第七章、 參考文獻
附圖 1、 人類諾羅病毒之傳染途徑
附圖2 諾羅病毒基因組(genogroups)和基因型(genotypes) [30]
(上層)諾羅病毒分類樹主要根據衣殼蛋白質(VP1)之氨基酸序列分類 (下層) GII.4 突變型之出現時間和近期其他基因型的出現時間。
附圖3 諾羅病毒組成與生活史 [13]
病毒基因組具有三個ORFs，ORF1 會編碼出六個非結構性病毒蛋白質，ORF2 和ORF3 會編碼出結構蛋白質 VP1 和 VP2。病毒基因組(正股 RNA)會包裹在由 VP1 和 VP2 所形成的病毒衣殼外鞘蛋白質中，病毒衣殼蛋白質會經由 VP1 與宿 主之組織血型抗原(HBGAs)間的相互作用，進而貼附在細胞表面(步驟 1)，隨後 進入到宿主細胞內並脫去外鞘蛋白質(步驟 2,3)，(+)RNA 會在宿主細胞之細胞
質中轉錄與轉譯，非結構性病毒蛋白質VPg，會共價鍵結在(+)RNA 之 5'末端，
並募集宿主細胞中之轉譯因子(translation factors)調控病毒之轉譯(步驟 4)，
ORF1 所轉譯出之非結構性蛋白質，經病毒所編碼出之蛋白酶 Pro (也被稱為 NS6 或 3C-like)切割成獨立的蛋白質：p48 (也被稱為 NS1/2 或 N-term)、NTPase (也被稱為 NS3 或 2C-like)、p22 (也被稱為 NS4 或 3A-like)、VPg、Pro 和 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (步驟 5)，在病毒基因複製期間，(+)RNA 會 被轉錄成(–)RNAs，此負股 RNA 會做為合成新的(+)RNAs 基因組(genomic)和 (+)RNAs 亞基因組(subgenomic)之模板(步驟 6)，(+)RNAs 亞基因組僅有 ORF2 和ORF3，並且僅做為外鞘蛋白質 VP1 和 VP2 之生產。在病毒組裝期間，病毒 之(+)RNAs 基因組(和可能的(+)RNAs 亞基因組)，會被裝入新的病毒顆粒(步驟 7)，隨後從感染的宿主細胞中釋放(步驟 8)，目前，病毒顆粒釋放的機制仍尚未 完全了解。
附圖4 生合成 HBGA 之路徑 [13]
Type-1 和 type-2 之 HBGA 前驅物，會被 α(1,2)-fucosyltransferase 2 (FUT2)修飾 產生H 型抗原，此 H 型抗原會進一步被 A 和 B transferases 修飾產生 A 和 B 抗原。而Lewis 抗原，會經由 α(3,4)-fucosyltransferase (FUT3；也稱為
galactoside 3(4)-l-fucosyltransferase)修飾產生。當個體缺乏功能性 FUT2 被歸類 為非分泌型，因在身體體液中不存有A、B 或 H 抗原；當個體具有功能性 FUT2 則被歸為分泌型。Fuc: fucose, Gal: galactose, GalNAc:
N-acetylgalactosamine, GlcNAc: N-acetyleglucosamine。
附圖5 ABH、Lewis 及相關抗原生合成路徑圖 [38]
五種不同類型之雙醣(disaccharides)前驅物(precursor)如圖所示，Type 1 前驅物為 Gal β 1-3 GlcNac β，type 2 為 Gal β 1-4 GlcNAc β，由於這二種前驅物後續之修 飾路徑平行，因此分為一組並以斜線3/4 區分二者，衍生的抗原以框形標示，
Type 1/2, Le a/x 以及 Le b/y分別表示types 1 或 2，Lea或Lex和Leb或Ley，每個 步驟所需的催化酵素，酵素名稱皆以縮寫的斜體顯示。α3GT: α 1,3 galactosyl transferase, α 3/4FT: α1,3 或 α 1,4fucosyltransferase, α2FT: α 1,2 fucosyltransferase, α3ST: α 2,3sialyltransferase, A or B enzymes 為 α1,3N-acetylgalactosaminyl and α 1,3galactosyltransferases 分別由 ABO 基因座處的 A 和 B 等位基因編碼。Gb3S:
globosynthase, iGb3S: isoglobosynthase, GalNAc β 3T: β 1,3N-acetyl
galactosaminyltransferase, GalNAc α 3T: α 1,3N- acetylgalactosaminyl transferase 或Forssman synthase。(Type 4 型前驅物存在於 globo 和 ganglio (神經節)系列的 醣脂上，Type 5 型對應於醣脂乳糖苷神經酰胺(glycolipid lactosylceramide)等)
附圖6 諾羅病毒衣殼蛋白質 VP1 組裝成病毒顆粒模擬圖 [46]
紅色、藍色、黃色皆為相同的S domain (為避免混淆，由 S 與 P domain 所組成 之VP1 僅顯示 S domain，另外，僅圖 B 之白色為 P domain)，當諾羅病毒在組 裝時會以A / B 或 C / C 之呈彎曲或平板的二聚體為最小單位組裝，整個模擬組 裝過程如圖D，5 個 A / B 會組成五角狀，角狀周邊再加入 5 個 C / C。9 組 [5(A/B)+5(C/C)]相當於 90 個 VP1 二聚體會形成一個諾羅病毒顆粒。
A. B.
附圖7 VA387（GII.4）與 HBGA 之結合界面的晶體結構 [106]
(A)以俯視的視角觀察雙體化(各單體 P 蛋白質以白色與灰色表示)之 P 蛋白質與 HBGA (以黃色之三醣(trisaccharides)示意) 結合之介面。(B) 圖為放大(A)圖下方 之結合介面，三個主要結合界面為綠色(位點 I)，紅色(位點 II)和橙色(位點 III)，而淺藍色為會影響結合特異性之胺基酸，接合界面之三糖以 C-青色、O-紅色和N-藍色表示。
附圖8 比較 GII.4 與 GI.1 和 GII.3 之 P 蛋白質結構 [36]
(A) GI.1 P 蛋白質(藍色) 疊加在 GII.4 P 蛋白質(綠色)結構，可觀察到 GII.4 (綠 色)在箭頭所示的 P2 結構中具有三個額外的環狀結構。(B) GII.3 諾羅病毒的同 源模型(深藍色)，疊加在 GII.4 結構上(綠色)，雖然它們非常相似，但 GII.3 結 構在P2 結構中具有一個長環，黑色表示二者相同之位點。
附圖9 嗜甲醇酵母菌甲醇代謝路徑[88]
嗜甲醇酵母菌之甲醇代謝路徑中各個酵素縮寫如下：AOX: alcohol oxidase (EC 1.1.3.13), CAT: catalase (EC 1.11.1.6), FLD: formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.1), FGH: S-formylglutathione hydrolase (EC 3.1.2.12), FDH: formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2), DAS: dihydroxyacetone synthase (EC 2.2.1.3), TPI:
triosephosphate isomerase (EC 5.3.1.1), DAK: dihydroxy-acetone kinase (EC
2.7.1.29), FBA: fructose bisphosphate aldolase (EC 4.1.21.13), FBP: fructose 1,6-bisphosphatase (EC 3.1.3.11), MFS: methylformate synthase; DHA:
dihydroxyacetone, GAP: glyceraldehyde 3-phosphate, DHAP: dihydroxyacetone phosphate, F1,6 BP: fructose 1,6-bisphosphate, F6P: fructose 6-phosphate, Pi:
phosphate, Xu5P: xylulose 5-phosphate, GSH: glutathione, PYR: pyruvate; PPP:
pentose phosphate pathway, TCA: tricarboxylic acid cycle.
附圖10 以西方墨點法偵測原態或帶有組胺酸之 VP1 或 P 蛋白質
左側圖為SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠對照，右側 圖為以His 抗體(上方)或 NoV 抗體(下方)做諾羅病毒蛋白質西方墨點法分析。
以His 抗體，在 pPICZ B (質體負控制組)可辨識到一條約在 60 kDa 之非專一性 內源性蛋白質條帶(‘non-specific’ endogenous protein)，此條帶為帶有連續 11 個 His 之內生 transcriptional regulator YY1 [140]。
附表1 諾羅病毒類病毒顆粒之穩定性研究結果 [45]
諾羅病毒VLP 在不同 pH 值、溫度、離子強度和其它條件下之穩定性比較結 果。
*Method abbreviations: AFM (atomic force microscopy), CD (circular dichroism), DLS (dynamic light scattering), DSC (differential scanning calorimetry), ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), EM (electron microscopy), IMMS (ion mobility mass spectrometry), MS (mass spectrometry), QCM-D (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation), SANS (small-angle neutron scattering), SAXS (small-angle X-ray scattering), UV (ultraviolet) absorption.
附表2 諾羅病毒疫苗的發展現況 [30]
MPL, monophosphoryl lipid A; VLP, virus-like particle.
附表3：不同碳源對嗜甲醇酵母菌 AOX 基因的抑制和去抑制作用。[88]
在不同嗜甲醇酵母菌物種中，相似的酵素雖蛋白質分子量及基質專一性和調控 機制皆相似，但名字卻不同。一樣同為酒精氧化酶但名字卻有AOX: alcohol oxidase, MOX: methanol oxidase, AOD: alcohol oxidase, AUG(同 MOD): alcohol utilizing gene。
其他酵素縮寫FMD: formate dehydrogenase, FLD: formaldehyde dehydrogenase, FDH: formate dehydrogenase, DAS: dihydroxyacetone synthase
Publication
Original paper:
Yu-Ling Chen, Pey-Jium Chang, Ching-Tsan Huang: Small P particles formed by the Taiwan-native norovirus P domain overexpressed in Komagataella pastoris. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102:9707-9718.
Preparing…
Yu-Ling Chen and Ching-Tsan Huang: Establishment of two different purification schemes for tag-free recombinant Norovirus P protein and applied to VP1 protein. 2019
Conference Presentation:
Yu-Ling Chen* and Ching-Tsan Huang: Small P particles formed by Taiwan native norovirus P domain overexpressed in Pichia pastoris and purified by tag-free purification schemes. The 16th Asia-Pacific Biotechnology Congress & International Conference on Cancer Research and Diagnostics, Singapore, 2018 (*Oral presentation)