甲醇代謝調控路徑(MUT pathway)

第一章前言

5.1 甲醇代謝調控路徑(MUT pathway)

由於部分的甲醇代謝(MUT)在過氧化體(peroxisomes)中進行，這個胞器會在甲醇誘導期間大量增生，經甲醇誘導後，可佔80％的細胞質空間[89]。在甲醇利用的第一步中，甲醇會經由酒精氧化酶(alcohol oxidases; AOX, EC 1.1.3.13) 被氧化成formaldehyde (甲醛)和 hydrogen peroxide (過氧化氫)。有毒的過氧化氫 (H2O2)會經由過氧化氫酶(catalase; CAT, EC 1.11.1.6)被分解為氧氣和水，而甲醇代謝生成的氧化物甲醛(formaldehyde)，則有異化作用(dissimilation)和同化作用 (assimilation)二種不同的代謝路徑(如附圖 9)[88]。

在同化作用中，二羥基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase; DAS, 2.2.1.3) 會在過氧化體中將甲醛(formaldehyde)與木酮醣 5-磷酸(xylulose 5-phosphate;

Xu5P)縮合轉化為二個 3 碳的二羥基丙酮(dihydroxyacetone; DHA)和 3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate; GAP)，之後這二個 3 碳代謝物會在細胞質中再進一步代謝產生生物質量(biomass)或能量(經 TCA(tricarboxylic acid cycle);呼吸作用(respiration)等) (如附圖 9)。

而在異化作用中，甲醛(formaldehyde)會自發的與穀胱甘肽(glutathione;

GSH)反應生成 S-羥甲基穀胱甘肽(S-hydroxymethylglutathione)，接著生成物會與需要GSH 與 NAD⁺輔酶的甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase; FLD, EC

1.2.1.1)，以及，和需要 NAD⁺輔酶的甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; FDH, EC 1.2.1.2)產生氧化反應，其中反應產生的 NADH 被認為是在甲醇生長時，能量的來源；S-甲酰基谷氨酸水解酶(S-formylglutatione hydrolase; FGH, EC 3.1.2.12)為將 S-甲酰穀胱甘肽(S-formylglutathione)水解成甲酸(formate)和穀胱甘肽(glutathione)，參與甲醛的去毒和穀胱甘肽的再生之酵素，在異化作用中，經過三個酵素的反應，甲醛會轉化並生成二氧化碳(如附圖 9)。

通常，甲醇代謝調控路徑會被甲醇強烈誘導，但卻會受到葡萄糖和乙醇的 抑制(如附表 3)。在以甲醇誘導的過程中，酒精氧化酶(alcohol oxidases; AOX)、

二羥基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase; DAS)和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; FDH)等關鍵酵素，可占總可溶蛋白質的 30％(AOX)或 20％

(DAS，FDH)在誘導的細胞中[88]。

5.2 Pichia pastoris 表現系統

Pichia pastoris 在 1920 年首次由 A. Guilliermond 於法國栗樹(chestnut tree)

的分泌物中被分離出來，並且一開始被稱為Zygosaccharomyces pastori [90]，此分離株為種(species)模式菌株(type strain) - CBS704 (= NRRL Y-1603)。而後，更多相關的菌種於1955 年，由 H. Phaff 在美國加利福尼亞被陸續的分離出來，並被H. Phaff 稱名為 Pichia pastoris [91]。幾十年後，僅有少數菌株被保留下來，

其中分離自加利福尼亞州黑橡樹的NRRL Y-11430 (CBS7435)，被飛利浦石油公司開發成單細胞蛋白質(single cell protein)的生產平台，作為富含蛋白質食物的成分或替代物，之後該菌株被用作異源蛋白質生產系統開發的基礎[92]。

根據核醣體基因之序列(ribosomal gene sequence)，P. pastoris 在 1995 年被 重新分類成新的一屬(genus)- Komagataella [93]，後來根據 26S rRNA 序列被分成許多的種(species) [94]。目前 Komagataella 有六種種(species) (K. pastoris, K.

phaffii, K. pseudopastoris, K. poluli, K. ulmi, and K. kurtzmanii)[95]，目前建立的

Pichia pastoris 異源蛋白質生產平台皆是以 K. phaffii 或 K. pastoris 菌株為主

[96]。由於不同的 Komagataella 屬(genus)非常相似，並且不易從常規的醱酵或測試中區分，因此目前分類主要為根據有限數量的基因序列比較得知。目前 Invitrogen 公司，嗜甲醇酵母菌表現系統尚以 Pichia pastoris 作為菌株之名稱。

5.2.1 菌株與甲醇表現型 株，並且可分成三種不同的表現型：第一種為Mut⁺(methanol utilization plus)，

此種菌株二種酒精氧化酶(AOX1 及 AOX2)基因皆保留，如野生型 Pichia 菌株 X-33 以及 GS115 (His^-)等，第二種為 Mut^S(methanol utilization slow)，此種菌株為酒精氧化酶2 (AOX2)基因保留，但 AOX1 去除，如 KM71H 與 KM71 (His^-) 菌株等，第三種為Mut^-(methanol utilization minus)，此種菌株二種酒精氧化酶 (AOX1 及 AOX2)基因皆去除，此類菌株無法生長在以甲醇為單一碳源的環境 [98]。雖 Mut⁺菌株甲醇利用率較高，異源蛋白質產量較佳 [97]，但相較 Mut^S需氧量較高、產熱快，較不利於大規模醱酵。此外，AOX 會受到其它碳源的抑制，當培養環境存有葡萄糖、甘油或乙醇時，AOX 啟動子會受到抑制，即使在含有甲醇的環境下(附表 3)[88]。但是目前已有研究，藉由轉錄因子的再程序

化，改變AOX 啟動子上游轉錄因子的調控，目前已開發出改良菌株，AOX 啟動子已不再受抑制性碳源的抑制[99]，目前也已發展出 methanol-free

systems[100]。

由於嗜甲醇酵母菌具有微生物的許多優勢，諸如：生長成本低廉、穩定的基因操作平台、操作簡易、易於工業培養及放大，並且具有真核系統的轉譯後修飾等優勢。因本身為GRAS(Generally Regarded As Safe)物種，不含內毒素、

致癌物質和病毒DNA，因此常做為藥用蛋白質的生產表現宿主[88]。

之6xHis tag，在先前文獻也指出會直接影響蛋白質原始之構形[81-83]、功能 [84, 85]，並引發非專一的免疫反應[86, 87]。

6.2 研究目標

本研究擬利用不具內毒素之嗜甲醇酵母菌 P. pastoris，表現高抗原和高免疫 原性，可做為抗原呈現平台之台灣分離株諾羅病毒GII.4 之 P 蛋白質。具體策略和目標包括：(1)提升 P 蛋白質產量。本研究擬利用實驗室已發展之醱酵槽生產平台，經由三段式培養策略，大量生產P 蛋白質。(2)降低純化過程之勞力與成本，並保留原始P 蛋白質之構形。本研究擬利用 P 蛋白質本身之電性與原態暴露之組胺酸(His)，發展無純化標籤之蛋白質純化系統，並且擬套用此套純化系統，純化外鞘蛋白質VP1。(3)探討台灣分離株 P 與 VP1 蛋白質之顆粒性與生物功能性。純化出的蛋白質擬利用粒徑分析儀及穿透式電子顯微鏡檢測顆粒之大小與形態，並以唾液結合測試(Saliva-binding assay)檢測純化出的 P 與 VP1 顆粒是否具有生物功能。(4)延伸此台灣分離株 P 蛋白質之應用性。本研究擬以綠色螢光蛋白質模擬另一個抗原，並嵌入P 蛋白質之頂端，觀察嵌合型 P 蛋白質是否能再次組成顆粒並發出綠色螢光。本研究之架構如圖1-5。

圖1-5 研究架構

第二章材料與方法

1.培養機與藥品

Low salt LB broth (LSLB)：Lennox L Broth (Alpha Bioscience, Baltimore) 2 g 配置 成100 mL 溶液，121^oC、20 分鐘高溫滅菌後備用。

Luria-Bertani (LB) 培養基：2.5 g LB (Acumedia) 配置成 100 mL 溶液，滅菌後 備用。

LA 平板培養基：於 LB 培養基中添加 1.5% Bacto agar (Acumedia)，滅菌後降溫 至約60^oC 時倒於 9 cm petri dish，待凝固後 4^oC 保存。

10x 葡萄糖 stock solution (20%, w/v)：20 g 葡萄糖 (dextrose, D-Glucose anhydrous, Biotech) 配置成 100 mL 溶液，滅菌後備用。

YPD broth (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)： 1 g yeast extract (YE, Biotech)，及 2 g peptone-A (from meat, Biotech) 加入 90 mL 蒸餾水，滅菌待冷卻後加入10 mL 10x 葡萄糖，4^oC 保存。

YPD 平板培養基：於 YPD 培養基中添加 1.5% agar，滅菌後降溫至約 60^oC 時倒

於9 cm petri dish，待凝固後 4^oC 保存。

Zeocin stock solution (Invitrogen, R250-01)：100 mg/mL，-20^oC 避光保存。

10x 甘油 (10%, w/v)：10 g 甘油 (Glycerol Anhydrous, J.T.Baker) 加水至 100 mL，

滅菌後備用。

10x 磷酸鉀緩衝液 (potassium phosphate buffer, 1M, pH 6.0) (86.8 mM KH2PO4, 13.2 mM K2HPO4)：11.81 g KH2PO4 (Amresco) 及 2.30 g K2HPO4 (Amresco) 配製成100 mL 溶液，以 KOH 顆粒調整 pH 6.0±0.1，滅菌後備用。

500x biotin stock solution (0.02%, w/v)：20 mg D-biotin (Sigma) 溶於 100 mL 蒸 餾水中，以0.22 μm 濾膜過濾滅菌備用，4^oC 保存。

10x 硫酸銨溶液 [(NH4)2SO4, 10 %, w/v]：10 g (NH4)2SO4 (Amresco) 配製成 100 mL 溶液，滅菌後備用。

10x YNB (13.4%, w/v)：3.4 g yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate (YNB, Difco 233520) 及 10 g (NH4)2SO4，溶於100 mL 蒸餾水後，以 0.22 μm 濾膜過濾滅菌，4^oC 避光保存。

BMGY 培養基 (1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 100 mM potassium phosphate pH 6.0, 1% glycerol (醱酵槽為 4%))：1 g YE，2 g Peptone，

溶於70 mL 蒸餾水中，滅菌後加入 10 mL 10xYNB、0.2 mL 500x biotin、10 mL 10x 磷酸鉀緩衝液、10 mL 10x 甘油。

mBMMY 培養基 (0.1% yeast extract, 1% (NH4)2SO4, 100 mM potassium phosphate pH 6.0, 1.0% methanol)：0.1 g YE 溶於 79 mL 蒸餾水中，滅菌後加入 10 mL 10x 硫酸銨、10 mL 10x 磷酸鉀緩衝液，於使用時添加 100%甲醇使終甲醇濃度1%。(The modified buffer was prepared as described in Chen et al. [102]) 微量元素 (Pichia trace metal, PTM4)：2 g/L CuSO4 · 5H2O, 0.08 g/L NaI, 3 g/L Escherichia coli DH5α (GIBCO-BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA))

作為建構與保存質體之宿主細胞。以Luria-Bertani (LB; Difco, Detroit, MI, USA) 液態培養基於37^oC、轉速 250 rpm 振盪培養，或以添加 1.5 % 洋菜膠之固態培養基於 37^oC 培養。

2.2 真菌

本實驗選用購買自 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 嗜甲醇酵母菌 P. pastoris KM71H (Mut^S, his4, AOX1::ARG4, arg4)作為重組蛋白質的表現宿主。以液態培養基YPD，以 30^oC、轉速 250 rpm 振盪培養或以添加 1.5 % 洋菜膠之固態培

VP1、VP1-6xHis、P、P-6x His、P-GFP 皆以 EcoRI 及 XbaI 截切，並接於 pPICZ B 表現載體中。其中 P 來自 VP1 但去除 S (shell domain)及短鉸鏈 (hinge)，並在 N 端帶有 CNGRC 短胜肽。P-GFP 以 P 為骨架，將綠色

(meGFP)(A206K)螢光蛋白分別在 N 端及 C 端加入 SpeI 及 EcoRV 切位並接入已 在T371 及 D374 加入 SpeI 及 EcoRV 之 P loop 2。(圖 2-1)

將建構完成的載體以熱衝擊法 42^oC, 90s 轉形至大腸桿菌勝任細胞，將適量菌液塗於含抗生素的培養基，培養16~18 小時，挑取菌落，以專一性引子進行聚合酶鏈鎖反應，進行洋菜膠體電泳，確認目標片段大小後，將含正確片段之菌落培養於液態培養基中，再依照Plasmid Miniprep purification Kit 操作手冊抽取質體，定序確認序列正確 (Genomic, Taiwan)。

表2-1、質體建構所使用之引子

Primer name Sequence (5’3’) RE

VP1&P

F EcoRI NoV ORF2 GAATTCATGAAGATGGCGTCGAAT EcoRI

F EcoRI ATG CNGRC NoV P GAATTCATGTGTAATGGTCGTTGTTCAAGAAC TAAAC

EcoRI

R ORF2 NoV stop XbaI TCTAGATTATAAAGCACGTCTACGCC XbaI

R ORF2 NoV 6x His stop XbaI TCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTAAA GCACGTCTACG

XbaI

P loop2

R P loop2 SpeI (eGFP) ACTAGTATCGGTACTGAATTGAACACTG SpeI

F (eGFP) EcoRV P loop2 ATCGATATCGATTTTGAAACTCACCAA EcoRV

eGFP

F SpeI eGFP ACTAGTGTGAGCAAGGGCGAGGA SpeI

R eGFP EcoRV GATATCGATCTTGTACAGCTCGTCCA EcoRV

圖2-1、載體建構

(A)圖解基因片段。VP1 為諾羅病毒的主要結構蛋白質(如圖 1-1)；P 為突出區片段(為 P1 及 P2 所組成(如圖 1-1))；P-GFP 為突出區片段在 loop2(如圖 3-1)之位 點以 SpeI 及 EcoRV 嵌入綠色螢光蛋白質 GFP。(B)圖解本研究酵母菌轉形所使 用之五種表現質體。

4. P. pastoris 轉形 分鐘，去除上清液，之後冰上操作，加入50 mL Pre-treat Buffer (100 mM LiOAC, 10 mM DTT, 0.6 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)，重新懸浮菌體，放於 30^oC Manipulator ECM630 Electroporation System (BTX, San Diego, CA, USA)，以 1.5 kV、25 μF、200 Ω 之條件給予電脈衝，完成後加入 1 mL 1 M sorbitol 回溶菌體，

並於30^oC 下靜置培養 1 小時，最後取 250 μL 菌液塗至含有 YPDSZ 篩選培養基中 (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1M sorbitol, 1.5% agar, 100 μg/mL Zeocin)，於 30^oC 下培養 2~3 天。

5. P. pastoris 轉形株篩選與培養 培養基之桌上型 5 L 醱酵槽中(FS-01-A05, Major Science, Saratoga, CA, USA)，培養溫度為 30℃，培養過程以 10% 氨水或 2 N 硫酸調整至 pH 6，通氣量為 4 vvm，

攪拌速率為 800 rpm。培養過程分三階段，分為甘油批次培養(Batch culture)、甘

油饋料批次培養(Fed-batch culture)與甲醇誘導。三階段的轉換為藉由(DO)數值做判定，當碳源用盡，出現DO spike (菌體耗氧速率降低而溶氧數值急速上升)時，

即從批次培養，轉成饋料批次培養，此階段會定速饋入250 mL 之 50% 甘油(含 12 mL/L PTM4)；當甘油再次用盡，出現 DO spike，則進入甲醇誘導階段(100%

Methanol 含 12 mL/L PTM4)。

6.轉形株螢光顯微鏡觀察

將 200 μL 菌液以 200 μL 蒸餾水稀釋後，以螢光顯微鏡 Nikon Eclipse E600 microscope (Nikon, Japan)之 B-2A 濾鏡(EX 450-490, DM 505, BA520)觀察菌體之綠色螢光表現，以UV-2A 濾鏡(EX 330-380, DM 400, BA420) 觀察菌體之藍色螢光表現。

7.異源蛋白質產物純化 7.1 蛋白質萃取

取甲醇誘導 1-5 天後 1.5 mL 之醱酵液，離心後將菌塊與 0.5 mL protein extraction buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.4; 1 mM EDTA; 5% glycerol)混合；或取甲醇誘導3-5 天後之醱酵液，離心後濕重每 1g 之菌塊與 1.5 或 3 mL protein extraction buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.4; 1 mM EDTA; 5%

glycerol)混合；以液態氮研磨成粉破菌，以 13000 g、4^oC 離心 15 分鐘，收集解)，僅 loading 0.002-0.01 mL 跑膠分析(需染一塊 SDS-PAGE 對照比對，若蛋白

質濃度過高，膠體呈色後會成瀑布狀無法分析)。 imidazole)平衡過之帶有藍綠色 Ni 離子 HisTrap HP, Ni-NTA column (GE

Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)，通完蛋白質萃取液之管柱，帶有 6xHis tag 之 VP1 蛋白質以 10、20、50、100、200、500 imidazole (50 mM NaH2PO4,0.3 M NaCl, pH 8 NaOH or HCl adjust pH)沖提，帶有 6xHis tag 之 P 蛋 AKTA fast-performance liquid chromatography (FPLC) (UPC 900/P-920, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)系統進行分析，所使用之緩衝液如表 2-2，因為親和層析法的緩衝液皆含有 0.3 M NaCl 會影響實驗，因此帶有目標蛋白質之沖提液，皆先以Buffer A 以 10 倍體積稀釋。如果樣本為 P 蛋白質粗萃液，並以DEAE 管柱直接以低鹽濃度純化，則管柱通入之蛋白質總量不能太濃，太濃管柱吸附效果不佳，易沖提出高濃度的雜蛋白質，本研究測試之最高

濃度為不超過5 mg (per 5 mL DEAE column)。蛋白質樣本經 FPLC 之通道吸入 FPLC 內，並流經已去除 20%保存酒精及以 ddH2O 清洗過，並以 10 mL 加 5 倍管柱體積(5 mL column×5 fold+10 mL=35 mL) Buffer A 平衡後之 DEAE 管柱。通完蛋白質樣本之管柱，再以Buffer A 流洗至 A280訊號趨近於零(即未結合蛋白質皆流洗完畢)後，利用 Buffer B 依照不同實驗條件拉梯度。得到之不同蛋白質皆

在文檔中利用畢赤氏酵母菌醱酵生產台灣GII.4 2006b型諾羅病毒類病毒顆粒及小型P粒子之純化與性質研究 (頁 31-0)

第一章 前言

5.1 甲醇代謝調控路徑(MUT pathway)

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