固定化 L. reuteri 取代 L. monocytogenes 吸附於模擬腸道細胞之試驗

組

本試驗與前述9.1 之試驗方法類似，但以固定化 L. reuteri 替代游離 態者以探討其益生功效。先將 1 ml 以 FITC 染色，菌數約 10⁸ CFU/ml 之L. monocytogene

s

加至含Caco-2 細胞單層膜之 well 中，於 37℃下作 用兩小時，使L. monocytogene

s

吸附於Caco-2 細胞上。另一方面則預先 將固定化L. reuteri 於 pH 3 之酸液中作用 3 小時，接著於 0.1 %之膽鹽溶 液中作用3 小時，再於模擬結腸液中作用 1 小時使 L. reuteri 自膠球中釋

出，隨後離心收集菌體沈澱，重新懸浮於不含抗生素的 DMEM 中，加

入含有“已吸附 L. monocytogenes 之 Caco-2 細胞單層膜”之 well 中，置於

37℃，5% CO₂ 中培養兩個小時，以螢光檢測器偵測其螢光強度。另外

亦偵測預先吸附 FITC 染色之 L. monocytogenes 但未加入 L. reuteri (LAB-free 組)的螢光強度；所有組別均以螢光顯微鏡拍照觀察之。螢光 強度之計算如“9.1 控制組”所述，若螢光強度比值降低，表示經 pH 3 之

代吸附於Caco-2 細胞上之 L. monocytogenes。

第10節 菌株之安全性評估

L. reuteri 之安全性評估試驗是根據 Tang 等(1993)所述之方法來進

行。經模擬消化道環境條件作用後於膠球釋出的L. reuteri 對人類腸道細

胞之安全性評估，是以生體外模式之侵入性試驗為之，試驗流程如圖 3.4

所示。Caco-2 細胞單層膜先以 0.25% (v/v)戊二醛溶液固定後，再以 PBS buffer 清洗二次，接著添加不含抗生素的 DMEM 培養 1.5 hr，以供隨後

的安全性試驗使用。將經模擬消化道環境條件作用後於膠球釋出之 L.

reuteri 以及游離態菌體(對照組)以 25℃，8000 xg 的條件離心 10 分鐘後，

以 PBS buffer 沖洗菌體沈澱二次，再將其重新懸浮於不含抗生素的

DMEM 中。在每個含戊二醛固定之細胞單層膜的 well 中分別加入 1 ml 游離態與自膠球釋出之L. reuteri 懸浮菌液，再置於 37℃，5% CO₂的二 氧化碳培養箱中培養兩個小時。接著吸除 well 中之培養液，以 PBS buffer 清洗五次，洗去未附著之菌株，然後於 well 中加入含 10 mg/ml 抗生素 的DMEM，置於 37℃、5% CO₂下作用2 hr，以殺死吸附於 Caco-2 細胞 表面之L. reuteri。隨後以 PBS buffer 洗除 tetracycline 及溶液中死亡的菌 體，並使用1% Triton X-100 溶液分解 Caco-2 細胞單層膜，釋出可能侵

圖3.4、乳酸菌之侵入性試驗流程

1. Infect Caco-2 cells with bacteria (10³ to 10⁹ CFU/ml mix).

2. Incubate at 37℃, 5% CO2 for 2 hr.

3. Add tetracycline for 2 hr to kill extracellular bacteria.

4. Wash and add 1% Triton X-100 to release internalized bacteria.

5. Perform plate count of intracellular bacteria.

(Tang et al., 1993)

入 Caco-2 內部之菌株。將 well 中之溶液以標準平板計數法計數菌數並 計算侵入百分比，其計算公式如下：

侵入百分比越低，表示試驗之乳酸菌株使用於人體的安全性越高。

若其不具侵入性，則當其作為益生菌使用時，不會有侵襲人體腸道細胞 之危險。

第11節 統計分析

本實驗利用 Microsoft Excel 軟體(Microsoft Excel 2003, Microsoft, USA)計算三重覆數據之平均值與標準差，並以 SigmaPlot 繪圖軟體 (SigmaPlot 2000 for Windows, ver 6.00, 2000)繪圖。利用 SAS 軟體 (Statistical Analysis System, Version 8.2, 2001)以 ANOVA 程序之 Student’s t-test、Duncan’s multiple range test 和 Dunnett’s test 進行數據間之差異顯 著性比較。

侵入百分比(%) =

侵入 Caco-2 細胞內的菌數(CFU/ml mix)

加至 well 中的菌數(CFU/ml mix) × 100%

在文檔中 固定化對羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)菌體在模擬胃腸道條件作用下之保護效果與菌體釋出後之益生特性; Protective effects of immobilization on Lactobacillus reuteri in simulated gastrointestinal conditions and probiotic properties of the released bacteria (頁 100-104)