第二章 文獻探討
7.3 乳酸菌之競爭排除作用
病 原 菌 感 染 腸 道 的 首 要 步 驟 即 為 吸 附 至 腸 黏 膜 表 面(Beachey, 1981)，因此抑制病原菌之吸附可預防其感染與定殖(Tuomola et al., 1999)。已有許多研究證實益生菌能於腸道中經繁殖產生代謝物，抑制腸
內其他病原菌生長，或經由競爭營養素而得到成長優勢，或經由競爭腸 道定殖區域、利用空間妨礙(steric hindrance)來抑制排除病原菌之定著 (黃，2003; Fujiwara et al., 2001; Gagnon et al., 2004; Lee et al., 2000; Lee and Puong, 2002; Nava et al., 2005)。
InlA: internalin A LLO: listeriolysin O
ActA: actin-assembly-inducing protein Mpl: metalloproteinase
(Pamer, 2004)
圖2.13、單核球增多性李斯特菌(L. monocytogenes)的感染機制 Fig. 2.13 The infection and intercellular transmission of Listeria
monocytogenes.
第8節 乳酸菌之 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性
Brennen等(1986)指出，菌體細胞經乾燥處理之前，其細胞並沒有破 裂的現象，但經乾燥之後，尤其是真空乾燥，菌體細胞壁與細胞膜均遭 受破壞，此時由於菌體細胞膜受到傷害，使得β-半乳糖苷酶活性急遽 增加。所以可藉由測定β-半乳糖苷酶的活性來判斷細胞膜破壞之程度。
Castro等(1997)亦指出，細胞膜的破壞反應出膜的通透性增加，致使測得 之β-半乳糖苷酶活性較完整菌體者為高。β-半乳糖苷酶為一水解酶，可
催 化 乳 糖 水 解 成 半 乳 糖 與 葡 萄 糖 ， 如 圖 2.14 (A) 。 o-nitrophenyl-β-D-galactoside (ONPG)是合成的乳糖類似物，會被β-半乳 糖苷酶分解產生半乳糖及黃色的o-nitrophenol，如圖2.14 (B)。當ONPG 在過量的酵素中反應，每單位時間產生的o-nitrophenol會與β-半乳糖苷酶 的含量成比例，因此測定黃色生成的吸光值相當於測定β-半乳糖苷酶的 量(王，1999)。Taranto等(2006)即測定β-半乳糖苷酶活性來判斷不同濃度 之膽鹽對乳酸菌細胞膜滲透性改變之影響。
第9節 乳酸菌之安全性評估
欲成為益生菌最重要的條件就是必須具有吸附於人類腸道細胞之
(王，1999) 圖2.14、β-半乳糖苷酶對乳糖及 ONPG 作用情形 (A)乳糖水解 (B) ONPG
水解
Fig. 2.14 Lactose and ONPG hydrolysis by β-galactosidase: (A) lactose hydrolysis; (B) ONPG hydrolysis
能力，但不能具有侵入性(invasion)，因為菌株若有侵入性可能就同時擁 有相當程度的病原性與感染性(Ford et al., 1996; Urao et al., 1996)。具侵 襲力(invasiveness)的致病菌能突破宿主黏膜屏障，侵入細胞內定殖進而 造成致病性。細菌侵入細胞有兩個步驟：(1)細菌附著於宿主細胞上-菌 體需有適合的受體，才可吸附至細胞上，如圖2.15 (A)；(2)進入細胞內-細菌以各種機制進入細胞內，大多是菌體放出訊息使細胞之細胞骨架 (cytpsleleton)重排而進入細胞，如圖 2.15 (B)。因此研究細菌是否具有侵
入性可以生體外之細胞模式進行評估。其方法大致為：(1)首先將試驗菌
株與細胞共同培養一段時間，使細菌有機會附著於細胞上，若該菌株具
有侵入性則會侵入細胞內。(2)接著加入抗生素以殺死只附著在細胞表面
之試驗菌株。(3)打破細胞並計數侵入細胞內之菌數(Tang et al., 1993)。
另外也可以實驗動物評估活體內之菌體侵入性，主要是先餵食實驗動物
該試驗菌株，之後取其血液及肝、脾等器官計數其侵入菌數(Seppa,
1989)。
第10節 研究動機
現今大部份關於乳酸菌生體外(in vitro)之耐酸性、耐膽鹽、腸道細 胞吸附性和拮抗病原菌等試驗多是以酸與膽鹽分別進行之非連續試驗
(#1. http://basic.shsmu.edu.cn/passw/micro2/jxnr/cn/6.ppt)
圖2.15、致病菌侵襲腸道上皮細胞過程 (A)致病菌先行吸附於腸道上皮
細胞上。(B)進而侵襲腸道細胞
Fig.2.15 The process of pathogens invading intestinal epithelial cells : (A) adherence of pathogens to the intestinal epithelial cell surface, and (B) invade the intestinal cells
模式為之，或是直接以未經胃腸道條件作用之菌體來進行探討(Chou and Weimer, 1999; Dunne et al., 2001; Fernández et al., 2003)。但食物於胃腸道 消化的過程實為一連續的作用，目前雖有許多固定化乳酸菌及探討益生 特性之生體外試驗，但很少有文獻研究固定化對乳酸菌於模擬消化道條 件因子連續作用後之保護效果，以及自固定化材質釋出之菌體是否仍保 有多方面的基礎益生特性，故上述之生體外試驗模式實為一值得開發與 進行之研究課題。
第11節 研究目的
本研究欲以褐藻酸鈣(Ca-alginate)和幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質 (Chitosan-Ca-alginate complex material) 來 包 埋 固 定 化 Lactobacillus reuteri，探討固定化對乳酸菌經模擬消化條件之連續作用後的保護效
果。以測定菌體之β-半乳糖苷酶活性來研究酸與膽鹽對固定化與游離態
菌體細胞膜之作用差異性。最後以Caco-2 細胞模擬腸道細胞，利用生體
外試驗模式探討釋出之 L. reuteri 對腸道細胞之吸附性、對 Listeria monocytogenes 的拮抗性以及所釋出益生菌菌體本身之安全性等基礎益 生特性。