固定化技術

利用人為之物理或化學方法以限制生物觸媒之移動性的操作稱為 固定化(immobilization)(Coughlan and Kierstan, 1988)。經固定化後的生物

觸媒具有固定基質的物理特性，並保有生物觸媒原有的生物化學活性，

能提升原有程序之操作性與效率。

4.1.1 固定化技術的種類

固定化技術主要分為三大類型：擔體鍵結型(carrier-binding)、交聯 型(cross-linking)及包埋型(entrapping) (圖 2.8) (Blanch, 1984; Chibata, 1978; Kozlyak et al., 1991)。三種固定化技術分別敘述如下：

(1)擔體鍵結型(carrier-binding)

此方法是將生物觸媒結合在非水溶性的高分子擔體上的方法。擔體 鍵結法又因鍵結力的不同再細分為吸附法(adsorption)、離子鍵結法(ionic binding)和共價鍵結法(covalent binding)。

吸附法是固定化技術中最古老也最簡單的方法，藉由物理的作用力 (如：凡得瓦力)及其它作用力(如：疏水性作用、氫鍵、離子鍵結等)將酵 素或菌體細胞吸附於擔體上，如圖2.8-1. (A)所示。無機、有機物質及合 成 的 高 分 子 等 都 可 作 為 吸 附 所 使 用 的 材 料 ， 常 使 用 的 擔 體 材 料 如 diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)、starch、gluten、titania、

carboxymethyl-cellulose 等。此法操作簡便且對酵素或菌體細胞之構形影

響較小，所以常被使用，但吸附的結合力相當弱，吸附固定的酵素或菌 體細胞容易因溫度、離子、擾動或受質濃度變化而導致脫附。

離子鍵結法是藉由擔體與生物觸媒間相反電荷所形成之靜電吸引 力(electrostatic attraction)而達到固定化之作用，如圖 2.8-1. (B)所示。此

圖2.8、固定化方法

1.擔體鍵結型：(A)吸附法 (B)離子鍵結法 (C)共價鍵結法；2.

交聯型；3.包埋型：(A)格子型 (B)微膠囊型 Fig. 2.8 Immobilization methods

1. carrier-binding: (A) Adsorption (B) Ionic binding (C) Covalent binding; 2. cross-linking; 3. entrapping: (A) Lattice (B)

Microencapsulation

(A) Adsorption (B) Ionic binding (C) Covalent binding

法較常使用的擔體主要有多醣類或合成樹脂(synthetic resins)材質作成之

一 般 商 品 化 離 子 交 換 樹 脂 ， 如 ： CG-50 、 DEAE-cellulose 、 DEAE-sephadex、CM-cellulose、cellulose-citrate、dowex-50 等(陳，2000)。

其結合方式與吸附法一樣簡單又容易操作，且可再生使用，於固定化前 不須先修飾酵素，因而可保持相當高的酵素活性。雖然其結合強度高於

吸附法，但使用時需特別注意離子強度、溫度與 pH 值的維持，以防止

酵素或菌體細胞自擔體脫落。

共價鍵結法是指生物觸媒間的結合或生物觸媒與擔體的直接結 合，為單一鍵結(single link)方式的固定化技術。此法較常用於固定化酵 素，通常酵素藉著本身分子的胺基(amino group; -NH)與羧基(carboxyl groups; -COOH)來與擔體結合。此類擔體包括 polyaminopolystrene、

CNBR-activated sephadex、CM-cellulose、enzacryl AA、aminosilanized dacron 等(陳，2000；蘇，1999)，此法的缺點是容易對酵素造成傷害，

其結合方法如圖2.8-1. (C)所示。

(2)交聯型(cross-linking)

交聯法是利用具有多官能基的交聯劑(cross-linking agent)將生物觸

aggregates)而完成固定化。生物觸媒以適當的交聯劑(如膠質、血清蛋白 等)之不飽和鍵或非共價鍵電子來形成共價鍵以達成交聯的目的(圖 2.

8-2.)。在固定化時所用的多官能基交聯劑包括 glutaraldehyde、isocyanate compound、alphatic diamine、dimethyl-adipimidate 等(王，1991；陳，2000；

劉和汪，1993)。使用交聯法形成不溶性之巨大分子活性通常都偏低，且

環境條件(如：pH、反應時間等)改變會降低結合的成功率，所以常會修 飾本方法後再合併其他方法來應用。

(3)包埋型(entrapping)

包埋法是利用各種天然或合成之高分子膠體的網狀結構及具有半 透膜性質之物質將生物觸媒包埋於其中，可分為膠體固定的格子型及半 透膜包裹的微膠囊型兩種(圖 2.8-3. (A)、(B))。此法與其他固定化方法不 同的是生物觸媒被包埋後仍呈現自由狀態，只是被膠體格子狀結構物包 住，膠體之孔洞大小則決定了生物觸媒是否會被包埋在裡面而不掉落且 能使受質與產物通透自如(辛，2004)。這是最常使用的菌體固定法，是

固定化方法中反應條件最溫和的一種，酵素、微生物菌體或細胞內的原 生質(protoplasm)都可應用此法來固定，方法簡單，不易受到雜菌或高分 子抑制劑的影響而降低活性，且其膠體的網目非常小，可避免菌體細胞

從擔體內部漏失，但具有依包埋條件而導致酵素變性失活及高分子受質 不易受到作用等缺點。根據載體硬化原理的不同，一般可再分為：(a) 熱可逆性膠化，所用載體如洋菜(agar)及明膠(gelatin)等；(b)離子移變膠 化(ionotropic gelation)，即形成離子鍵網狀結構之包埋，所用載體如褐藻 酸鈉(sodium alginate)、紅藻膠(carrageenan)、幾丁聚醣(chitosan)等；(c) 溶劑沉殿(solvent precipitation)，使用的高分子有聚苯乙烯(polystyrene)、

醋酸纖維素(cellulose acetate)等；(d)聚縮合法(polycondensation)，所使用 的高分子有環氧樹脂(epoxy resin)及聚胺甲酸酯樹脂(polyurethane resin)

等 ；(e) 聚 合 包 埋 法 ， 使 用 的 高 分 子 為 共 聚 合 之 聚 丙 烯 醯 胺 (polyacrylamide)、聚甲基丙烯醯胺(polymethacrylamide)等(陳，2000)。

4.1.2 各種固定化技術之優缺點

固定化技術之應用範圍涵蓋有機合成反應、食品工業、機能性寡醣 生產、製藥工業、類固醇轉換、檢驗分析、介面活性劑、農產品加工、

動植物的細胞培養、重金屬及揮發性有機物質之處理、廢水生物處理等 多元化發展。各種固定化方法的應用都有不同的限制存在，可經由所需

之應用特點作適當的選擇，前述之固定化方法優缺點如表 2.7 所示。包

表2.7、各種固定化方法的優缺點比較

Table 2.7 Comparison of various immobilization methods

Characteristic Cross-linking Adsorption Covalent binding Entrapping

Preparation Intermediate Simple Difficult Intermediate

Binding force Strong Weak Strong Intermediate

Retention of activity Low High Low Intermediate

Regeneration of carrier Impossible possible Rare Intermediate

Cost of immobilization Intermediate Low Low Low

Stability High Low High High

General applicability No Yes No Yes

Viability No Yes No Yes

(張，1992)

穩定性都為中等以上，與其他固定法相比是較溫和且為最常用的方法。