固定化對羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)菌體在模擬胃腸道條件作用下之保護效果與菌體釋出後之益生特性; Protective effects of immobilization on Lactobacillus reuteri in simulated gastrointestinal conditions and probiotic properties of the released bacteria

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(1)中國醫藥大學營養學系碩士班碩士論文. 固定化對羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) 菌體在模擬胃腸道條件作用下之保護效果與菌體釋出後之益生特性 Protective effects of immobilization on Lactobacillus reuteri in simulated gastrointestinal conditions and probiotic properties of the released bacteria. 研究生：湯宜儒撰指導教授：曾政鴻博士. 中華民國九十七年七月.

(2) 中文摘要包含羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)在內之多種乳酸菌能夠助益人體健康。經人攝取後的乳酸菌，受到人體消化道內胃酸、膽鹽的作用，到達下消化道之存活菌數並不高，因而無法吸附定殖以發揮其益生效用。本研究欲以兩種固定化材質—褐藻酸鈣(Ca-alginate)和幾丁聚醣褐藻酸鈣複合材質 (Chitosan-Ca-alginate complex material) 來包埋 L. reuteri。依據固定化材質的特性將試驗組分成兩組，即褐藻酸鈣組(A 組) 和幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質組(CA 組)，而未經包埋的游離態 L. reuteri 菌體作為控制組並設為 F 組。研究探討固定化與游離態 L. reuteri 經模擬人體胃腸道條件之酸與膽鹽作用後，以及固定化菌體於模擬結腸液中自膠球溶離釋出後的存活率，再以 Caco-2 細胞作為生體外試驗之模式檢測釋出之菌體的吸附率、拮抗性、安全性等多方面基礎益生特性，並分析 L. reuteri 之 β-半乳糖苷酶活性以證實模擬胃腸道環境條件對菌體細胞膜之影響。結果顯示固定化能提高 L. reuteri 菌株經模擬人體胃腸道條件作用後的存活率，其中又以幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質保護菌體的結果較佳(p < 0.05)。菌體經相同 pH 值之酸液作用後，隨著膽鹽濃度增加，β半乳糖苷酶的活性也隨之增加，顯示菌體細胞膜之受損程度也隨之增加，但是經包埋的 LAB 菌體細胞膜受到酸與膽鹽的損傷則比游離態菌 I.

(3) 體輕微。游離態與自膠球釋出的 L. reuteri 其吸附率依下列順序遞減：幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質(0.524%)＞褐藻酸鈣(0.360%)＞游離態菌體 (0.275%)，意即自膠球釋出的菌體有較好的吸附能力。在拮抗病原菌的結果方面，三組經過模擬胃腸道條件作用後的菌體仍保有拮抗 Listeria monocytogenes 的能力，且經固定化後釋出的菌體其拮抗能力優於游離態菌體。侵入性試驗的結果則顯示包埋後釋出的菌株具有安全性。因此固定化不但可提高 L. reuteri 菌體通過模擬胃腸道環境條件之存活率，減少菌體細胞膜的受損程度，菌體在釋出後仍保有吸附力且能有效拮抗病原菌等益生特性。. 關鍵詞：固定化、褐藻酸鈣、幾丁聚醣-褐藻酸鈣複合材質、乳酸菌、羅伊氏乳桿菌、益生特性. II.

(4) Abstract Many species of lactic acid bacteria (LAB) like Lactobacillus reuteri can benefit the human health. The survival of the ingested LAB may be decreased when arriving at the lower digestive tract due to the gastric acid and bile salts existed in the gastrointestinal system. In this study, two immobilization materials–Ca-alginate and chitosan-Ca-alginate were used to encapsulate L. reuteri. Based on the characterictics of immobilization materials, the experimental groups were divided into two, i.e. Ca-alginate group (A group) and chitosan-Ca-alginate complex material group (CA group). The group of free L. reuteri cells without encapsulation was the control group and designated as the F group. The survival rate of L. reuteri after the treatment of simulated gastrointestinal conditions, as well as that of the released cells of the entrapped L. reuteri in the simulated colon fluid were investigated. The adherence rate, antagonistic activity and safety property of the released bacteria using Caco-2 cell as the in vitro test model were determined, and β-galactosidase activity manifesting the effect of simulated gastrointestinal conditions on the bacterial cell membrane was also analyzed. Results showed that immobilization increased survival rate of L. reuteri after the treatment of simulated gastrointestinal conditions with the CA group had a better protective effect (p < 0.05). Analysis for β-galactosidase activity revealed that the injury of L. reuteri cell membrane raised with the increased bile salt concentration at the same pH values, and the injury of the encapsulated LAB cell membrane caused by acid and bile. III.

(5) salt was less than the free LAB. Adhesive rates of the released L. reuteri showing the adhesiveness ability expressed in descending order, were CA group (0.524%) > A group (0.360%) > F group (0.275%) – i.e. the bacteria released from gel beads had higher adherence trait. All of the three groups of L. reuteri treated with simulated gastrointestinal conditions retained the antagonistic ability against Listeria monocytogenes with the released LAB from both immobilization materials exhibiting higher inhibition ability than free LAB. The result of invasion test indicated that the released LAB cells were safe in vitro. This research suggestes that immobilization not only can enhance the survival of L. reuteri treated with simulated gastrointestinal conditions, decrease the injury of cell membrane, but also retains the probiotic characteristics of adhesiveness and antagonistic activity. Key words: Immobilization, Ca-alginate, Chitosan-Ca-alginate complex material, Lactic acid bacteria, Lactobacillus reuteri, Probiotic properties. IV.

(6) 致謝光陰似箭，歲月匆匆流逝，進研究所彷彿只是不久前的事，眨眼間即將劃下句點。這兩年來，要特別感謝恩師曾政鴻博士在學術與研究方面的指導以及在待人處事上的教誨，給予的訓練與磨練都讓我學習並成長不少，亦感謝老師在撰寫論文期間的指導與修正，使我能順利完成論文，感恩之心，永銘於衷。文稿初成，感謝口試委員周正俊教授、陳錦樹教授、金安兒教授於百忙之中撥冗校閱，並於口試時悉心指正，對於論文的諸多寶貴建議使之更臻充實，於此謹向委員致以最誠摯的謝意。在學的這段期間，歷經許多困難、挫折，如今論文得以完成，由衷的感謝本系所師長及學姊馨儀在課業及實驗上的指導；同窗好友瑜妏、智聖及研究所同學的幫忙；學妹欣茹、美嘉及其他學弟妹的陪伴；好友們—婉薇、阿杏、阿瓜、宥驊、佩婷、詠文、小元在艱辛的研究過程中給予的鼓勵與打氣；中興大學貴儀中心的林婉玉小姐在 SEM 照相上的協助，以及許多幫助過我的人，因為有你們我才能順利地走到這裡。最後要特別感謝我的家人，在我低潮的時候給予我鼓勵與安慰，包容我的一切，你們的關懷與支持是我繼續堅持的原動力。謹此將本論文獻給所有關心及幫助過我的人，感謝你們。 V.

(7) 目次中文摘要.......................................................................................................................... I Abstract ..........................................................................................................................III 致謝.................................................................................................................................V 目次................................................................................................................................VI 表目錄............................................................................................................................IX 圖目錄............................................................................................................................. X 第一章前言....................................................................................................................1 第二章文獻探討............................................................................................................5 第 1 節腸道微生物....................................................................................................5 1.1 腸道菌相分佈...................................................................................................5 1.2 影響腸道菌相之因子.......................................................................................6 1.3 腸道微生物與宿主的關係...............................................................................9 第 2 節益生菌(Probiotics)介紹 .................................................................................9 2.1 益生菌應具備的條件......................................................................................10 2.2 益生菌的健康功效..........................................................................................12 2.3 益生菌的應用..................................................................................................25 第 3 節乳酸菌介紹..................................................................................................27 3.1 乳酸菌的分類..................................................................................................28 3.2 乳酸菌作為益生菌之特性..............................................................................30 3.3 乳酸菌的應用..................................................................................................36 3.4 羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)..............................................................38 第 4 節固定化介紹..................................................................................................38 4.1 固定化技術......................................................................................................38 4.2 細胞固定化......................................................................................................45 4.3 益生菌的包埋..................................................................................................47 4.3.1 益生菌的包埋技術...................................................................................47 4.3.2 包埋材質之選擇條件...............................................................................49 4.3.3 褐藻酸鈉...................................................................................................52 4.3.4 幾丁聚醣...................................................................................................54 第 5 節乳酸菌胃腸道耐受性研究..........................................................................57 5.1 游離態及固定化乳酸菌的耐酸性研究..........................................................58 VI.

(8) 5.2 游離態及固定化乳酸菌之膽鹽耐受性研究..................................................59 5.3 包埋菌體的釋出..............................................................................................60 第 6 節 Caco-2 細胞株作為乳酸菌之生體外吸附試驗模式 .................................61 第 7 節乳酸菌對李斯特菌之競爭排除作用..........................................................62 7.1 單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)之介紹 .............................62 7.2 李斯特菌之致病機轉......................................................................................65 7.3 乳酸菌之競爭排除作用..................................................................................66 第 8 節乳酸菌之 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性 ..........................................68 第 9 節乳酸菌之安全性評估..................................................................................68 第 10 節研究動機....................................................................................................70 第 11 節研究目的 ....................................................................................................72 第三章材料與方法......................................................................................................73 第 1 節研究設計架構..............................................................................................73 第 2 節實驗材料......................................................................................................73 2.1 使用菌株.........................................................................................................73 2.2 活化菌株之培養基.........................................................................................73 2.3 保存菌株之冷凍培養基.................................................................................75 2.4 使用之細胞株.................................................................................................75 2.5 培養細胞株之培養基.....................................................................................75 2.6 保存細胞株之冷凍培養基.............................................................................75 2.7 菌體固定化之材料.........................................................................................76 2.7.1 褐藻酸鈣的菌體固定化..........................................................................76 2.7.2 幾丁聚醣-褐藻酸鈣的菌體固定化.........................................................76 2.8 模擬胃腸道條件作用之耐受性試驗材料.....................................................76 2.8.1 酸液與牛膽鹽之連續性試驗..................................................................76 2.8.2 經酸液、牛膽鹽連續作用後於模擬結腸液之釋出試驗......................76 2.9 β-半乳糖苷酶活性試驗之材料.......................................................................77 2.10 吸附性試驗之材料.......................................................................................77 2.11 拮抗病原菌吸附試驗之材料 .......................................................................77 2.12 安全性評估試驗之材料...............................................................................77 第 3 節實驗菌株前處理..........................................................................................77 3.1 菌株之活化.....................................................................................................77 3.2 冷凍保存.........................................................................................................78 第 4 節細胞培養......................................................................................................78 4.1 冷凍細胞之活化.............................................................................................78 4.2 細胞之繼代培養.............................................................................................79 VII.

(9) 4.3 細胞株之冷凍保存.........................................................................................79 4.4 細胞染色與計數.............................................................................................80 4.5 細胞單層膜之培養.........................................................................................80 第 5 節菌體的固定化..............................................................................................81 5.1 褐藻酸鈣之菌體固定化.................................................................................81 5.2 幾丁聚醣-褐藻酸鈣的菌體固定化................................................................81 5.3 固定化菌株之電子顯微鏡觀察.....................................................................82 第 6 節 L. reuteri 於模擬胃腸道條件作用之耐受性試驗......................................82 6.1 酸液與牛膽鹽連續作用後之存活率試驗.....................................................82 6.2 經酸液、牛膽鹽連續作用後於模擬結腸液釋出之試驗.............................84 第 7 節自膠球釋出之乳酸菌之 β-半乳糖苷酶活性試驗......................................85 第 8 節自膠球釋出之乳酸菌的吸附性試驗..........................................................86 第 9 節 L. reuteri 拮抗病原菌吸附之試驗..............................................................87 9.1 游離態 L. reuteri 取代 L. monocytogenes 吸附於模擬腸道細胞之試驗 (therapeutic effect of adherence inhibition)-控制組 .................................................87 9.2 固定化 L. reuteri 取代 L. monocytogenes 吸附於模擬腸道細胞之試驗 (therapeutic effect of adherence inhibition)-試驗組 .................................................89 第 10 節菌株之安全性評估....................................................................................90 第 11 節統計分析 ....................................................................................................92 第四章結果與討論......................................................................................................93 第 1 節 L. reuteri 於模擬胃腸道環境條件作用下之耐受性..................................93 第2節第3節第4節第5節. 釋出之乳酸菌其 β-半乳糖苷酶活性........................................................101 釋出之乳酸菌的吸附性............................................................................103 釋出之乳酸菌對病原菌之拮抗性............................................................107 釋出之乳酸菌之安全性評估.................................................................... 111. 第五章結論................................................................................................................ 114 參考文獻...................................................................................................................... 116. VIII.

(10) 表目錄表 2.1、影響胃腸道微生物菌相之因子 ...........................................................................8 表 2.2、益生菌篩選應考慮的條件 ................................................................................. 11 表 2.3、益生菌的功效及其可能的機轉 .........................................................................14 表 2.4、目前研究發表及市售產品中具代表性之益生菌菌株 .....................................26 表 2.5、乳酸菌各屬的生長與發酵特性 .........................................................................29 表 2.6、最常用於益生菌製品的乳酸菌 .........................................................................37 表 2.7、各種固定化方法的優缺點比較 .........................................................................44 表 2.8、益生菌微膠囊包埋的優點 .................................................................................48 表 2.9、擠壓與乳化技術的優缺點 .................................................................................51 表 4.1、固定化與游離態 L. reuteri 分別以 pH 2、3 之酸液作用三小時後的存活菌數(log CFU/ ml mix)與存活率(%)...........................................................................................95 表 4.2、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時後的存活菌數(log CFU/ ml mix)與存活率(%) ...........................................96 表 4.3、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時，接著在模擬結腸液中作用一小時並釋出後的存活菌數(log CFU/ ml mix) 與存活率(%) .................................................................................................................97 表 4.4、固定化與游離態 L. reuteri 以 pH 2、3 之酸液與 0.1、0.5、1%之膽鹽分別處理 3 小時，接著在模擬結腸液中作用一小時並釋出後的 β-半乳糖苷酶活性(μmol/10 min．ml) .....................................................................................................................102 表 4.5、固定化與游離態 L. reuteri 經模擬胃腸道條件作用後對 Caco-2 細胞的吸附率 (%) ...............................................................................................................................105 表 4.6、固定化與游離態 L. reuteri 經模擬胃腸道條件作用後侵入 Caco-2 細胞的百分比(%) ........................................................................................................................... 113. IX.

(11) 圖目錄圖 2.1、人類胃腸道不同部位之菌群分佈 .......................................................................7 圖 2.2、益生菌的健康功效 .............................................................................................13 圖 2.3、Th1 與 Th2 的免疫反應 .....................................................................................18 圖 2.4、益生菌調節免疫反應之抗過敏機制 .................................................................19 圖 2.5、血壓調控機制 .....................................................................................................23 圖 2.6、目前已發現且國際已認同的乳酸菌屬 .............................................................31 圖 2.7、在厭氣狀態下代謝 glycerol 產生 reuterin.........................................................34 圖 2.8、固定化方法 .........................................................................................................40 圖 2.9、菌體以擠壓及乳化方式包埋的流程圖 .............................................................50 圖 2.10、褐藻酸的化學結構 ...........................................................................................53 圖 2.11、纖維素、幾丁質、幾丁聚醣之化學結構 .......................................................56 圖 2.12、Caco-2 細胞生長分化過程之電子顯微鏡圖...................................................63 圖 2.13、單核球增多性李斯特菌(L. monocytogenes)的感染機制................................67 圖 2.14、β-半乳糖苷酶對乳糖及 ONPG 作用情形 .......................................................69 圖 2.15、致病菌侵襲腸道上皮細胞過程 .......................................................................71 圖 3.1、實驗設計架構 .....................................................................................................74 圖 3.2、L. reuteri 菌體於模擬胃腸道條件作用下之耐受性試驗 .................................83 圖 3.3、β-半乳糖苷酶活性之標準曲線 ..........................................................................86 圖 3.4、乳酸菌之侵入性試驗流程 .................................................................................91 圖 4.1、含固定化菌體膠球之掃描式電子顯微鏡圖 .....................................................94 圖 4.2、Caco-2 細胞繼代培養後之生長型態...............................................................104 圖 4.3、L. reuteri 取代螢光染色之 L. monocytogenes 對 Caco-2 細胞吸附之試驗結果 .....................................................................................................................................108 圖 4.4、L. reuteri 取代螢光染色 L. monocytogenes 吸附之螢光顯微照相圖 ............109. X.

(12) 第一章前言近年來隨著經濟水準的提高，改變了現代人的生活型態，卻也使得腸道疾病發生率快速的增加中，因此國人開始重視益生菌(probiotics)的利用及其對身體的保健功效。1991 年 Huis in’t veld 和 Havenaar 將益生菌定義為“給予人類或動物某一種或多種微生物時，可經由改善宿主腸道微生物相平衡而增進宿主健康的活菌” (Guarner and Schaafsma, 1998; Marteau and Boutron-Ruault, 2002; O’Sullivan et al., 1992)，而目前常用之益生微生物主要為乳酸桿菌、酵母菌及真菌(Sanders, 1999; Tannock, 2001)，其中最常應用於人體的即是乳酸菌(lactic acid bacteria)，乳酸菌是能利用碳水化合物發酵產生乳酸之細菌的總稱，為一般公認安全 (generally recognized as safe, GRAS)的菌株(Tsai et al., 2004)。乳酸菌是天然存在於人體的腸道菌群之一，其於腸道中的生長菌量、生長型態、吸附特性及宿主的個別差異均會影響菌株對宿主的益生作用，當乳酸菌能通過胃腸道作用而定殖吸附於宿主之腸道中，即可形成一道防禦且阻止病原菌的侵入(Reid, 2000; Resta-Lenert and Barrett, 2003; Servin and Coconnier, 2003)；或與病原菌競爭營養源，亦或是產生益菌代謝物，如產生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFAs)或乳酸以降低 pH 值(陳， 1991)、產生抑菌素(呂等，2003)等能抑制病原菌生長與抵抗病原菌侵襲 1.

(13) 的物質(Ouwehand et al., 2000)，進而達到增進宿主健康的效用。如前所述，以乳酸菌為主要來源菌種的益生菌具有多種有益人體的益生功效，因此如何使所攝取的菌株能順利到達腸道並吸附定殖以發揮其益生效用，實為探討乳酸菌對人體益生特性的重要課題。依前人之研究，欲增加菌株在通過胃、腸道時之存活率，大抵有三種操作方法。一為選擇胃酸與膽鹽耐受性高的菌株(Tsai et al., 2005)；二為選擇產孢性乳酸菌(spore-forming lactic acid bacteria, SFLAB)，藉由孢子對酸與膽鹽的抗性以保存菌株活性(Doores and Westhoff, 1983; Huang et al, 2007; Hyronimus et al., 2000)。第三種方法為使用細胞固定化技術將乳酸菌株包埋於固定化材料中(Doleyres et al., 2004; Tsen et al., 2004; Yu et al., 2002)，以耐酸與耐膽鹽材質來增加包埋於其中的菌株的存活。上述三種方法中，尤以細胞固定化技術更能提高菌株的存活率，而能增加人類對乳酸菌株種類之選擇與利用。細胞固定化(cell immobilization)是利用合適的擔體以結合、架橋或包埋等方式，將微生物菌體作空間上的限制，以便加以有效利用(Jen et al., 1996)，因此在各方面的應用日漸增加 (Norton and Voillemard, 1994)。經固定化後的細胞在培養過程中可以得到較高的菌體濃度，且亦能受到所用擔體的保護；具有貯藏性佳、回收容易、耐用性、穩定性、作用效率高，以及對溫度、毒性物質、pH 等外. 2.

(14) 界環境條件的耐受性強等優點(Leon, 1998; Champagne et al., 1992)；亦具有能提高產率、連續化操作、促進二級代謝產物之排泄、防止界面失活 (interfacial inactivation)、增加質體攜帶細胞(plasmid-bearing cells)之貯留以及抵抗液體環境中之亂流干擾等作用(Nath and Chand, 1996)。另一方面，細胞固定化能有效提高細胞濃度與加工過程中細胞之存活以及操作效率(Tsen et al., 2002)。因此目前在食品、醫藥、環保、生物等產業方面甚受重視(Leon et al., 1998)；此外，將保健飲料中的乳酸菌利用膠體加以包埋，亦能有效提升其對胃酸及膽鹽等的耐受性，從而提高其在人體腸道中的存活率與活性(Lee and Heo, 2000; Maitrot et al., 1997; Sun and Griffiths, 2000; Yoon et al., 1995)。故包埋材質與固定化方法對菌株在通過胃、腸道時的存活率影響極大(Chan and Zhang, 2005)。此外，所選用之固定化材料應該要在胃酸與膽鹽等不利乳酸菌生存的作用因子存在條件下不致溶解方能發揮其保護菌體之功用，亦須能在下消化道中溶解於腸液而釋出菌體(Anal et al., 2003; Anal and Singh, 2007; Anal and Stevens, 2005) ，使所攝取之益生菌能吸附於腸黏膜上發揮其拮抗 (antagonistic)病原菌的功效。現今大部份關於乳酸菌生體外(in vitro)之耐酸性、耐膽鹽、腸道細胞吸附性和拮抗病原菌等試驗多是以酸與膽鹽分別進行之非連續作用. 3.

(15) 之模擬胃腸道條件，或是直接以未經胃腸道條件作用之菌體來進行探討 (Chou and Weimer, 1999; Dunne et al., 2001; Fernández et al., 2003)，但食物於胃腸道消化的過程實為一連續的作用，目前乳酸菌之生體外試驗很少有文獻研究經酸與膽鹽連續作用後之固定化菌體，是否仍保有吸附於腸道細胞之能力或其他的基礎益生特性。故本研究欲以褐藻酸鈣 (Ca-alginate) 和幾丁聚醣 - 褐藻酸鈣複合材質 (Chitosan-Ca-alginate complex material)來包埋固定化 Lactobacillus reuteri，探討膠球中之 L. reuteri 經模擬人體胃腸道之酸與膽鹽作用後，菌體於模擬結腸液中溶離釋出之存活率，再以 Caco-2 細胞模擬腸道細胞，以生體外試驗模式研究釋出之 L. reuteri 對腸道細胞吸附性、對 Listeria monocytogenes 的拮抗性、益生菌之安全性等多方面基礎益生特性，同時探討模擬胃腸環境條件對游離態與固定化 L. reuteri 菌體細胞膜影響之差異性。. 4.

(16) 第二章文獻探討第1節腸道微生物胎兒在出生前，相當於處在無菌的環境中，所以剛出生嬰兒所排的糞便通常是無菌的，但出生 3-4 小時後就會有微生物出現定殖於腸內，如：鏈球菌(Streptococcus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens)、乳酸桿菌(Lactobacillus)等。哺餵母乳的嬰兒於出生第三天後腸道開始出現雙歧桿菌(Bifidobacterium)，出生 4-7 天後 Bifidobacterium 的生長最佔優勢，成為腸道之主要菌群。離乳後的幼兒腸道菌群變得和成年人相近，以革蘭氏陰性菌佔優勢，此時期為一較穩定菌相，一旦邁入老年期，Bifidobacterium 會大幅減少而使得病原菌或腐敗菌如 Clostridium、Streptococcus 等顯著增加(Arunachalam, 1999; He et al., 2001)。. 1.1 腸道菌相分佈人體胃腸道菌相為一複雜之微生物生態系統，存在有 400 多種不同的菌株，菌體間存在共生或互利共生的關係。胃部因為分泌的胃酸造成一低 pH 值(pH < 3.0)之環境，使得微生物不易生長，大約只有 101-103. 5.

(17) CFU/ml 的菌數，主要菌相為 Lactobacillus、Streptococcus 及酵母菌。小腸內菌數約為 104-108 CFU/ml，主要的菌種有 Lactobacillus、Streptococcus 及腸內細菌科(Enterobacteriaceae)等兼性厭氧菌和 Bifidobacterium、類細菌屬(Bacteroides)及細梭菌(Fusobacteria)等絕對厭氧菌。在大腸中存在的菌相最複雜亦含有最多的菌數，約為 1010-1012 CFU/ml ，以 Bifidobacterium、Bacteroides、Clostridium 和 Fusobacteria 等絕對厭氧菌為優勢菌群，其他則由酵母菌、 Streptococcus 、 Lactobacillus 、 Enterobacteriaceae 等兼性厭氧菌構成次要菌群(Holzapfel et al., 1998; Simmering and Blaut, 2001) (圖 2.1)。. 1.2 影響腸道菌相之因子人類與腸內細菌的共生關係相當複雜，宿主的生理狀態不佳、飲食習慣、環境改變、藥物、壓力或老化等因子都有可能會破壞宿主的腸道菌相，使有益菌減少，壞菌增加，進而影響腸道生理。Holazpfel 等(1998) 將可能影響胃腸道微生物菌相之因子分為四大類：(1)宿主生理狀態的變化：如壓力、老化、健康狀態等；(2)微生物本身之因素：如吸附性、運動性、營養適應性等；(3)微生物之間的交互作用：如微生物間的協同作用、拮抗、刺激作用等；(4)飲食因素：如食物、藥物等，如表 2.1 所示。. 6.

(18) Stomach and Duodenum (101-103 CFU/ml) Lactobacilli Streptococci Yeasts Jejunum and Ileum (104-108 CFU/ml) Lactobacilli Bacteroides Enterobacteriaceae Bifidobacteria Streptococci Fusobacteria Colon (1010-1012 CFU/g) Bacteroides Clostridia Peseudomonas Bifidobacteria Veillonella Yeasts Streptococci Lactobacilli Protozoa Fusobacteria Proteus Enterobacteriaceae Staphylococci. (Holzapfel et al., 1998). 圖 2.1、人類胃腸道不同部位之菌群分佈 Fig. 2.1 Distribution of microbes in the human gastro-intestinal tract. 7.

(19) 表 2.1、影響胃腸道微生物菌相之因子 Table 2.1 Factors affecting the microflora of the gastrointestinal tract 1. Host mediated factors pH, secretions such as immunoglobulins, bile, salts, enzymes Motility, e.g. speed, peristalsis Physiology, e.g. compartmentalization Exfoliated cells, mucins, tissue exudates 2. Microbial factors Adhesion Motility Nutritional flexibility Spores, capsules, enzymes, antimicrobial components Generation time 3. Microbial interactions Synergy Metabolic cooperation Growth factors and vitamin excretion Changes to Eh, pH, O2 tension Antagonism/stimulation Short-chain fatty acids, amines Changes to Eh, pH, O2 tension Antimicrobial components, siderophores Nutritional requirements, etc. 4. Diet Composition, non-digestible fibers, drugs, etc. (Holzapfel et al., 1998). 8.

(20) 1.3 腸道微生物與宿主的關係在正常情況下，腸道微生物會與人體保持平衡的狀態，當腸道菌群中以有益菌呈優勢時，這些有益菌產生之酸性代謝物會抑制病原菌生長，亦能促進腸道細胞蠕動和使上皮細胞增生，以達到腸道淨化且維持健康的效果。一旦腸內菌相失去平衡，即病原菌或腐敗菌呈優勢，則會產生許多含氮廢物及致癌相關物，而對人體產生危害。而腸道微生物對人體有益的功效有：(1)合成維生素或其他營養素，如維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、生物素、葉酸、吡多醇(pyridoxine)等營養素，可作為人體或動物另一養分來源 ( 楊， 1998 ； Holzapfel and Schillinger, 2002)；(2)在腸黏膜表面形成生物屏障，可抑制病原菌定殖於黏膜上而造成感染(Rinkinen et al., 2003; Servin and Coconnier, 2003; Tasi et al., 2004)；(3)產生細菌素等抑菌物質以殺死或抑制病原菌生長(呂， 2003；Vollenweider et al., 2003)；(4)刺激宿主免疫系統，活化免疫細胞，提高人體免疫力(林，2004；Hatakka et al., 2001; Najat et al., 2002)；(5) 降低腸腔酸鹼度，抑制有毒物質或致癌物生成，或使致癌物轉變成非致癌物等(徐，2005)。. 第2節益生菌(Probiotics)介紹 9.

(21) 近年來隨著經濟水準的提高以及對身體保健的重視，益生菌的觀念和重要性日益受到重視(Hammes and Hertel, 2002; Marteau et al., 2001)。 1991 年 Huis in’t veld and Havenaar 將 probiotics 定義為“給予人類或動物某一種或多種微生物時，可經由改善宿主腸道微生物相平衡而增進宿主健康的活菌” (Guarner and Schaafsma, 1998; Marteau and Boutron-Ruault, 2002; O’sulli-van et al., 1992)，此定義至今廣泛為國際上所接受。益生菌主要是乳酸菌、鏈球菌、真菌類以及一些酵母菌等(Fuller, 1992; Tannock, 2001)。. 2.1 益生菌應具備的條件對於益生菌基本性質之探討與了解，以及其應用於人類保健效能之評估，具有十分重要之意義。完善有效的益生菌應具備如表 2.2 中所述之條件，包括(1)為人類來源；(2)具有胃酸、膽鹽耐受性；(3)具有良好的腸道吸附性與定殖能力；(4)對宿主提供有益的健康功效，如優異的競爭性、能夠有效排除並抑制病原菌生長、增進免疫調節的能力等；(5) 顧客接受性；(6)臨床試驗證實具有健康功效等(黃，2004；Sarrela et al., 2002)。. 10.

(22) 表 2.2、益生菌篩選應考慮的條件 Table 2.2 Properties of probiotics to be assessed during the development of new probiotic functional foods Property Strain specificity. Target and method Source or origin to be assessed.. Resistance to pH. Model systems for gastric and bile effects.. Adhesion and colonization. Several model systems to be used for adhesion (e.g. cell culture, mucus, intestinal segments). Adhesion and competitive exclusion of pathogens in vitro and in vivo model systems. In vitro and human studies.. Competitive exclusion. Immune regulation Safety. Pre-market clearance and post-market surveillance.. Technological properties. Various systems for stability and activity throughout the processes.. Sensory assessment. Sensory testing of model and final products.. Consumer acceptance. Consumer studies on product formulations.. Efficacy assessment. Human clinical intervention studies with final product formulations; at least two independent studies to show efficacy in target populations and safety in all consumer groups. (Saarela et al., 2002). 11.

(23) 2.2 益生菌的健康功效益生菌對人體的健康功效主要分為三大部分：(1)維持正常腸道菌相；(2)免疫調節作用；(3)代謝作用，如圖 2.2 所示。這些健康功效及其可能機轉則如表 2.3 所示，並分別敘述如下： (1)改善乳糖消化菌體對於乳品中的乳糖可產生乳糖酶(lactase)來進行預發酵，進而降低乳品中的乳糖含量，並可維持其活性至腸內作用，以幫助體內乳糖的消化。故可改善患有先天性腸黏膜 β-半乳糖苷酶缺乏症所造成之乳糖消化性障礙；亦可增進因腸疾而使乳糖酶活性不足者對乳品的耐受性(de Vrese et al., 2001; Rizkalla et al, 2000)。. (2)降低癌症發生率現代人飲食習慣西化，攝取過多的肉類與脂肪，膳食纖維攝取少，使得腸內的益生菌數量減少，而類細菌與產氣莢膜梭菌等數量增加。乳酸桿菌及雙歧桿菌具有降低不正常黏膜突間叢聚(aberrant crypt foci)的現象(Reddy and Rivenson, 1993)，由於可抑制腸內有害菌生長，因而可減少有害菌所分泌的黏蛋白酶 (mucinase) 、 β- 葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)、硝基還原酶(nitroreductase)、β-葡萄糖醛酸苷酶 12.

(24) (Parvez et al., 2006) 圖 2.2、益生菌的健康功效 Fig. 2.2 Proposed health effect of probiotics. 13.

(25) 表 2.3、益生菌的功效及其可能的機轉 Table 2.3 Potential and established effects of probiotic bacteria Target health benefit Aid in lactose digestion. Postulated mechanism Bacterial lactase hydrolyses lactose. Resistance to enteric pathogens. Secretory immune effect Colonization resistance Alteration of intestinal conditions to be less favorable for pathogenicity (pH, short chain fatty acids, bacteriocins) Alteration of toxin bindings sites Influence on gut flora populations Adherence to intestinal mucosa, interfering with pathogen Upregulation of intestinal mucin production, interfering with pathogen attachment to intestinal epithelial cells. Anti-colon cancer effect. Mutagen binding Carcinogen deactivation Inhibition of carcinogen-producing enzymes of colonic microbes Immune responses Influence on secondary bile salt concentration. Small bowel bacterial overgrowth. Influence on activity of overgrowth flora, decreasing toxic metabolite production Alteration of intestinal conditions to be less favorable to overgrowth flora activities or populations. Immune system modulation. Strengthening of non-specific defense against infection and tumors Adjuvant effect in antigen-specific immune responses Enhancement of secretory IgA production. Allergy. Prevention of antigen translocation into blood stream. Blood lipids, heart disease. Assimilation of cholesterol within bacterial cell Increased excretion of bile salts due to deconjugation by bile salt hydrolase Antioxidative effect. Antihypertensive effect. Peptidase action on milk protein yields tripeptides which inhibit angiotensin Ι- converting enzyme Cell wall components acts as angiotensin converting enzyme inhibitors. Urogenital infections. Adhesion to urinary and vaginal tract cells Colonization resistance Inhibitor production (H2O2, biosurfactants). Infection caused by Helicobacter pylori. Production of inhibitors of H. pylori (lactic acid and others). Hepatic encephalopathy. Inhibition of urease-producing gut flora. (Sanders, 1999) 14.

(26) (β-glucuronidase)及尿素酶(urease)等所催化的致癌物及致突變物之代謝或活化作用(Roberfroid, 2000)。亦有研究指出乳酸菌可藉由其細胞壁上的多醣成份與致突變物質結合(Zhang and Ohta, 1991)或吸附腸內之致突變代謝產物(Zhang and Ohta, 1993)，如：azodyes、N-nitrosamines 等使之失活(楊，1996)，進而減少致癌的機會。此外，經腸道益生菌代謝所產生之短鏈脂肪酸除了可作為腸道上皮細胞之能量來源，亦可降低腸道中之 pH 值，甚至可刺激腸道上皮細胞增殖分化，其中的丁酸尚具有抑制腸道腫瘤增殖分化的功效(Prasad, 1980)，但研究顯示防治腫瘤功效上是有菌株差異性的，且不同菌株可能有不同之防癌作用機制(Rafter, 2002)。. (3)調節腸道菌相益生菌具有平衡腸道菌叢的能力，能與病原菌於腸道中競爭吸附位、營養源，並於代謝過程中產生有機酸(如：乙酸、丙酸、乳酸等)、抑菌素(bacteriocin)、過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等物質以抑制病原菌而使腸道菌叢平衡(Steer et al., 2000; Ziemer and Gibson, 1998)。有許多臨床研究證實時常服用益生菌來作為膳食補充品，能預防腸胃疾病之感染(Olivares et al., 2006; Yamano et al., 2006)，亦可將其用於腸胃疾病的. 15.

(27) 治療，如：嬰兒型腹瀉(Ouwehand et al., 2002; Shornikova et al.,1997)、旅行者腹瀉(Oksanen et al., 1990)、抗生素誘發型腹瀉(Rolfe, 2000; Siitonen et al., 1990)、由食物病原菌所引起的腹瀉(Fooks and Gibson, 2002)、預防再發性腸炎(Biller et al., 1995; Gorbach et al., 1987; Rolfe, 1995)等都具有良好成效。. (4)調節免疫力益生菌的細胞壁含有肽聚醣(peptidoglycan)，可與淋巴細胞與巨噬細胞上的肽聚醣接受器結合，進而刺激活化免疫系統，增進巨噬細胞等非特異性免疫反應(Matsuzaki et al., 1998; Neumann et al., 1998)、刺激淋巴系統產生抗體等特異性免疫反應，調節 γ-干擾素(γ-interferon, IFN-γ)分泌等相關的細胞免疫(Christensen et al., 2002; Marin et al., 1998)或增加血清抗體 IgA 含量等相關的體液免疫(Perdigón et al., 1991; Tejada-Simon et al., 1999)，以達到促進免疫排除(immune exclusion)的作用。. (5)緩和過敏現象人體的 T 淋巴球(T cell)分為兩類，一為細胞毒殺 T 淋巴球(cytotoxic T cell)，一為輔助 T 淋巴球(helper T cell)，其中輔助 T 淋巴球因分泌的. 16.

(28) 細胞素不同而分為二型，第一型 T 淋巴球(Th1 cell)主要分泌細胞間白素 - 2 (Interleukin- 2, IL- 2)和 IFN-γ，可促進細胞免疫，並使 B 淋巴球(B cell) 分泌免疫球蛋白 G 抗體(IgG)；相反的，第二型 T 淋巴球(Th2 cell)則主要分泌 IL- 4、5、6、10、13，可促進體液免疫，但使 B 淋巴球分泌免疫球蛋白 E 抗體(IgE)，Th1 cell 和 Th2 cell 之間存在著動態的平衡關係(圖 2.3)。過敏是免疫疾病的一種，是人體免疫功能失調而出現不平衡的狀況。有過敏體質的人，當過敏原進入體內，則會誘發身體免疫系統產生 Th2 cell 免疫反應，Th2 cell 會釋放 IL- 4、5、6、10、13，促使 B 細胞分泌 IgE，並黏附在肥大細胞(Mast cells)上，再遇到過敏原時，過敏原會黏附在 IgE 上，共同作用後，肥大細胞會釋放發炎介質如組織胺 (histamine)、白三稀素(leukotriene)、前列腺素(prostaglandin)和血小板活化因子等，這些發炎介質會進一步影響呼吸道產生發炎反應，導致過敏症狀發生。在 T cell 分化早期，可經由細胞激素之調控來抑制 Th2 cell 的免疫反應，如 IFN-γ 可減少 IL-4 之表現量，IFN-α 則可增加 IFN-γ 的產生，進而促進 Th1 cell 的免疫反應，降低 IgE 的產生；益生菌即是藉由增加 IFN-α 和 IFN-γ 的表現量，以誘發免疫系統產生 Th1 cell 免疫反應而減少過敏的反應(圖 2.4) (Cross et al., 2001; Kekkonen et al., 2008; Matsuzaki et al., 1998; Pelto et al., 1998)。. 17.

(29) (Kobayashi et al,2001) 圖 2.3、Th1 與 Th2 的免疫反應 Fig. 2.3 The immune response of Th1 and Th2. 18.

(30) (Cross et al., 2001) 圖 2.4、益生菌調節免疫反應之抗過敏機制 Fig. 2.4 Theoretical model of the anti-allergy mechanism for the immunoregulating effect of probiotics. 19.

(31) (6)改善幽門螺旋桿菌誘發之胃炎症狀幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)是慢性胃炎及胃潰瘍的主要病因之一，估計全世界至少有一半人口胃內有幽門螺旋桿菌存在，感染情況隨年齡增加而增加。一般治療幽門螺旋桿菌的療法包括使用制酸劑、鉍劑(bismuth)、抗生素或三合一合併療法(一種質子幫浦抑制劑及兩種抗生素) (Pinchuk et al., 2001; Sheu et al., 2003)，近年來建議以三合一療法作為標準療法(Malfertheiner et al., 2002)。以三合一療法根治幽門螺旋桿菌感染的胃炎成功率達八成，但有抗藥性以及抗生素引發之腸胃不適，如：腹瀉、嘔吐、脹氣、腹痛等副作用(Qasim and O’Morain, 2002)。有研究發現乳酸桿菌具有預防幽門螺旋桿菌感染(Francavilla et al., 2008; Kabir et al., 1997)及改善胃炎(Felley et al., 2001)的效用，益生菌對幽門螺旋桿菌之抑制作用可能與其分泌物有關(Coconnier et al., 1998; Pinchuk et al., 2001)。有學者嘗試以乳酸桿菌搭配三合一療法以改善三合一療法之療效，結果發現根治的效果有限，但可減少副作用以及患者不適感覺之效果(Canducci et al., 2000; Cremonini et al., 2002; Sabbi et al., 2008; Sheu et al., 2002)。. (7)減少泌尿道生殖器的感染. 20.

(32) 泌尿道生殖器之感染大部分屬於內源性逆性感染，即為正常菌群所引起的感染，是菌相失調的一種表現，大多是來自陰部或腸道內最常見的細菌，如：葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌和腸球菌，當宿主生理狀態發生改變時，如：衛生習慣欠佳、免疫功能低下等，病原菌會增生而入侵泌尿系統而造成感染。當益生菌為優勢菌群時，可使泌尿道呈酸性環境以抑制大腸桿菌等的過度繁殖與活動、競爭吸附鍵結位、增強宿主的體液免疫等來減少病原菌感染(Shalev, 1996; Sobel, 1999)。. (8)降低膽固醇膽固醇為細胞膜及細胞質脂蛋白之重要成分，也是膽酸及各種固醇類荷爾蒙之前趨物。膽固醇在肝臟內合成後，與甘氨酸(glycine)和牛磺酸(taurine)結合成一級膽鹽，若被腸內菌分解形成二級膽鹽，二級膽鹽在 pH 6 以下溶解度會下降而沈澱，使膽鹽無法經由腸肝循環 (entetrohepatic circulation)再利用。而膽固醇的溶解度與膽鹽溶解度有關，會產生共沈澱而排出，不僅有助於食物中的膽固醇不被吸收，更可因膽鹽減少而加速人體利用膽固醇來合成膽鹽(Jin et al., 1998; Klaver and van der Meer, 1993)。另外亦有研究顯示，有些乳酸菌會吸附腸道內之膽固醇使之不被吸收(Grill et al., 2000)，並可降低參與膽固醇合成之酵. 21.

(33) 素 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase)的活性，使膽固醇之合成減少(Khedkar et al., 1993)。. (9)降血壓血壓高是由多方面的因素所引發的，如：精神、神經、內分泌、遺傳及血管收縮素轉化酶(angiotensin Ι - converting enzyme; ACE)等，其中 ACE是調節血壓的關鍵酵素。ACE之功能是將腎素(renin)分解血管張力素原(angiotensinogen)產生的angiotensin Ι (inactive)轉換成angiotensin ΙΙ (active) (圖2.5)，angiotensin ΙΙ是很強的血管收縮物質，使血管收縮而造成血壓升高，亦會刺激腎上腺皮質分泌醛固酮(aldosterone)，造成鈉與水份的滯留而使血壓升高。另一方面，ACE可水解舒緩激肽(bradykinin)， bradykinin具血管舒張作用而具降血壓之效果，故ACE存在時會分解 bradykinin使得血壓無法下降。乳酸菌在發酵的過程中，能夠產生抑制 ACE活性的多肽(Fitzgerald and Meisel, 2000; Ginger and Grigor, 1999; Tauzin and Micki, 2002)，ACE抑制多肽是一種競爭性的抑制劑，其對ACE 活性區域之親合力大於angiotensin Ι和bradykinin，一旦與ACE活性區域結合就難以分開，故而使angiotensin Ι無法轉化為angiotensin ΙΙ並阻礙 bradykinin分解成失活片斷，進而達到降血壓的功能(楊等，2006；Meng. 22.

(34) (楊等，2006) 圖 2.5、血壓調控機制 Fig. 2.5 Regulation mechanism of the blood pressure. 23.

(35) and Oparial, 1996)。. (10)改善肝昏迷現象肝昏迷(hepatic encephalopathy)是血液中的氨含量太高所引起的神經性異常現象，其成因之一為腸道細菌滋生，細菌的尿素酶活性過高而使得腸道中之氨濃度過高，這些氨在正常人體內經腸道吸收後可經血液運送至肝臟進行解毒，但肝衰竭的病患無法進行肝臟解毒而使血中的氨達到具毒性的濃度。益生菌則可能藉由調節菌相而減少腸道內細菌的尿素酶活性進而改善肝昏迷症狀(Loguercio et al., 1995)。. (11)改善營養價值及食物消化性益生菌與宿主的營養有密切的關聯，腸內菌群確實參與宿主之營養素消化、合成與吸收，而菌體本身製造的營養素亦可被宿主所利用。益生菌可提高游離胺基酸的量，同時其菌體蛋白大部分可為宿主所用；此外可分泌酵素將不溶性蛋白、脂肪和醣等變為可溶性，以利進行新陳代謝，改善如食欲不振、乳糖不耐、脹氣等症狀；益生菌在腸內發酵後產生的醋酸、乳酸等，使腸道環境酸鹼值降低，故能提高鈣、磷、鐵等的利用率，促進人體礦物質與維生素 D 的吸收；亦能在腸道內產生葉酸、. 24.

(36) 菸鹼酸、硫氨素(Vit B1)、核黃素(Vit B2)、吡哆醇(Vit B6)、鈷胺素(Vit B12)、維生素 K 及維生素 H 等維生素，以供人體利用(Holzapfel and Schillinger, 2002)；有些菌種尚能產生易於代謝的 L(+)乳酸，可防止嬰兒酸中毒的代謝障礙。. 2.3 益生菌的應用益生菌可以一種或多種菌株混合於食品中，或與可強化產品風味或產品特性的酵母菌、醋酸菌菌株混合使用，其中以 Lactobacillus 與 Bifidobacterium 兩屬居多，一些非乳酸菌類的益生菌株，如：釀母菌屬 (Saccharomyces spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、纖毛狀真菌(filamentous fungi)等也常應用於生活中(表 2.4)。應用範圍除了以食品方式經口攝取到達胃腸道外，另有製成霧狀以應用於上呼吸道或藥膏抹劑用於泌尿道進行局部治療。有 70%的益生菌應用於乳品中，包括優酪乳、乳酸菌飲料、乳酪、優格、奶粉或冰淇淋(楊，1998；Krasaekoopt et al., 2003)，也有不少應用在點心、糖果、糕餅、豆奶等。近年來為防菌體飛散、取食便利、長久保存、簡單等因素，產品擴展成以膠囊、錠片、粉狀、顆粒狀包裝等菌體之乾燥或冷凍粉末型式來銷售 ( 楊， 1998 ； Mattila-Sandholm et al., 2002)。有些菌株因臨床實效而以醫療製藥型式作. 25.

(37) 表 2.4、目前研究發表及市售產品中具代表性之益生菌菌株 Table 2.4 The representative probiotics strains that had been published and used in food at present 菌屬. Strains. a. b. 乳酸桿菌屬(Lactobacillus). L. acidophilus L. brevis L. brevis ssp. coagulans L. casei L. casei Shirota strain L. casei ssp. pseudoplantarum L. casei ssp. rhammosus L. delbrueckii ssp. bulargaricus L. fermentum L. GG strain L. paracasei L. plantarum L. reuteri L salivarlus. + + + + + + +. +. B. bifidum B. infants B. lactis. + +. B. longum. +. 雙叉桿菌屬(Bifidobacterium). 鏈球菌屬(Streptococcus). +. + +. + + + + +. S. lactis S. salivarlus ssp. thermophilus. + +. +. 腸球菌屬(Enterococcus). E. faecalis E. faecium. 乳酸球菌屬(Lactococcus). L. lactis. +. 丙酸菌屬(Propionibacterium). P. freudenreichii ssp. shermanii. +. 有孢子乳桿菌屬(Sporolactobacillus). Sporolactobacillus. +. 釀母菌屬(Saccharomyces). S. boulardii S. cerevisiae S. florentinus. + +. + + +. a:腸駐型菌株 b:常使用於產品者 c:非腸駐型菌株，常見於乳品 d:乳品來源，經試驗顯示有利於人體 +:具有上述a~d之ㄧ或多種性質者 (楊，1998) 26. d. + +. + + +. c.

(38) 成整腸劑、下痢治療劑及醫療輔助品，非乳酸菌菌種較少用於乳品或食品中，大多用於製藥方面，以凍乾或微膠囊的方式製造生產(楊，1998； Holzapfel et al., 1998; Homma and Shinohara, 2004)。. 第3節乳酸菌介紹一般人所稱的乳酸菌為可利用碳水化合物發酵而產生乳酸之細菌的總稱。在自然界中，只要有動植物活動的地方就有足夠的營養供乳酸菌生存。舉凡動植物的分泌物(如乳汁、樹液等)，或其殘骸堆積處都是乳酸菌適合生育的地方，可在廣泛的溫度範圍(15-45℃)中生長，最適宜的溫度為 37℃，而最適的 pH 值為 5.8。乳酸菌通常具有下列的特性：(1) 為革蘭氏陽性菌(Gram positive)；(2)為桿菌或球菌；(3)不形成內孢子； (4)無運動性；(5) catalase test 陰性，缺乏細胞色素；(6)為厭氧或兼性厭氧菌，一般可於有氧的環境生長，但以無氧的環境生長較佳；(7)營養需求複雜，需有碳水化合物、胺基酸、核酸衍生物、維生素和多種生長因子等才可生長並代謝產生乳酸(蔡，1998)。依乳酸菌代謝途徑及產物種類的不同，可分為同型發酵 (homofermentative) 與異型發酵 (heterofermentative)兩種。前者指發酵過程中，經醣解作用使碳水化合物分解成乳酸，乳酸產量達 90-100%；而後者是指發酵過程中產生 45-50%. 27.

(39) 的乳酸，亦可經由磷酸酮酶(Phosphoketolase)作用產生醋酸、乙醇、二氧化碳等其他產物(廖，1998)。乳酸菌中屬於同型發酵和異型發酵的菌屬如表 2.5 所示，其化學反應式如下(王，1997)：. A. 同型發酵(homofermentative) C6H12O6 → glucose. 2 CH3CHOHCOOH lactic acid. B. 異型發酵(heterofermentative) C6H12O6 → glucose. CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2 lactic acid alcohol carbon dioxide. 3.1 乳酸菌的分類乳酸菌廣泛分布於自然界中，其分類鑑定屬性之界限有許多爭議存在，隨著分子分類科學的進步，透過 DNA 相似性、RNA 序列相似性的技術發展及電腦化的鑑定系統，乳酸菌的分類標準不再只侷限於傳統的性質特性(如形態學與生態學等特性)，現可利用核酸雜交試驗與 16S rRNA 序列分析來作分類的根據，故各屬的特性與分類可快速的鑑定出來並更具確效性 (Kabadjova et al., 2002; Stiles and Holzapfel, 1997; Vaughan et al., 2002)。截至 2007 年 10 月，目前已發現且國際認可的乳酸菌可分為下列二. 28.

(40) 表 2.5、乳酸菌各屬的生長與發酵特性 Table 2.5 Fermentative and growth characteristics of some lactic acid bacteria genera 屬名. 菌形態. 乳酸發酵型式最適生長溫度. 好氣性. 分怖範圍. Lactobacillus. 長稈菌. 同型、異型發酵. 30-40℃. ＋*. 食品、動物腸內、動物糞便、土壤等. Streptococcus. 直鏈鎖球菌. 同型發酵. 25-45℃. ＋. 口腔、呼吸道. Pediococcus. 四聯球菌. 同型發酵. 25-40℃. ＋. 植物、穀類發酵食品. Leuconostocs. 直鏈鎖球菌. 異型發酵. 20-30℃. ＋. 植物性發酵物. Sporolactobacillus. 桿菌. 同型發酵. 35℃. ＋. 土壤. Bifidobacterium. 桿菌. 異型發酵. 37-41℃. －. 脊椎溫血動物之口腔與腸道、昆蟲與廢水. *. 部分為兼性厭氣菌 (李，2000). 29.

(41) 十一屬(圖 2.5) (潘，2008； Higashiguchi et al., 2006)：(1)鏈球菌屬 (Streptococcus) ； (2) 腸球菌屬 (Enterococcus) ； (3) 乳酸球菌屬 (Lactococcus) ； (4) 徘徊球菌屬 (Vagococcus) ； (5) 乳酸桿菌屬 (Lactobacillus) ； (6) 肉品桿菌屬 (Carnobacterium) ； (7) 有孢子桿菌屬 (Sporolactobacillus) ； (8) 明串球菌屬 (Leuconostocs) ； (9) 足球菌屬 (Pediococcus) ； (10) 四體球菌屬 (Tetragenococcus) ； (11) 雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) ； (12) 奇異菌屬 (Atopobium) ； (13) Weissella ； (14) Abiotrophia ； (15) Granulicatella ； (18). Oenococcus ； (16). Paralactobacillus ； (17). Marinilactibacillus ； (19). Olsenella ； (20). Halolactibacillus；(21) Pilibacter。. 3.2 乳酸菌作為益生菌之特性一般認為乳酸菌及發酵乳對人體有下列的益處： (1)為腸道常駐菌群腸道菌群組成包括共生的有益菌及病原菌，這些腸內菌因其分布方式的不同可分成三種菌群：(a)游離菌群：停留於體內時間很短；(b)與腸內顆粒物結合菌群：此族群菌體含有酵素，藉由消化結合之顆粒，使宿主獲利；(c)與腸壁組織結合菌群：此族群菌體可抑制外來微生物於腸內. 30.

(42) (潘，2008; Higashiguchi et al., 2006) 圖 2.6、目前已發現且國際已認同的乳酸菌屬 Fig. 2.6 LAB genera generally recognized and accepted worldwide. 31.

(43) 增殖之能力，其菌數會因宿主發生疾病或攝取抗生素而降低。此類微生物主要為乳酸菌及酵母菌(Fuller and Brooker, 1973)。. (2)能產生抗菌物質，抑制其他雜菌生長 Coconnier et al. (1997)指出部份乳酸菌能分泌抗菌物質，對革蘭氏陽性菌或陰性菌皆有抑制效果，乳酸菌所產生之抑菌物質包括有機酸、過氧化氫、聯乙醯(diacetyl)、抑菌素、reuterin 等。乳酸菌發酵可產生乳酸、醋酸等有機酸，造成腸道環境 pH 值下降而使有害病原菌無法吸附於腸黏膜上，此外也會釋出對雜菌有毒的陰離子，使其細胞質酸化而達到抑菌的效果(陳，1991)。在有氧的環境下，乳酸菌本身的黃素蛋白氧化酶(flavoprotein oxidase)或 NADH 氧化酶 (NADH oxidase)會將氧分子轉為過氧化氫，但乳酸菌缺乏觸酶來分解而使得環境中的過氧化氫蓄積，過氧化氫會破壞細胞中的蛋白質結構，亦可與其他成分生成抑菌物質(如次硫氰酸鹽 OSCN-)，而對其他細菌產生抑制作用(陳，1991；Reiter and Harnulv, 1984)。聯乙醯是乳酸菌的代謝中間產物，常在乳酸菌代謝之有機酸中發現多量之存在，可抑制一些酵母菌和革蘭氏陰性菌，且其效果會隨 pH 值下降而增強。抑菌素是由細菌產生而對與其遺傳關係相近的菌種會產生毒性的. 32.

(44) 蛋白質(Tagg et al., 1976)。乳酸菌產生的細菌素大約由 300 個胺基酸殘基組成，是具有較高等電點及兩親媒性(amphiphilic)特性的陽離子蛋白質 (Bruno and Montville, 1993)。乳酸菌所產的細菌素是公認安全(GRAS)的抑菌物質，其抑菌的機制可能是耗盡菌體的質子運動力(proton motive force; PMF) (Bruno and Montville, 1993)，或是細菌素吸附於感受菌的細胞膜後侵入膜內形成通透孔道，使胞內物質流失或引起生化反應造成菌體死亡(Ennahar et al., 1999)。能產生細菌素的乳酸菌株包括 B. bifidum 產生 bifidin ； L. plantarum 產生 lactolin ； L. acidophilus 可產生 acidophilin 、lactocidin 和 acidolin 等(Tamine and Robinson, 1985)。1989 年 Axelsson 等發現人體或動物腸道中的 L. reuteri 會產生非蛋白質的低分子量廣效性抗菌物–reuterin。reuterin 是在厭氣狀態下代謝甘油所產生(圖 2.7)，為一水溶性物，對蛋白分解酶(proteolytic enzyme)和脂解酶 (lipolytic enzyme)具有耐受性，可抑制革蘭氏陽性菌、陰性菌、酵母菌、黴菌及原蟲(Axelson et al., 1989)。多位學者的研究顯示 reuterin 可有效抑制腐敗菌生長，以生物保存法(biopreservation)來保存食物(EI-Ziney and Debevere, 1998; EI-Ziney et al., 1999; Nishi et al., 1995)。EI-Ziney 和 Debevere (1998)發現 reuterin 可有效抑制 Listeria monocytogenes 和 Escherichia coli O157: H7 的生長而延長保存期限。而抑菌的作用機制可. 33.

(45) 圖 2.7、在厭氣狀態下代謝 glycerol 產生 reuterin Fig. 2.7 Metabole glycerol produces reuterin under the anaerobic condition. 34.

(46) 能是 reuterin 會抑制核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase)或硫氫基酵素(sulfhydryl enzyme)而引起 DNA 合成作用受阻有關(Talarico and Dobrogosz, 1989)。. (3)耐胃酸及耐膽鹽能力大部分微生物在酸性環境中均無耐受性，乳酸菌本身雖為產酸菌，但其生長環境 pH 值僅能降至 3.2-4.5，因此在胃中之低 pH 值(2.0-3.2)是影響其存活主要因素之一(Toit et al., 1998)。另一方面，腸道內的膽鹽是由肝臟所產生的一種界面活性劑，可與非水溶性脂質和脂溶性維生素形成多分子聚合物，藉此來幫助消化和抑制微生物。Gilliland (1979)則指出 Lactobacillus 對膽鹽之抵抗力與其腸內定殖能力有關。. (4)具吸附於上皮細胞的特性微生物須具有附著於腸道上皮細胞能力方能於腸道中定殖，並發揮其益生作用(Annika et al., 1983; Fuller, 1989)。許多生體外及生體內試驗的結果可觀察到乳酸菌在腸道上皮細胞之吸附(Berent-Camard et al., 1997; Liévin et al., 2000; Tuomola and Salminen, 1998)。有關乳酸菌吸附機制可能是藉由菌體表面的植物凝集素(lectin) (Firon et al., 1984)、酸性多醣類(acidic polysaccharides) (Hood and Zattola, 1987)或鈣離子等來與 35.

(47) 上皮細胞結合。. (5)快速增殖腸道分泌的黏液與腸道蠕動具有加速病原菌通過腸道，藉此減少病原菌停留在腸道中增殖的機會。Savage (1983) 指出 Lactobacillus spp. 能分泌酵素分解腸道黏膜外層的黏液醣蛋白(mucous glycoproteins)，並利用其作為能量來源，進行快速增殖而大量存活於腸道中。. 3.3 乳酸菌的應用乳酸菌存在於人類生活環境中，其應用的範圍非常廣泛，其在發酵過程中的生物轉化作用在食品加工業上可有許多應用，如：產生特殊香味、去除異味、提高產品營養價值、增加食品保存性、淡化食品顏色、發酵加工產品的製造等(廖，1998；Hose and Sozzi, 1991)。乳酸菌於人體具有穩定腸道菌相、拮抗病原菌、合成維生素、降低膽固醇等益生功效，故近年來廣泛的作為機能性食品，最常用於益生菌製品的乳酸菌如表 2.6 所示。. 36.

(48) 表 2.6、最常用於益生菌製品的乳酸菌 Table 2.6 The most commonly used lactic acid bacteria for probiotic products Lactobacillus sp.. Bifidobacterium sp. Enterococcus sp.. Streptococcus sp.. L. acidophilus L. casei L. delbrueckii ssp. (bulargaricus) L. cellobiosus L. fermentum L. lactis L. plantarum L. reuteri L. brevis. B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infants B. thermophilum B. longum. S. cremoris S. salivarlus S. diacetylactis S. intermedius. Ent. faecalis Ent. faecium. (Parvez et al., 2006). 37.

(49) 3.4 羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) 羅伊氏乳桿菌存在於哺乳類動物及鳥類的腸道中，屬異型發酵菌 (Casas and Dobrogosz, 2000)，會產生有抑菌活性的物質，如：reuterin、 reutericyclin (Ganzle et al., 2000; Nikawa et al., 2004; Talarico et al., 1988)。許多研究指出 L. reuteri 是安全的(Wolf et al., 1995; Wolf et al., 1998)，亦可顯著降低腹瀉的發生(Shornikova et al., 1997; Shornikova et al., 1997)、減少胃腸道疾病和感染、改善年長者便秘的情形(Ouwehand et al., 2002)及增強免疫反應(Valeur et al., 2004)等，故常添加於食品中以改善人類胃腸道的健康。. 第4節固定化介紹 4.1 固定化技術利用人為之物理或化學方法以限制生物觸媒之移動性的操作稱為固定化(immobilization)(Coughlan and Kierstan, 1988)。經固定化後的生物觸媒具有固定基質的物理特性，並保有生物觸媒原有的生物化學活性，能提升原有程序之操作性與效率。. 4.1.1 固定化技術的種類 38.

(50) 固定化技術主要分為三大類型：擔體鍵結型(carrier-binding)、交聯型(cross-linking)及包埋型(entrapping) (圖 2.8) (Blanch, 1984; Chibata, 1978; Kozlyak et al., 1991)。三種固定化技術分別敘述如下： (1)擔體鍵結型(carrier-binding) 此方法是將生物觸媒結合在非水溶性的高分子擔體上的方法。擔體鍵結法又因鍵結力的不同再細分為吸附法(adsorption)、離子鍵結法(ionic binding)和共價鍵結法(covalent binding)。吸附法是固定化技術中最古老也最簡單的方法，藉由物理的作用力 (如：凡得瓦力)及其它作用力(如：疏水性作用、氫鍵、離子鍵結等)將酵素或菌體細胞吸附於擔體上，如圖 2.8-1. (A)所示。無機、有機物質及合成的高分子等都可作為吸附所使用的材料，常使用的擔體材料如 diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)、starch、gluten、titania、 carboxymethyl-cellulose 等。此法操作簡便且對酵素或菌體細胞之構形影響較小，所以常被使用，但吸附的結合力相當弱，吸附固定的酵素或菌體細胞容易因溫度、離子、擾動或受質濃度變化而導致脫附。離子鍵結法是藉由擔體與生物觸媒間相反電荷所形成之靜電吸引力(electrostatic attraction)而達到固定化之作用，如圖 2.8-1. (B)所示。此. 39.

(51) 1.擔體鍵結型(carrier-binding) B. B. B. B. B. +++. +++. -----------. C. C. (A) Adsorption. B. C. (B) Ionic binding. (C) Covalent binding. 2.交聯型(cross-linking) B. B. B. B. B. B. B. B. B. 3.包埋型(entrapping) B. B. B. B. B. B B. B. B B. B. (A) Lattice C: carrier. B B B. (B) Microencapsulation B : biocatalyst (cell/enzyme) ○. 圖 2.8、固定化方法 1.擔體鍵結型：(A)吸附法 (B)離子鍵結法 (C)共價鍵結法；2. 交聯型；3.包埋型：(A)格子型 (B)微膠囊型 Fig. 2.8 Immobilization methods 1. carrier-binding: (A) Adsorption (B) Ionic binding (C) Covalent binding; 2. cross-linking; 3. entrapping: (A) Lattice (B) Microencapsulation 40.

(52) 法較常使用的擔體主要有多醣類或合成樹脂(synthetic resins)材質作成之一般商品化離子交換樹脂，如： CG-50 、 DEAE-cellulose 、 DEAE-sephadex、CM-cellulose、cellulose-citrate、dowex-50 等(陳，2000)。其結合方式與吸附法一樣簡單又容易操作，且可再生使用，於固定化前不須先修飾酵素，因而可保持相當高的酵素活性。雖然其結合強度高於吸附法，但使用時需特別注意離子強度、溫度與 pH 值的維持，以防止酵素或菌體細胞自擔體脫落。共價鍵結法是指生物觸媒間的結合或生物觸媒與擔體的直接結合，為單一鍵結(single link)方式的固定化技術。此法較常用於固定化酵素，通常酵素藉著本身分子的胺基(amino group; -NH)與羧基(carboxyl groups; -COOH)來與擔體結合。此類擔體包括 polyaminopolystrene、 CNBR-activated sephadex、CM-cellulose、enzacryl AA、aminosilanized dacron 等(陳，2000；蘇，1999)，此法的缺點是容易對酵素造成傷害，其結合方法如圖 2.8-1. (C)所示。. (2)交聯型(cross-linking) 交聯法是利用具有多官能基的交聯劑(cross-linking agent)將生物觸媒相互交聯結合，使其形成為不溶化之巨大分子凝聚物 (insoluble. 41.

(53) aggregates)而完成固定化。生物觸媒以適當的交聯劑(如膠質、血清蛋白等)之不飽和鍵或非共價鍵電子來形成共價鍵以達成交聯的目的(圖 2. 8-2.)。在固定化時所用的多官能基交聯劑包括 glutaraldehyde、isocyanate compound、alphatic diamine、dimethyl-adipimidate 等(王，1991；陳，2000；劉和汪，1993)。使用交聯法形成不溶性之巨大分子活性通常都偏低，且環境條件(如：pH、反應時間等)改變會降低結合的成功率，所以常會修飾本方法後再合併其他方法來應用。. (3)包埋型(entrapping) 包埋法是利用各種天然或合成之高分子膠體的網狀結構及具有半透膜性質之物質將生物觸媒包埋於其中，可分為膠體固定的格子型及半透膜包裹的微膠囊型兩種(圖 2.8-3. (A)、(B))。此法與其他固定化方法不同的是生物觸媒被包埋後仍呈現自由狀態，只是被膠體格子狀結構物包住，膠體之孔洞大小則決定了生物觸媒是否會被包埋在裡面而不掉落且能使受質與產物通透自如(辛，2004)。這是最常使用的菌體固定法，是固定化方法中反應條件最溫和的一種，酵素、微生物菌體或細胞內的原生質(protoplasm)都可應用此法來固定，方法簡單，不易受到雜菌或高分子抑制劑的影響而降低活性，且其膠體的網目非常小，可避免菌體細胞. 42.

(54) 從擔體內部漏失，但具有依包埋條件而導致酵素變性失活及高分子受質不易受到作用等缺點。根據載體硬化原理的不同，一般可再分為：(a) 熱可逆性膠化，所用載體如洋菜(agar)及明膠(gelatin)等；(b)離子移變膠化(ionotropic gelation)，即形成離子鍵網狀結構之包埋，所用載體如褐藻酸鈉(sodium alginate)、紅藻膠(carrageenan)、幾丁聚醣(chitosan)等；(c) 溶劑沉殿(solvent precipitation)，使用的高分子有聚苯乙烯(polystyrene)、醋酸纖維素(cellulose acetate)等；(d)聚縮合法(polycondensation)，所使用的高分子有環氧樹脂(epoxy resin)及聚胺甲酸酯樹脂(polyurethane resin) 等； (e) 聚合包埋法，使用的高分子為共聚合之聚丙烯醯胺 (polyacrylamide)、聚甲基丙烯醯胺(polymethacrylamide)等(陳，2000)。. 4.1.2 各種固定化技術之優缺點固定化技術之應用範圍涵蓋有機合成反應、食品工業、機能性寡醣生產、製藥工業、類固醇轉換、檢驗分析、介面活性劑、農產品加工、動植物的細胞培養、重金屬及揮發性有機物質之處理、廢水生物處理等多元化發展。各種固定化方法的應用都有不同的限制存在，可經由所需之應用特點作適當的選擇，前述之固定化方法優缺點如表 2.7 所示。包埋法在固定化過程中，細胞仍可保持中等活性，無論是鍵結力或是顆粒. 43.

(55) 表 2.7、各種固定化方法的優缺點比較 Table 2.7 Comparison of various immobilization methods Characteristic. Cross-linking. Adsorption. Covalent binding. Entrapping. Preparation. Intermediate. Simple. Difficult. Intermediate. Binding force Retention of activity Regeneration of carrier Cost of immobilization Stability General applicability Viability. Strong Low Impossible Intermediate High No No. Weak High possible Low Low Yes Yes. Strong Low Rare Low High No No. Intermediate Intermediate Intermediate Low High Yes Yes. (張，1992). 44.

(56) 穩定性都為中等以上，與其他固定法相比是較溫和且為最常用的方法。. 4.2 細胞固定化細胞固定化技術源自於 1960 年代便已商業化的酵素固定化(enzyme immobilization)技術，為利用聚合物、玻璃、無機鹽類等適當的擔體以結合、架橋或包埋等方式，來將微生物菌體作某種空間限制，以加以有效利用的方法(Jen et al., 1996；Kozlyak et al., 1991)。. 4.2.1 細胞固定化的優點經固定化後的細胞在培養過程中可以得到較高的菌體濃度，而且亦能受到所用擔體的保護；具有貯藏性佳、回收容易、耐用性、穩定性、作用效率高，以及對溫度、毒性物質、pH 等外界環境條件的耐受性強等優點(Leon, 1998)，亦具有能提高產率、連續化操作、促進二級代謝產物之排泄、防止界面失活(interfacial inactivation)、增加質體攜帶細胞 (plasmid-bearing cells)之貯留以及抵抗液體環境中之亂流干擾等作用 (Nath and Chand, 1996)；另一方面，細胞固定化能有效提高細胞濃度與加工過程中細胞之存活以及操作效率(Bozoglu et al., 1987; Brennan et al., 1986; Tsen et al., 2002)；此外選擇適當的固定化材質則可提升菌體對人. 45.

(57) 體消化道的耐受性，進而提高菌體在人體腸道中的存活率與活性(Chan and Zhang, 2005; Lee and Heo, 2000; Sun and Griffiths, 2000)。因此目前在食品、醫藥、環保、生物等產業方面甚受重視(Coughlan and Kierstan, 1988; Leon et al., 1998)，而且利用日益增加。. 4.2.2 細胞固定化的保護作用 (1)菌體冷凍乾燥過程中的保護作用菌株的乾燥保存常使用冷凍乾燥的方法(Heckly, 1978)，但在凍結及乾燥處理過程中菌體常會因此受到損傷(Castro et al., 1996)，並且降低菌株在隨後貯存期間的存活率(Bozoglu et al., 1987; Brennan et al., 1986)。將菌株以細胞固定化加以處理能有效增進菌體於冷凍乾燥過程中的存活率(Yoon et al., 1995)和乾燥樣品中的細胞濃度(Maitort et al., 1997)，亦可降低細胞所受的低溫傷害(Champagne et al., 1992; Kearney et al., 1990)。. (2)菌體貯存期間的保護作用冷凍乾燥產品的貯存安定性(storage stability)為菌株運輸及保存管理上的重要因子，使用的包埋物質與貯存溫度均會影響冷凍乾燥菌體的貯存安定性(Castro et al., 1996; Champagne et al., 1996)，Kim 等(1988)使. 46.

(58) 用褐藻酸鈣來製備耐受性強的微膠囊化乳酸菌株，以抵抗環境中不利因子的變化與增加菌株之貯存安定性。. (3)菌體通過胃腸道的保護許多研究均指出飲料中的乳酸菌利用膠體加以包埋，能有效提升其對胃酸及膽鹽等的耐受性，能保護菌體並提高其在人體腸道中的存活率與活性(Doleyres et al., 2004; Lee and Heo, 2000; Sun and Griffiths, 2000; T sen et al., 2004; Yu et al., 2002)。. 4.3 益生菌的包埋將益生菌應用於製品中，食用時可同時攝取益生菌，有效的強化其機能性。然而益生菌食品於貯存及消化過程中，受到多重的因子影響，以致於到達結腸的益生菌數相當有限。許多研究證實菌體包埋除了可保護益生菌順利通過胃腸道，提高菌體於胃酸與膽鹽溶液中之存活率外，尚可改善益生菌產品於加工、貯存時的存活率，益生菌微膠囊包埋的優點如表2.8所示。. 4.3.1 益生菌的包埋技術. 47.

(59) 表 2.8、益生菌微膠囊包埋的優點 Table 2.8 Beneficial effect of probiotic microencapsulation Benefit Product Facilitates the production of oxygen-sensitive cultures. Dried probiotic culture. Facilitates the recovery of centrifugation-sensitive cultures. Dried probiotic culture. Facilitates the recovery of high EPS-producing cultures. Dried probiotic culture. Less contamination problems. Dried probiotic culture. Cultures can be air-dried. Dried probiotic culture. Improved survival on exposure to gastric solutions. Nutraceutical. Improved survival on exposure to bile solutions. Nutraceutical. Improved stability during storage in dried form. Nutraceutical. Improved acidification rate. Dried sausages. Improved survival on heating. Biscuits, powder. Improved survival on freezing. Ice cream, milk-based medium, cranberry juice. Improved retention in the finished product. Cheese. Protection against bacteriophages. Fermented milks. Protection against yeast contaminants. Fermented milks. Improved survival during storage. Yoghurt, mayonnaise, milk. (Champagne and Fustier, 2007). 48.