第1節 L. reuteri 於模擬胃腸道環境條件作用下之耐受性
以褐藻酸鈣材質與幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質包埋的掃描式電子
顯微鏡圖如圖 4.1 所示。將臨界點乾燥處理製備好的膠球後以掃瞄式電
子顯微鏡觀察，在5000 倍率下可看到 L. reuteri 菌體固定於膠球內部結 構之間(圖 4.1 (A)褐藻酸鈣固定者、(C)幾丁聚醣-褐藻酸鈣固定者)，而 以幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質包埋的膠球其外層包覆緊密，露出之菌體 明顯減少許多(圖 4.1(D))，和褐藻酸鈣材質包埋的膠球外層(圖 4.1 (B))
相比，其對L. reuteri 菌體的保護較為完備。
依固定化材質的不同，試驗組分成褐藻酸鈣組(A 組)和幾丁聚醣-褐 藻酸鈣複合材質組(CA 組)，以未經包埋的游離態菌體作為控制組並設為 F 組。觀察三組於模擬腸胃道條件作用之耐受性試驗中的菌數與存活率
變化情形，以pH 2、3 之酸液作用後 L. reuteri 的存活菌數(log CFU/ ml mix)與存活率(%)結果如表 4.1 所示，以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%
之牛膽鹽連續處理的結果如表4.2 所示，表 4.3 則是 L. reuteri 以 pH 2、
3 之酸液與 0.1、0.5、1%之牛膽鹽分別處理 3 小時，接著在模擬結腸液 中作用一小時後的存活菌數與存活率結果。結果顯示菌株經酸液作用三
圖4.1、含固定化菌體膠球之掃描式電子顯微鏡圖 (放大倍率 5000 x) (A)褐藻酸鈣膠球內部 (B)褐藻酸鈣膠球外層 (C)幾丁聚醣-褐藻 酸鈣膠球內部 (D)幾丁聚醣-褐藻酸鈣膠球外層
Fig. 4.1 Scanning electron micrograph of gel bead containing immobilized bacteria (5000 x magnification)
(A) Internal structure of Ca-alginate gel bead (B) External structure of Ca-alginate gel bead
(C) Internal structure of chitosan-Ca-alginate gel bead (D) External structure of chitosan-Ca-alginate gel bead
A B
D
C
表4.1、固定化與游離態 L. reuteri 分別以 pH 2、3 之酸液作用三小時後的存活菌數(log CFU/ ml mix)與存活率(%) Table 4.1 Viable count (log CFU/ ml mix) and survival rate (%) of immobilized and free L. reuteri treated with acid in pH
2, 3 for 3 hr respectively
Initial bacteria count pH 2 pH 3
Material bacteria count (log CFU/ ml mix*)
Survial rate (%)
Viable cell count (log CFU/ ml mix)
Survial rate (%)
Viable cell count (log CFU/ ml mix)
Survial rate (%) Free (F; control) 8.83±0.07 100 6.27±0.01 0.28 cy 8.25±0.07 26.73 bx Alginate (A; Test 1) 8.83±0.07 100 7.59±0.03 5.74 by 8.34±0.05 32.92 abx Chitosan-alginate (CA; Test 2) 8.83±0.07 100 8.22±0.01 24.62 ay 8.40±0.02 37.30 ax
* 1 ml initial volume of LAB-aseptic water mixed solution (free LAB) or LAB-Na-alginate mixed solution (immobilized LAB).
a-c Different letters within the same column significantly differ at the 5% level, n=3.
x-y Different letters within a row of the same pH values significantly differ at the 5% level, n=3.
表4.2、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時後的存活菌數(log CFU/
ml mix)與存活率(%)
Table 4.2 Viable count (log CFU/ml mix) and survival rate (%) of immobilized and free L. reuteri treated with acid of pH 2, 3 for 3 hr and then with bile salt of 0.1, 0.5, 1% concentration for 3 hr respectively
Initial bacteria count pH 2 pH 3
Material
(log CFU/ ml mix*) 0.1% bile 0.5% bile 1% bile 0.1% bile 0.5% bile 1% bile
8.83±0.07 ND ND ND 5.44±0.00 3.48±0.03 3.46±0.09
Free (F; control)
(100) ** ( 0 ) bx ( 0 ) bx ( 0 ) bx (4.08×10-2) bx (4.48×10-4) by (4.33×10-4) by
8.83±0.07 ND ND ND 7.40±0.02 5.35±0.04 3.97±0.02
Alginate (A; Test 1) (100) ( 0 ) bx ( 0 ) bx ( 0 ) bx (3.70) bx (3.33×10-2) by (1.39×10-3) by
8.83±0.07 3.14±0.04 2.10±0.09 1.97±0.08 8.09±0.08 6.13±0.087 5.87 ±0.03 Chitosan-alginate (CA; Test 2)
(100) (2.07×10-4) ax (1.86×10-5) ay (1.39×10-5) ay (1.83×101) ax (2.00×10-1) ay (1.11×10-1) ay
* 1 ml initial volume of LAB-aseptic water mixed solution (free LAB) or LAB-Na-alginate mixed solution (immobilized LAB).
** survival rate (%)
a-b Different letters within the same column significantly differ at the 5% level, n=3.
x-y Different letters within a row of the same pH values significantly differ at the 5% level, n=3.
表4.3、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時，接著在模擬結腸液 中作用一小時並釋出後的存活菌數(log CFU/ ml mix)與存活率(%)
Table 4.3 Viable count (log CFU/ml mix) and survival rate (%) of immobilized and free L. reuteri respectively treated with acid of pH 2, 3 for 3 hr, then with bile salt of 0.1, 0.5, 1% concentration for 3 hr, and finally released in simulated colon fluid for 1 hr
pH 2 pH 3
Material Initial bacteria count
(log CFU/ ml mix*) 0.1% bile 0.5% bile 1% bile 0.1% bile 0.5% bile 1% bile
8.83±0.07 ND ND ND 3.14±0.02 1.22±0.07 1.00±0.00
Free (F; control)
( 100 ) ** ( 0 ) bx ( 0 ) bx ( 0 ) bx (2.06×10-4) cx (2.49×10-6) cy (1.49×10-6) cy
8.83±0.07 ND ND ND 5.70±0.08 3.72±0.05 3.15±0.02
Alginate (A; Test 1)
( 100 ) ( 0 ) bx ( 0 ) bx ( 0 ) bx (7.53×10-2) bx (7.86×10-4) by (2.12×10-4) by
8.83±0.07 2.62±0.07 2.07±0.07 1.40±0.07 5.96 ±0.067 3.99±0.09 3.37±0.08 Chitosan-alginate (CA; Test 2)
( 100 ) (6.27×10-5) ax (1.77×10-5) ay (3.73×10-6) az (1.35×10-1) ax (1.47×10-3) ay (3.48×10-4) ay
* 1 ml initial volume of LAB-aseptic water mixed solution (free LAB) or LAB-Na-alginate mixed solution (immobilized LAB).
** survival rate (%)
a-c Different letters within the same column significantly differ at the 5% level, n=3.
小時後，包埋於相同材質之L. reuteri 之存活率在 pH 2 酸液作用後的存 活率顯著低於pH 3 者(p < 0.05)；相同 pH 值作用下則以 CA 組的存活率 顯著較高(表 4.1)。相同 pH 值作用後，存活率隨著牛膽鹽濃度的增加而
減少；相同 pH 值和牛膽鹽濃度作用後，以 CA 組的存活率結果顯著高
於其它組別(表 4.2)。經酸液、牛膽鹽與模擬結腸液作用後的存活菌數與 存活率(表 4.3)與表 4.2 結果類似，相同材質包埋的菌株在不同牛膽鹽濃
度作用下，以 0.1%牛膽鹽作用後的存活率顯著較高；以相同的模擬胃腸
道作用條件作用後，有包埋的兩組試驗組其存活率和F 組相比均具有顯
著差異，其中以CA 組的存活率顯著較高。由表 4.3 的結果發現 pH 3 之 酸液、0.1%牛膽鹽作用後菌體具有較高的存活率，因此以此試驗條件進 行生體外試驗之益生功效探討。
本研究以1 ml 的 LAB-無菌水混合液(游離態菌體組)或 LAB-褐藻酸 鈉混合液(固定化菌體組)來計數初始菌數與各種條件作用後的存活菌
數，因菌體與無菌水或褐藻酸鈉溶液混合液均成為 1：1 等體積比的混
合液，故不論菌體固定化所形成的膠球體積大小為何，膠球中所含菌數
均為1 ml 菌體混合液所形成者，且可控制游離態菌體與固定化菌體之初
始菌數為8.83±0.07 log CFU/ml mix。
益生菌有許多有益人體的健康功效，許多文獻認為要使菌體發揮其
益生功效，每克或每毫升的產品至少要有 106 的活菌數(Guarner and Schaafsma, 1998; Mandal et al., 2006; Ouwehand and Salminen, 1998; Shah, 2000)，但菌體於加工的過程中或通過宿主腸胃道時存活率會大幅降低 (Gardiner et al., 2000; Picot and Lacroix, 2004; Silva et al., 2002)，因此如何
提高菌體之存活率是值得探討的課題，而益生菌的包埋即可改善菌體於 食品加工和攝食後通過胃腸道時的存活率(Kebary et al., 1998; Khalil and Mansour, 1998; Krasaekoopt et al, 2003)。
Kim 等(1988)發現固定化可保護菌體於酸性的環境中存活，並增加
其 產 品 貯 存 的 穩 定 性 ；Champagne 等 (1992) 以 褐 藻 酸 鈣 材 質 包 埋 Lactococcus lactis，冷凍乾燥後發現與未經包埋的菌體相比，其貯存之
穩定性顯著增加；Lee 和 Heo (2000)的研究結果發現以褐藻酸鈣包埋 Bifidobacterium longum，於 pH 1.5 的模擬胃酸中其存活率比游離態菌體
高；Chandramouli 等(2004)指出經過包埋的菌體對酸性環境和膽鹽的耐 受性是增加的；Krasaekoopt 等(2003, 2004)以幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材 質包埋L. acidophilus 547、B. bifidum ATCC 1994 和 L. casei 01，評估優 格和牛奶中的存活率，結果發現經包埋的菌體存活率比游離態菌體高了 將近 10 倍；Chan 和 Zhang (2005)以幾丁聚醣包覆於褐藻酸-澱粉
形，結果發現膠球在胃酸環境中可保護包埋的Lactobacillus casei strain Shirota 並在迴腸液與結腸液中釋出菌體； 2006 年 Muthukumarasamy 等 人利用褐藻酸鈉、褐藻酸鈉與澱粉、紅藻膠(κ-carrageenan)與刺槐膠 (locust bean gum)、三仙膠(xanthan)與結蘭膠(gellan)等材料以擠壓法或乳
化法包埋L. reuteri，以菌體在模擬胃酸或膽鹽中的存活率結果來篩選最
佳的材料與包埋方法之組合。結果發現，經過包埋的L. reuteri 菌體存活 率都是顯著高於游離態菌體之存活率，其中以褐藻酸鈉或褐藻酸鈉與澱 粉以擠壓法或乳化法包埋的菌體，在模擬胃酸之環境中受到較好的保護 (p < 0.05)；Kim 等(2008)則以褐藻酸鈣包埋 L. acidophilus ATCC 43121，
結果發現與未包埋的菌體相比，對於人工胃酸與人工腸液的耐受性是顯 著增加的。
上述文獻之研究結果均顯示經過包埋的菌體可保護菌體並提高其 存活率，但多以單獨酸液與膽鹽來試驗菌體存活率，實際上攝食乳酸菌 於人體內之消化過程須通過胃酸再經過小腸之連續作用最後於下消化 道定殖，因此生體外試驗以連續之胃腸道環境條件作用會與體內胃腸道 實際情況接近。本研究結果以酸液和牛膽鹽作用後，包埋的菌體可於模 擬結腸液中釋出，其存活率和游離態菌體相比是較高的，此結果與前述 文獻之結果相類似。
第2節 釋出之乳酸菌其 β-半乳糖苷酶活性
經過模擬胃腸道條件作用後的菌體之β-半乳糖苷酶活性如表 4.4 所 示。表中的數值是在假設同條件作用下的菌體受損程度相同的前提下，
將所得之活性值除以表 4.3 所得之存活率，比較各組總菌數均為初始菌
數 6.7×108 CFU/ml mix 時的 β-半乳糖苷酶活性，其中以未經模擬消化 道環境條件作用之菌體測得的數值作對照，比較菌體細胞膜受損程度。
結果顯示以 pH 3 之酸液作用後，隨著作用之膽鹽濃度增加，最後測得
的β-半乳糖苷酶活性亦隨之增加，其中游離態菌體的酵素活性顯著高於
二試驗組，顯示其菌體細胞膜之損傷顯著高於包埋的組別；在 pH 2 酸
液作用的部份，與表4.3 對照可知 F 組與 A 組並無菌體存活，但於此試 驗中仍可檢測到些許酵素活性，推測已死亡的菌體無法表現其酵素活 性，未死亡但損傷嚴重的菌體其酵素尚具有活性但菌體應已失去繁殖的 能力，故於存活率試驗中無菌體存活卻仍檢測到些微的酵素活性。
菌體細胞膜上的雙層磷脂質結構對進出之物質具有高度的選擇 性，但菌體會因為細胞膜損傷而增加膜的通透性(de Valdez et al., 1997;
Noh and Gilliland, 1993)，使測得之 β-半乳糖苷酶活性隨著膜通透性增加
表4.4、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時，接著在模擬結腸液 中作用一小時並釋出後的β-半乳糖苷酶活性(μmol/10 min．ml)
Table 4.4 β-galactosidase activity (μmol/10 min．ml) of immobilized and free L. reuteri after the treatment of pH 2, 3 for 3 hr, then with bile salt of 0.1, 0.5, 1% concentration for 3 hr, and finally released in simulated colon fluid for 1 hr.
pH 2 pH 3
Material Control*
0.1% bile 0.5% bile 1% bile 0.1% bile 0.5% bile 1% bile Free (F; control) 0.066 x 0.008 bx 0.013 bx 0.052 bx 1781.769 ax 194176.592 ay 338656.801 az
Alginate (A; Test 1) 0.066 x 0.023 bx 0.095 bx 0.160 bx 16.850 bx 1906.229 by 7585.133 bz
Chitosan-alginate (CA; Test 2) 0.066 x 558.554 ax 6780.474 ay 58144.768 az 9.668 bx 964.351 bx 4530.215 bxy
* Control: β-galactosidase activity without the treatment of acid, bile salt and simulated colon fluid.
a-b Different letters within the same column significantly differ at the 5% level, n=3.
x-z Different letters within the same row are significantly differ from the control at the 5% level, n=3.
1989)。許多研究證實膽鹽會分解細胞膜上的脂質雙層結構，破壞細胞膜 (Adamowicz et al., 1991; Flahaut et al., 1996; Taranto et al., 2003)而增加細 胞膜的通透性，Taranto 等(2006)即以 L. reuteri CRL 1098 為試驗菌株，β-半乳糖苷酶活性作為細胞內標記，探討不同的膽鹽濃度對細胞膜通透性 的影響，結果發現隨著膽鹽濃度的增加，測得的酵素活性亦隨之增加，
本研究也發現類似的結果。
第3節 釋出之乳酸菌的吸附性
以Caco-2細胞株模擬腸道細胞，試驗經過模擬胃腸道條件作用後之 L. reuteri對Caco-2細胞的吸附率。圖4.2是以倒立式顯微鏡觀察Caco-2細
胞繼代培養後的生長情形與細胞單層膜的完整性。繼代培養的第0天(圖 4.2-A)可觀察到細胞呈現圓點狀且未貼附於培養皿上，第七天(圖4.2-B) 時細胞呈現扁平狀且於培養皿壁上貼附和增生，第十四天(圖4.2-C)時細 胞於培養皿中增長約八分滿並開始分化，第二十一天(圖4.2-D)時細胞長
滿培養皿且完成分化，吸附性試驗所使用之細胞單層膜即為繼代培養二 十一天後的Caco-2細胞。經模擬胃腸道條件作用後之L. reuteri對Caco-2 細胞的吸附率結果如表4.5所示，結果顯示菌體經pH 3酸液、0.1%膽鹽及
圖4.2、Caco-2 細胞繼代培養後之生長型態 (放大倍率 40 x) (A)第0天; (B)第7天; (C)第14天; (D)第21天
Fig. 4.2 Growth type changes of Caco-2 cells during period subculture (40 x magnification)
(A) day 0; (B) day 7; (C) day 14; (D) day 21
A B
C D
表4.5、固定化與游離態 L. reuteri 經模擬胃腸道條件作用後對 Caco-2 細 胞的吸附率(%)
Table 4.5 Adherence rate (%) of immobilized and free L. reuteri treated with simulated gastrointestinal conditions using the Caco-2 cell test model
Material Adherence rate (%) Free (F; control) 0.275a
Alginate (A; Test 1) 0.360b Chitosan-alginate (CA; Test 2) 0.524c
a-c Means followed by different superscript lowercases are significantly different from each other at 5% level, n=3.
(0.275%) < 褐藻酸鈣組(0.360%) < 幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質組 (0.524%)，經過含固定化菌體的二試驗組其吸附率和游離態菌體組相比 是顯著較高的(p < 0.05)。
益生菌必須具有吸附於腸道細胞的能力，吸附定殖於腸道後才能發
益生菌必須具有吸附於腸道細胞的能力，吸附定殖於腸道後才能發