗結果，有 5 隻菌株，瓊脂稀釋法測試結果較 E-test 結果低 2 倍(表 8)。. 36.

(48) 用自動化微生物儀檢驗 28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌對 colistin 的最低抑菌濃度，結果顯示對 colistin 最低抑菌濃度範圍為≤ 0.5~1 μg/m，依據美國臨床及實驗室學會的判讀標準（最低抑菌濃度≤ 2 μg/m 為感受性，≥4 μg/m 為抗藥性）， colistin 對抗 imipenem 鮑氏不動桿菌有 100%的敏感性。用 E-test 方法檢測 tigecycline 的最低抑菌濃度（MIC），抗 imipenem 鮑氏不動桿菌對 tigecycline 的 MIC 範圍從 0.38μg/ml 到 16μg/ml，依據美國食品藥物管理局所提出 tigecycline 對腸道桿菌的判讀標準（≤ 2 μg/ml 為感受性），其中的 23 株（82.1%）對 tigecycline 呈現感受性（表 8）。. 第三節具有 OXA-23 及 OXA-66 之鮑氏不動桿菌我們 28 株細菌均沒有被偵測到 OXA-24、OXA-58、 VIM-type、IMP-type 及 SIM-1。但其中有 26 株細菌具有 OXA-23，全部 28 隻細菌均有 OXA-66(表 10)。另外檢測 8 株對 imipenem 據感受性的鮑氏不動桿菌顯示，發現各有 6 株細菌具有 OXA-23 及 OXA-66。OXA-23 及 OXA-66 在抗 imipenem 及不抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌上並沒有明顯差異（92.9%對 75%，100%對 75%）。. 37.

(49) 第四節 ISAba1 存在鮑氏不動桿菌 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游進一步檢測 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游 ISAba1 之存在情形，發現 26 之具有 OXA-23 之細菌，25 隻 blaOXA-23 上游有 ISAba1，全部 28 之細菌之 blaOXA-66 上游都有 ISAba1 存在(表 11)。另外檢測有 OXA-23 或 OXA-66 對 imipenem 有感受性的鮑氏不動桿菌各 6 株，在 6 株有 OXA-23 的菌株中只有一株其 blaOXA-23 上游存有 ISAba1，在 6 株有 OXA-66 的菌株中只有五株其 blaOXA-66 上游存有 ISAba1。 blaOXA-66 上游存有 ISAba1 的情形在抗 imipenem 及不抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌兩者並沒有顯著差異存在（100%對 83.3%），但 blaOXA-23 上游存有 ISAba1 的情形則有顯著差異（96.2%對 16.7%）。. 第五節兩個主要流行菌株依據脈衝式膠體電泳的結果顯示，28 之細菌總共有 16 個基因型，依據 Bionumeric 軟體之分析，可將其分為 4 個群體（cluster）及 9 個次群體（subgroup）。其中 cluster A 佔 14 株(50%)最多。cluster B 有 1 株(3.6%)，cluster C 有 8 株. 38.

(50) (28.6%)，cluster D 有 5 株（17.8%）（表 12、13 及圖 2）。. 39.

(51) 第四章討論第一節持續上升之抗藥性根據本研究之結果顯示，對 carbapenem 呈抗藥性之鮑氏不動桿菌(CRAB)分離數量在本院從 2006 年開始快速上升。 2007 年鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性較 2006 年更高。這個資料跟疾病管制局所提供 2007 年全國醫學中心及區域醫院加護病房院內感染菌株統計資料顯示 CRAB 佔所有院內感染鮑氏不動桿菌的 50%相接近（未發表資料）。本研究結果也顯示抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌不僅對 carbapenem 呈現抗藥性，對大多數常規檢驗之抗生素也均有 80%以上之抗藥性，敏感度最高的 ampicillin/sulbactam 也只有 13.7%的敏感度，這樣的抗藥性是遠高於台大薛博仁醫師先前所發表的資料(Hsueh et al. 2002)。以上結果顯示 CRAB 感染不僅是本院問題，也是全國性的問題，而且這抗藥性趨勢正逐漸上昇中。. 40.

(52) 第二節多重抗藥性鮑氏不動桿菌依據各種抗生素的最低抑菌濃度結果顯示，抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌不僅對 carbapenem 具抗藥性，幾乎對多數常規實驗室檢驗之抗生素均具有抗藥性，其中包含 ampicillin/sulbactam。這使的抗生素的選擇變得相當困難。先前曾有部分專家指出，可以使用含 sulbactam 的 ampicillin/sulbactam 治療抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌引起的感染症(Gales et al. 1996)。但在我們的研究顯示，CRAB 對 ampicillin/sulbactam 的感受性不到 2 成，因此要選擇 ampicillin/sulbactam 當作疑似鮑氏不動桿菌感染時的經驗性治療藥物，可能要先瞭解該機構本身鮑氏不動桿菌對 ampicillin/sulbactam 的敏感性。對於 CRAB 的治療選擇，已經有多篇論文指出合併治療的可行性，其中主要是 carbapenem 合併 sulbactam 或 rifampin，及 colistin 合併 rifampin(Scheetz et al. 2007; Song et al. 2007; Tripodi et al. 2007)。但除了 carbapenem 及 sulbactam 的合併治療有較多的回溯性個案研究外，其它多為個案報告或體外研究，有關合併使用多種藥物治療抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌引起的感染症仍須更多的研究。. 41.

(53) Colistin，為 polymycin 類藥物，作用在細菌細胞膜，藉著改變細菌細胞膜內外的離子濃度，而造成細菌死亡。近年來在多重抗藥性的革蘭氏陰性細菌的治療上扮演重要角色，尤其是多重抗藥性鮑氏不動桿菌及綠膿桿菌(Betrosian et al. 2008; Dizbay et al. 2008)。由本院分離之鮑氏不動桿菌的敏感性及由自動化微生物分析儀針對 28 株 CRAB 所得到最低抑菌濃度顯示 colistin 對鮑氏不動桿菌呈現 100%的敏感性，最低抑菌濃度範圍由≦0.5～1μg/ml。先前的研究也顯示用 colistin 合併 rifampin 來治療 CRAB 引起的感染症有加成效果(Tripodi et al. 2007; Bassetti et al. 2008)。 Tigecycline 是屬於新一類抗生素 glycycline，是由 minocycline 演變而來。他不受抗 tetracycline 的抗藥性機制所影響，因此有比 tetracycline 更廣的抗菌範圍，其中包括多重抗藥鮑氏不動桿菌（MDRAB）。有多篇的體外研究顯示， tigecycline 對鮑氏不動桿菌有很高的敏感度。但也有報告顯示 MDRAB 對 tigecycline 有很高的抗藥性，因此我們也使用 E-test 法檢驗本院鮑氏不動桿菌對 tigecycline 的最低抑菌濃度。結果顯示最低抑菌濃度範圍從 0.38～16μg/ml，感受度有 82.2％。是僅次於 colistin 具有最高感受性的藥物，但體外研. 42.

(54) 究顯示 tigecycline 對鮑氏不動桿菌只有抑制效果。除此之外，雖然先前有多篇研究顯示 colistin 合併 rifampin 對 MDRAB 的治療有加成效果，先前體外研究則尚未顯示 tigecycline 合併其它藥物使用有加成的效果，因此雖然 tigecycline 可以是 MDRAB 引起感染的選擇治療藥物之一，仍需要進一步的研究來確定 tigecycline 對 MDRAB 的臨床療效。. 第三節多種乙內醯胺酶同時存在等電點聚焦法顯示這個研究的 28 株細菌有四種不同的乙內醯胺酶等電點，有 5.3 (14，50%)、5.8 (19，68%)、6.4 (23， 82%)及 7.1 (4，14%) （表 9）。其中 25 株細菌有 2 個或 2 個以上的乙內醯胺酶等電點，顯示多數多重抗藥性鮑氏不動桿菌(MDRAB)多數具有一種以上的乙內醯胺酶，這或許是 MDRAB 對多數乙內醯胺類藥物具抗藥性的原因之一。但與先前有關乙內醯胺酶等電點之研究結果相比較，並不能清楚分辨出乙內醯胺酶種類，這可能因為等電點分析結果易受多種因素影響，包括支持介質、兩性電解質載體、電極溶液、丙烯醯胺的聚合、TEMED(tetramethylethylenediamine)、及樣品預處理與加樣方法。因此我們進一步用聚合酶鏈鎖反應法. 43.

(55) 及 DNA 定序來確定乙內醯胺酶種類。. 第四節同時存在 OXA-23 及 OXA-66 乙內醯胺酶我們使用附錄五所列的 primer，利用聚合酶鏈鎖反應檢驗 OXA-23、 OXA-51-like、 OXA-24-like、 OXA-58-like、 SIM-1、 IMP-type、VIM-type 基因的存在與否。研究結果顯示，我們所選的 28 株鮑氏不動桿菌並不具有 OXA-24-like、 OXA-58-like、SIM-1、IMP-type 及 VIM-type。OXA-23 及 OXA-51-like 則分別在 26 株及 28 株細菌上發現。進一步的基因定序確定為 blaOXA-23 及 blaOXA-66。 OXA-66 基因位於鮑氏不動桿菌的染色體上，因此出現在我們的 28 株 MDRAB 並不令人意外，先前台灣某醫院有關 CRAB 的抗藥性研究也顯示都具有 OXA-66(Hu et al. 2007)。 OXA-23 的基因一般位於質體上，已經有幾篇因 OXA-23 引起鮑氏不動桿菌對 carbapenem 抗藥性的群聚感染事件被報告 (Villegas et al. 2007; Zhou et al. 2007; Zong et al. 2008)，但在台灣則尚未被報告過。我們的研究證實 OXA-23 亦存在於台灣醫院的鮑氏不動桿菌。由於 OXA-23 的基因位於質體上，可以很容易從一株細菌轉移至另一株細菌，因此 OXA-23 的散. 44.

(56) 播可能造成對 carbapenem 抗藥性的傳播。我們另外檢測的 8 株對 imipenem 具感受性的鮑氏不動桿菌，其中 OXA-23 及 OXA-66 各在 6 株細菌被發現。這個結果顯示，抗 imipenem 與不抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌在 OXA-23 及 OXA-66 的存在上並無明顯差異。. 第五節 ISAba1 存在 blaOXA-23 及 blaOXA-66 上游 ISAba1 這一個插入序列已經被證實可以影響多種乙內醯胺酶的表現(Heritier et al. 2006; Turton et al. 2006)。單獨的 OXA-type carbapenemase 只具有微弱的 carbapenem 水解能力，不足以造成細菌對 carbapenem 的抗藥性。但若 OXA-type carbapenemase 的基因上游存在有 ISAba1 的插入序列，因為 ISAba1 扮演 promoter 的角色，已經證實可以增加鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的最低抑菌濃度(Segal et al. 2005; Turton et al. 2006)。先前國外有關具有 OXA-23 的鮑氏不動桿菌引起的的感染事件研究指出 blaOXA-23 的上游多數有 ISAba1 element，但 blaOXA-66 則沒有 ISAba1 存在(Zong et al. 2008)，對 carbapenem 的抗藥性主要是由於同時存在有 ISAba1 及 blaOXA-23 所引起。. 45.

(57) 先前馬偕醫院的研究顯示抗 carbapenem 的鮑氏不動桿菌 blaOXA-66 的上游也有 ISAba1 element 存在(Hu et al. 2007)， ISAba1 element 的存在可以增加 blaOXA-66 的表現。把 blaOXA-66 轉移至大腸桿菌可以增加大腸桿菌對 imipenem 的最低抑菌濃度。但馬偕醫院的研究並未探討其它乙內醯胺酶存在情形，包括其他 OXA-type carbapenemase，因此難以斷定鮑氏不動桿菌對 imipenem 的抗藥性是由全 OXA-66 所引起，只能說抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌多數具有 ISAba1-blaOXA-66，而且提供部分抗 imipenem 的能力。我們所選擇的 28 株抗 imipenem 鮑氏不動桿菌多數同時具有 ISAba1-blaOXA-23 及 ISAba1-blaOXA-66，在另外 8 株對 imipenem 具感受性的鮑氏不動桿菌也有 blaOXA-23 及 blaOXA-66。但這 8 株對 imipenem 具感受性之鮑氏不動桿菌， blaOXA-66 的上游多數有 ISAba1 存在(6/5)，但 blaOXA-23 的上游則只有 16.7%(1/6)存在有 ISAba1，抗 imipenem 與不抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌 blaOXA-23 上游 ISAba1 存在情形是有顯著差異。同時具有 ISAba1-blaOXA-23 及 ISAba1-blaOXA-66 是否會增加鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的最低抑菌濃度則並沒有被探討. 46.

(58) 過，根據先前有關抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌引起之感染事件的報告，那些細菌 ISAba1 只出現在 blaOXA-23 的上游， blaOXA-66 的上游則無 ISAba1(Zong et al. 2008)，但依然對 carbapenem 具有抗藥性，而且我們的研究顯示 ISAba1-blaOXA-66 存在情形在抗 imipenem 及不抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌中並沒有顯著差異，但 ISAba1-blaOXA-23 的存在情形在兩者則有顯著差異存在。調查脈衝式膠體電泳分析結果顯示為密切相關的次分群 A3，五株細菌中，四株同時具有 ISAba1-blaOXA-23 及 ISAba1-blaOXA-66，一株只具有 ISAba1-blaOXA-66，這株細菌對 carbapenem 的最低抑菌濃度只有 16μg/ml，其它四株中有三株最低抑菌濃度為 32μg/ml，一株為 64μg/ml。以上結果或許代表 OXA-23 對 carbapenem 的抗藥性較 OXA-66 有更大影響，但因為鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性除了 OXA-type carbapenemase 外，還有其它機轉，包括如 porin 的喪失及 metallo-β-lactamase 的存在與否，而我們並未調查其它的機轉，因此難以下結論說只具有一種 OXA-type carbapenemase 的鮑氏不動桿菌較具有兩種者有較低最低抑菌濃度。. 47.

(59) 第六節兩個主要的流行菌株用 AscI 切割酶所得到的脈衝式膠體電泳分析結果，使用 Bionumeric 軟體分析顯示有四個分群（cluster） A、B、C 及 D，及 9 個密切相關次群體（subgroup）存在。其中 cluster A 有 14 株（50%），cluster C 有 8 株（28.6%）這個結果顯示有一個主要抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌在本院散播。這個 cluster A 的抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌不僅從加護病房病人分離得到，也出現在普通病房、急診室及呼吸照護病房。但因為病人可能在幾種不同之病房單位間互轉，而且我們沒有進行入住病人的主動篩檢及環境調查，因此不能遽下結論本院所有病房都有這抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌存在。第七節研究限制 1. 細菌收集本研究只收集了全部 175 株抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌中的 28 株（16%），因此能否用來推估所有的菌株仍有疑問。且只收集抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌，無法代表所有鮑氏不動桿菌。而且沒有進行環境調查，難以釐清抗 carbapenem 細菌之來源。. 48.

(60) 2. 敏感性試驗本研究雖然用多種方法去檢驗 imipenem 的最低抑菌濃度，但並沒有檢驗 porin membrane protein loss、efflux pump，也無法檢驗所有可能的 OXA-type carbapenemase，因此難以推估 OXA-type carbapenemase 對 carbapenem 抗藥性的影響。 3. 乙內醯胺酶等電點聚焦分析本研究針對 28 株抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌所進行的等電點分析結果，有四種乙內醯胺酶被偵測到，但無法依據先前所發表之文獻得到較明確之結果 (Walther-Rasmussen and Hoiby 2006)。且因為偵測範圍從 pI 3.5 到 9.5，可能無法偵測到所有的乙內醯胺酶。 4. OXA-type carbapenemase 及 ISAba1 在我們的抗 imipenem 鮑氏不動桿菌多數同時具有 ISAba1/OXA-23 及 ISAba1/OXA-66，究竟兩者的交互作用是如何在本研究中並未被探討，雖然我們檢驗了 8 株對 imipenem 呈現感受性的鮑氏不動桿菌，結果顯示 ISAba1/OXA-23 的存在在抗 imipenem 與不抗 imipenem 的細菌間有顯著差異存在，但 8 株細菌是否有代表性則仍存. 49.

(61) 疑。 5. 脈衝式膠體電泳法我們只取 28 株細菌進行基因分型，雖然是不重複菌株，但能否代表本院全體流行鮑氏不動桿菌則仍有疑問，其他醫院的流行菌株是否根本院相同也是一大疑問。. 50.

(62) 第五章結論與建議第一節結論本院所分離之所有鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性從 2005 年之 2.6%上升到 2006 年的 29.6%，引起院內感染事件的鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性也從 2006 年的 36%上升到 2007 年的 58%。除此之外疾病管制局所發佈 2007 年全國醫學中心及區域醫院加護病房院內感染事件之致病菌中鮑氏不動桿菌已經超越綠膿桿菌成為第一名，這些結果顯示抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌近幾年快速增加，且不僅是本院的問題，也是本國其它醫院的問題。我們的研究也發現，抗 imipenem 的鮑氏不動桿菌對其它常規檢驗之抗生素也多呈抗藥性，包括 ampicillin/sulbactam，最低抑菌濃度的檢驗也顯示相同的結果，因此在治療由抗 carbapenem 引起的感染事件，需考慮合併治療或使用較高感受性之藥物，如 colistin 或 tigecycline。我們使用自動化微生物分析儀(Phoenix)進行 colistin 最低抑菌濃度之測試，顯示 colistin 有 100%感受性(MIC 範圍 0.5-1 μg/ml)。使用 E-test 法檢驗 tigecycline 的最低抑菌濃度，最低抑菌濃度範圍 0.38-16 μg/ml，感受度有 82.2%。因此這兩個藥物應可. 51.

(63) 考慮為抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌引起感染時之治療藥物。研究的 28 株對 carbapenem 有抗藥性之鮑氏不動桿菌都具有有 blaOXA-66(100%)，26 隻菌株具有 blaOXA23（92.9%）。ISAba1 分別在 25 株具有 blaOXA-23 及 28 株具有 blaOXA-66 基因的上游被發現。另外 8 株對 imipenem 具感受性之鮑氏不動桿菌，發現各有 6 隻菌株具有 blaOXA-23 或 blaOXA-66，在這些對 imipenem 具感受性之鮑氏不動桿菌中，只有一株細菌 blaOXA-23 前有 ISAba1 存在，有五株細菌 blaOXA-66 前有 ISAba1 存在，blaOXA-23 前 ISAba1 存在情形在對 imipenem 具感受性及不具感受性兩者之間有明顯差異，這或許代表 OXA-23 在鮑氏不動桿菌對 carbapenem 的抗藥性有較大影響，但此推論需進一步之研究證實。脈衝式膠體電泳法進行基因分型，總共有 16 個基因分型。依據 Bionumeric 軟體的分析結果，可將這些菌株分成 4 個群集。其中 cluster A 有 14 株（50%），cluster C 有 8 株 (28.6%)。這個研究結果顯示在本院流行的抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌主要是由同時能產生 OXA-23 及 OXA-66 流行菌株 cluster A 及 C 所組成。. 52.

(64) 建議 1. 進行環境調查，瞭解散播的來源，並進一步採取相關的感染管制措施，以判斷環境調查的正確性及感染管制措施的有效性，來阻止此抗藥性菌株的進一步散播。 2. 進行 OXA-23 及 OXA-66 之間交互作用的研究，以了解不同 OXA-type carbapenemase 對 carbapenem 抗藥性的影響。 3. 進行其它抗 carbapenem 機轉的研究，釐清各種抗藥性機轉之散佈情形及影響程度。 4. 進行跨院際研究，瞭解抗 carbapenem 鮑氏不動桿菌及 OXA-23 carbapenemase 在台灣散佈之情形。. 53.

(65) 參考文獻 Alekshun, M.N. and Levy, S.B. (2007) Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell 128, 1037-1050. Ambler, R.P. (1980) The structure of beta-lactamases. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 289, 321-331. Bassetti, M., Repetto, E., Righi, E., Boni, S., Diverio, M., Molinari, M.P., Mussap, M., Artioli, S., Ansaldi, F., Durando, P., Orengo, G., Bobbio Pallavicini, F. and Viscoli, C. (2008) Colistin and rifampicin in the treatment of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infections. J Antimicrob Chemother 61, 417-420. Betrosian, A.P., Frantzeskaki, F., Xanthaki, A. and Douzinas, E.E. (2008) Efficacy and safety of high-dose ampicillin/sulbactam vs. colistin as monotherapy for the treatment of multidrug resistant Acinetobacter baumannii ventilator-associated pneumonia. J Infect 56, 432-436. Bicknell, R., Knott-Hunziker, V. and Waley, S.G. (1983) The pH-dependence of class B and class C beta-lactamases. Biochem J 213, 61-66. Bush, K., Jacoby, G.A. and Medeiros, A.A. (1995) A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 39, 1211-1233. Dalla-Costa, L.M., Coelho, J.M., Souza, H.A., Castro, M.E., Stier, C.J., Bragagnolo, K.L., Rea-Neto, A., Penteado-Filho, S.R., Livermore, D.M. and Woodford, N. (2003) Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil. J Clin Microbiol 41, 3403-3406. Dever, L.A. and Dermody, T.S. (1991) Mechanisms of bacterial resistance to antibiotics. Arch Intern Med 151, 886-895. Dizbay, M., Altuncekic, A., Sezer, B.E., Ozdemir, K. and Arman, D. (2008) Colistin and tigecycline susceptibility among multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from ventilator-associated pneumonia. Int J Antimicrob Agents 32, 29-32. Ellington, M.J., Kistler, J., Livermore, D.M. and Woodford, N. (2007) Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding acquired metallo-beta-lactamases. J Antimicrob Chemother 59, 321-322. Fisher, J., Belasco, J.G., Khosla, S. and Knowles, J.R. (1980) beta-Lactamase 54.

(66) proceeds via an acyl-enzyme intermediate. Interaction of the Escherichia coli RTEM enzyme with cefoxitin. Biochemistry 19, 2895-2901. Gales, A.C., Sader, H.S., Sinto, S., Santos, O.P. and Mendes, C.M. (1996) In vitro activity of ampicillin-sulbactam against clinical multiresistant Acinetobacter baumannii isolates. J Chemother 8, 416-419. Giordano, A., Varesi, P., Bertini, A., Villa, L., Dionisi, A.M., Venditti, M., Carfagna, P., Luzzi, I., Mancini, C. and Carattoli, A. (2007) Outbreak of Acinetobacter baumannii producing the carbapenem-hydrolyzing oxacillinase OXA-58 in Rome, Italy. Microb Drug Resist 13, 37-43. Go, E.S., Urban, C., Burns, J., Kreiswirth, B., Eisner, W., Mariano, N., Mosinka-Snipas, K. and Rahal, J.J. (1994) Clinical and molecular epidemiology of acinetobacter infections sensitive only to polymyxin B and sulbactam. Lancet 344, 1329-1332. Hashizume, T., Ishino, F., Nakagawa, J., Tamaki, S. and Matsuhashi, M. (1984) Studies on the mechanism of action of imipenem (N-formimidoylthienamycin) in vitro: binding to the penicillin-binding proteins (PBPs) in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, and inhibition of enzyme activities due to the PBPs in E. coli. J Antibiot (Tokyo) 37, 394-400. Hayes, J.D. and Wolf, C.R. (1990) Molecular mechanisms of drug resistance. Biochem J 272, 281-295. Heritier, C., Poirel, L. and Nordmann, P. (2006) Cephalosporinase over-expression resulting from insertion of ISAba1 in Acinetobacter baumannii. Clin Microbiol Infect 12, 123-130. Hsueh, P.R., Teng, L.J., Chen, C.Y., Chen, W.H., Yu, C.J., Ho, S.W. and Luh, K.T. (2002) Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerg Infect Dis 8, 827-832. Hu, W.S., Yao, S.M., Fung, C.P., Hsieh, Y.P., Liu, C.P. and Lin, J.F. (2007) An OXA-66/OXA-51-like carbapenemase and possibly an efflux pump are associated with resistance to imipenem in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 51, 3844-3852. Jacobs, C., Huang, L.J., Bartowsky, E., Normark, S. and Park, J.T. (1994) Bacterial cell wall recycling provides cytosolic muropeptides as effectors for beta-lactamase induction. EMBO J 13, 4684-4694.. 55.

(67) Jeon, B.C., Jeong, S.H., Bae, I.K., Kwon, S.B., Lee, K., Young, D., Lee, J.H., Song, J.S. and Lee, S.H. (2005) Investigation of a nosocomial outbreak of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 beta-lactamase in korea. J Clin Microbiol 43, 2241-2245. Kumar, A. and Schweizer, H.P. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: active efflux and reduced uptake. Adv Drug Deliv Rev 57, 1486-1513. Mascini, E.M. and Bonten, M.J. (2005) Vancomycin-resistant enterococci: consequences for therapy and infection control. Clin Microbiol Infect 11 Suppl 4, 43-56. Massova, I. and Mobashery, S. (1998) Kinship and diversification of bacterial penicillin-binding proteins and beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 42, 1-17. Naas, T. and Nordmann, P. (1994) Analysis of a carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamase from Enterobacter cloacae and of its LysR-type regulatory protein. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 7693-7697. Neu, H.C. (1992) The crisis in antibiotic resistance. Science 257, 1064-1073. Nikaido, H. (1994) Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. J Biol Chem 269, 3905-3908. Scheetz, M.H., Qi, C., Warren, J.R., Postelnick, M.J., Zembower, T., Obias, A. and Noskin, G.A. (2007) In vitro activities of various antimicrobials alone and in combination with tigecycline against carbapenem-intermediate or -resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 51, 1621-1626. Segal, H., Garny, S. and Elisha, B.G. (2005) Is IS(ABA-1) customized for Acinetobacter? FEMS Microbiol Lett 243, 425-429. Song, J.Y., Kee, S.Y., Hwang, I.S., Seo, Y.B., Jeong, H.W., Kim, W.J. and Cheong, H.J. (2007) In vitro activities of carbapenem/sulbactam combination, colistin, colistin/rifampicin combination and tigecycline against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 60, 317-322. Tenover, F.C., Arbeit, R.D., Goering, R.V., Mickelsen, P.A., Murray, B.E., Persing, D.H. and Swaminathan, B. (1995) Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 33, 2233-2239.. 56.