第三章 材料與方法
2.12 安全性評估試驗之材料
抗生素(tetracycline; MDBio, Frederick, MD, USA)
第3節 實驗菌株前處理
由食品工業發展研究所生物資源保存中心購得之菌株分別以 MRS (L. reuteri 之培養基)或 BHI (L. monocytogenes 之培養基)在 37℃下活化 培養，L. monocytogenes 之氣體需求條件為厭氣培養(gas-generating kit, Oxoid)，L. reuteri 為微好氣培養。
3.2 冷凍保存
將活化之菌液在25℃，8000 xg 下離心 10 分鐘後，將菌體沈澱(pellet) 重新懸浮於培養基中，以1：1 (v/v)的比例與無菌之 20% glycerol 溶液混 合，分裝成1 ml 的懸浮液貯存於-80℃下備用。
第4節 細胞培養
4.1 冷凍細胞之活化
Caco-2 細胞株於 37℃解凍後，立即加入新鮮之細胞培養基，於培養
瓶中混合均勻後移置CO2培養箱(NUAIRE, NU-5500, USA)中以 37℃，
5% CO2 之條件培養。於培養次日吸除舊的培養基以移除冷凍保護劑
DMSO，並加入新培養基，以相同條件繼續培養，每隔兩天更換一次細 胞培養基。
4.2 細胞之繼代培養
細胞生長至高密度時，須分殖至新的培養瓶中。先吸除舊培養基，
以PBS buffer (phosphate buffered saline)潤洗貼附在瓶壁的細胞兩次，接 著加入0.05% trypsin-EDTA (Biochrom AG)在 37℃下作用 3-5 分鐘之後，
輕拍培養瓶使Caco-2 細胞自瓶壁上脫落，再加入適量之新鮮培養基，以
吸取器吸放數次以打散細胞團塊，混合均勻後依比例稀釋移至新的培養 瓶中，按照先前之培養條件進行繼代培養。
4.3 細胞株之冷凍保存
細胞株的冷凍保存應於生長良好之對數期(log phase)、生長緻密度
約 80~90%且存活率高的狀態下進行。首先依照細胞繼代培養之步驟，
將細胞打散後收集含細胞之懸浮液，一方面取少量之細胞懸浮液計數細 胞濃度(計數方法詳如於“4.4 細胞染色與計數”)，一方面將細胞懸浮液在 25℃，4000 xg 下離心 10 分鐘，吸除上清液後加入適量之細胞冷凍培養 基均勻混合，分裝於冷凍保存管中(細胞濃度至少為 106 cells/ml)進行低
溫冷凍保存。細胞冷凍保存步驟為：將冷凍保存管於 4℃下冷藏 10 分鐘
後移至-20℃下冷凍 30 分鐘，接著在-80℃下冷凍隔夜，最後移至液態氮
4.4 細胞染色與計數
取20 μl 細胞懸浮液與 20 μl trypan blue (Biochrom AG)等體積混
合。取 20 μl 混合液注入血球計數盤上之凹槽，以倒立式顯微鏡
(Olympus, LX 71, Japan)在 100 倍放大視野下觀察計數，活細胞之細胞膜 完整不會被染色，死細胞則會被染成藍色。計數四大方格中的細胞總 數，除以4 後再乘以 2 (因與 trypan blue 等體積混合)，最後乘以 104 (血 球計數盤每一大格體積為 10-1 mm3)，所得之數值即為細胞懸浮液每 ml 之細胞數。
細胞密度 = 細胞數/ ml ＝ (四大方格之細胞總數 ÷ 4) × 2 × 104 存活率 ＝活細胞數 ÷ (活細胞數+死細胞數) × 100%
4.5 細胞單層膜之培養
此實驗步驟參考Coconnier 等(1992)所述之方法來進行。將繼代培養 之Caco-2 細胞加入六孔細胞培養盤(6 well cell culture cluster)中，使每個 well 中的細胞濃度為 3×104 ~ 3×105 cells/ml。將細胞培養盤置於二氧化碳 培養箱中，以37℃，5% CO2培養，每兩天更換新培養基，直到Caco-2 細胞分化成完全之單層膜，以倒立式顯微鏡拍照觀察之。
第5節 菌體的固定化
5.1 褐藻酸鈣之菌體固定化
將含活化菌株之菌液以25℃，8000 xg 下離心 10 分鐘後，使用無菌 PBS buffer 沖洗菌體沈澱兩次，再懸浮於無菌水中。在無菌狀態下，將 L. reuteri 菌體懸浮液以 1:1 的體積比和 2% (w/v)滅菌之褐藻酸鈉溶液在
室溫下混合，使其菌數約為N × 108 CFU/ml mix。含有菌體的 1%菌體-褐藻酸鈉混合液以擠壓法在室溫下滴入0.1 M 氯化鈣溶液，靜置 30 分鐘 後即可得內含固定化L. reuteri 之褐藻酸鈣膠球(膠球直徑 3mm)。
5.2 幾丁聚醣-褐藻酸鈣的菌體固定化
此試驗步驟參考Krasaekoopt 等(2006)所述的方法。取 0.4 g 幾丁聚 醣溶於以 0.4 ml 冰醋酸酸化之 90 ml 蒸餾水中，使其終濃度為 0.4%
(w/v)。幾丁聚醣溶液以 1 N NaOH 調整至 pH 5.7-6.0 之間，以濾紙過濾 後定量至 100 ml。將“5.1 褐藻酸鈣的菌體固定化”方法所製得之褐藻酸 鈣膠球加至已滅菌之幾丁聚醣溶液中，以100 rev/min 震盪 10 分鐘，使 幾丁聚醣包覆於褐藻酸鈣膠球外層，即得內含固定化L. reuteri 之幾丁聚
5.3 固定化菌株之電子顯微鏡觀察
此試驗參考 Ouwerx 等(1998)和 Dumay 等(1999)之方法為之。將完 整或剖半的膠球以4%戊二醛溶液於 4℃下固定 16 個小時，以 PBS buffer 潤洗後進行酒精梯度脫水(於 30, 50, 70, 80, 85, 90, 95, 100%之酒精中各
靜置15 分鐘)，再進行臨界點乾燥，於真空蒸鍍機(JOEL, JFC-1600, Japan) 鍍金後，以場發射掃描式電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope, FESEM; JEOL, JSM-7401F, Japan)觀察乾燥後之樣品。
第6節 L. reuteri 於模擬胃腸道條件作用之耐受性試驗
L. reuteri 於模擬胃腸道條件作用之耐受性試驗的流程如圖 3.2 所示。
6.1 酸液與牛膽鹽連續作用後之存活率試驗
此實驗參考 Fernández 等(2003)、Hyronimus 等(2000)和 Zárate 等 (2000)所述之方法為之。活化離心後的菌體懸浮於無菌水中，取菌體懸
浮液以1:1 的體積比與褐藻酸鈉或無菌水混合，取 1 ml 的 LAB-無菌水 混合液(游離態菌體組)或 LAB-褐藻酸鈉混合液(固定化菌體組)計數初始 菌數，菌數以log CFU/ml mix 表示。取 1 ml LAB-無菌水混合液及 1 ml
圖3.2、L. reuteri 菌體於模擬胃腸道條件作用下之耐受性試驗
Fig. 3.2 Tolerance test of L. reuteri in simulated gastrointestinal conditions pH 2, 3 之酸液
0.1, 0.5, 1%之牛膽鹽液 3 hr
3 hr 模擬結腸液
(a)固定化的 L. reuteri 菌體膠球 (b)未經固定化的游離態 L. reuteri
1 hr (a)膠球釋出的菌體
(b)游離態乳酸菌存活的菌體
LAB-褐藻酸鈉混合液製備膠球(約 40 粒膠球)分別加至 10 ml pH 2.0、3.0 之酸液中，然後置於迴轉式震盪培養箱(LUS-480, Lian Shen, Taiwan)中以 37℃，150 rev/min 震盪作用三小時。將作用後的游離態菌液樣品以 25
℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘，並將各菌體沈澱分別重新懸浮於 1 ml
之無菌水中；膠球樣品則自酸液中取出並瀝乾。將 1 ml 之游離態菌體懸
浮液及瀝乾之膠球再分別加入 0.1%、0.5%、1.0%之牛膽鹽溶液中，以 上述相同之震盪條件作用三小時。經酸液及酸液、牛膽鹽溶液連續作用 後之菌液樣品以25℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘，並將菌體沈澱重新 懸浮於1 ml 無菌水中；膠球樣品則以 2%檸檬酸鈉溶液(pH 7.93)將膠球 溶解，釋出內含菌體後，再以 25℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘，菌體
沈澱重新懸浮於1 ml 無菌水中。所有樣品均以標準平板計數法求得樣品
之存活菌數並計算其存活率；每一樣品進行三重覆試驗。菌體之存活率 計算公式如下：
6.2 經酸液、牛膽鹽連續作用後於模擬結腸液釋出之試驗
此試驗參考Mandal 等(2006)及 Rao 等(1989)的方法為之。將連續通 存活率(%) =
作用後之存活菌數 (CFU/ ml mix)
初始菌數 (CFU/ ml mix) ×100 %
過酸液、牛膽鹽溶液之菌液或膠球取出加至10 ml 之模擬結腸液(0.1 M KH2PO4 , pH 7.4±0.2)中，置於迴轉式震盪培養箱中，於 37℃，150 rev/min
下震盪作用ㄧ小時後，菌液樣品及在模擬結腸液溶出之膠球樣品以 25
℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘，再將菌體沈澱重新懸浮於 1 ml 之無菌 水中。所有樣品均以標準平板計數法求得樣品之存活菌數並計算其存活 率；每一樣品進行三重覆試驗，。
第7節 自膠球釋出之乳酸菌之 β-半乳糖苷酶活性試驗
本試驗參考 Castro 等(1997)、Noh 和 Gilloiland (1993)和 Wang 和 Sakakibara (1997)等所述之方法來進行。將經過酸液、膽鹽連續作用後於 模擬結腸液釋出之L. reuteri 以 25℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘後，
使用無菌PBS buffer 沖洗菌體沈澱物兩次，再將菌體沉澱懸浮於無菌水 中 ， 取 1 ml 的 菌 體 懸 浮 液 ， 加 入 4 ml 0.005M 之 ο-nitrophenyl-β-D-galatopyranoside (ONPG)於 37℃之水浴鍋中反應 10 分
鐘，而後加入 2 ml 0.1 M 之 Na2CO3溶液終止其反應，再以 1℃，8000 xg 離心10 分鐘，以分光光度計(U-2000, Hitachi, Japan)測其上清液在 420 nm 波長時的吸光值。
如圖 3.3 所示，將樣品所得之吸光值與檢量線比較，可測得 β-半乳糖苷 酶之活性。β-半乳糖苷酶的活性是 1 ml 的懸浮菌液經過 10 分鐘的反應
時間後，由ONPG 解離而得之 ONP μmol 數來表示，其單位為 μmol/10 min ml‧ 。
圖3.3、β-半乳糖苷酶活性之標準曲線
Fig 3.3 The standsrd curve of β-galactosidase activity.
第8節 自膠球釋出之乳酸菌的吸附性試驗
本試驗參考 Lee 等(2003)、Fernández 等(2003)、Gopal 等(2001)及 Matijašic 等(2006)之方法，將 Caco-2 細胞單層膜先以 0.25% (v/v)之戊二
醛溶液固定 15 分鐘，之後再以 PBS buffer 潤洗細胞單層膜兩次，接著 添加不含抗生素之DMEM 培養基培養 1.5 小時，作模擬腸道吸附性試驗 使用。將(1)控制組：未經包埋但經過 pH 3 酸液、0.1%牛膽鹽、模擬結 腸液連續作用後之L. reuteri 和(2)試驗組：膠球經過 pH 3 酸液、0.1%牛 膽鹽連續作用後於模擬結腸液釋出之L. reuteri 以 25℃，8000 xg 的條件 離心 10 分鐘，以 PBS buffer 清洗兩次，再重新懸浮於不含抗生素的 DMEM 中。在每個含有戊二醛固定之細胞單層膜的 well 中各加入 1 ml 游離態與自膠球釋出之L. reuteri，再置於 37℃，5% CO2的二氧化碳培 養箱中培養兩個小時。然後以PBS buffer 清洗單層膜五次洗除未吸附於 單層膜上的L. reuteri，再以 1% Triton X-100 溶液分解 Caco-2 細胞單層
膜，將well 中的溶液以標準平板計數法計數吸附之菌數，每組各進行三
重覆試驗，並計算其吸附率，其計算公式如下：
第9節 L. reuteri 拮抗病原菌吸附之試驗
9.1 游離態 L. reuteri 取代 L. monocytogenes 吸附於模擬腸道細
吸附率(%) =
吸附至細胞單層膜上的菌數(CFU/ml mix)
加至細胞單層膜上的菌數(CFU/ml mix) × 100%
組
此試驗模擬人體腸道之環境，假設病原菌L. monocytogenes 已侵襲 並吸附於腸道細胞，當外來之 L. reuteri 進入體內時，必須通過消化道而 受到胃酸、膽鹽之作用，因此試驗中之L. reuteri 經過模擬消化道環境條 件作用後再加至Caco-2 細胞中。將 Caco-2 細胞單層膜先以 0.25% (v/v) 之戊二醛溶液固定 15 分鐘，再以 PBS buffer 潤洗細胞單層膜兩次，加 入不含抗生素之 DMEM 培養基培養 1.5 小時後，添加 FITC 染色之 L.
monocytogene
s
，使其先吸附於Caco-2 細胞單層膜上，於 37℃下作用兩 小時。以未經包埋的游離態菌體作控制組，取1 ml 經過 pH 3 酸液、0.1%牛膽鹽、模擬結腸液連續作用後之游離態 L. reuteri 菌液加至已吸附 L.
monocytogenes 之 Caco-2 細胞上，以 37℃，5% CO2培養兩個小時後，
吸除培養液並以PBS buffer 潤洗 well 五次以洗除未吸附的菌體。接著使 用螢光檢測器(FLX-800, Bio-Tek, USA)以激發波長 485 nm 和散發波長 528 nm 來偵測 well 中的螢光強度(fluorescence density)，另外偵測一組預 先吸附FITC 染色之 L. monocytogenes 但未加入 L. reuteri (LAB-free 組) 的螢光強度，所有組別均以螢光顯微鏡觀察並拍照之。螢光強度比值之 計算是以測得之螢光強度值除以LAB-free 組之螢光強度值再乘以 100，
將LAB-free 組之螢光強度值定為 100%，若螢光強度比值降低，則表示
L. reuteri 能有效取代 L. monocytogenes 吸附於 Caco-2 細胞上。
9.2 固定化 L. reuteri 取代 L. monocytogenes 吸附於模擬腸道細 胞之試驗(therapeutic effect of adherence inhibition)-試驗 組
本試驗與前述9.1 之試驗方法類似，但以固定化 L. reuteri 替代游離 態者以探討其益生功效。先將 1 ml 以 FITC 染色，菌數約 108 CFU/ml 之L. monocytogene
s
加至含Caco-2 細胞單層膜之 well 中，於 37℃下作 用兩小時，使L. monocytogenes
吸附於Caco-2 細胞上。另一方面則預先 將固定化L. reuteri 於 pH 3 之酸液中作用 3 小時，接著於 0.1 %之膽鹽溶 液中作用3 小時，再於模擬結腸液中作用 1 小時使 L. reuteri 自膠球中釋出，隨後離心收集菌體沈澱，重新懸浮於不含抗生素的 DMEM 中，加
入含有“已吸附 L. monocytogenes 之 Caco-2 細胞單層膜”之 well 中，置於
37℃，5% CO2 中培養兩個小時，以螢光檢測器偵測其螢光強度。另外
亦偵測預先吸附 FITC 染色之 L. monocytogenes 但未加入 L. reuteri (LAB-free 組)的螢光強度；所有組別均以螢光顯微鏡拍照觀察之。螢光 強度之計算如“9.1 控制組”所述，若螢光強度比值降低，表示經 pH 3 之
代吸附於Caco-2 細胞上之 L. monocytogenes。
代吸附於Caco-2 細胞上之 L. monocytogenes。