穿透式電子顯微鏡…

委託閤康生物科技股份有限公司(Bio Materials Analysis Technology Inc., Hsinchu, Taiwan)進行樣品負染製備及上機分析。將 P、P-His 和 VP1 經膠體層 析分離(Gel filtration-purified)之第 15 mL 和第 9 mL 之沖提液，蛋白質濃度 0.13-0.3 mg/mL，以 4 度低溫冷藏運送至閤康公司進行分析。目標蛋白質以 2%

uranyl acetate 負染，並以 TEM (Hitachi HT7700, Tokyo, Japan)在 accelerating voltage of 100 kV 下觀察。

8.6 粒徑分析

將 P、P-His 和 VP1 經膠體層析分離(Gel filtration-purified)之第 15 mL 和第 9 mL 之沖提液，利用 nanoparticle analyzer HORIBA SZ-100 (Horiba, Kyoto, Japan)粒徑分析儀(DLS; dynamic light scattering)，在室溫下以固定散射角 90°下 偵測。

表2-3、西方墨點法分析所用試劑之組合成分

Constituent Stacking gel (5 ml) 5%

Separating gel (10 ml) 10% 12%

Name Constituent

4x Protein loading dye (pH 6.8)

8% SDS 200 mM Tris-HCl (pH 6.8) 0.4% Bromophenol blue 20% Glycerol 400 mM 2-ME (2-Mercaptoethanol)

Tris-glycine SDS running buffer (pH 8.4)

Coomassie Blue Stain (filter with 0.22 μm)

Coomassie Blue Destain

0.1% (w/v) Coomassie Blue R250 10% Acetic acid

50% Methanol 40% H2O

10% acetic acid 20% methanol 70% H2O

表2-4、酵素連結免疫反應所用試劑之組合成分 50 mM Tris-Base

2.5

第三章、結果 (Loop 1)、T371-D374 (Loop 2)及 D391-T394 (Loop 3) [67]，此外，突出區具有與 人體HBGA 接合之受器(receptor)[105]，藍色粗體為與 HBGA 之三個主要結合 面，分別為位點I (S343-H347)，位點 II (D374)與位點 III (C441-Y444)，而藍色 網底為影響HBGA 結合特異性之位點[35, 106, 107]。當 P 蛋白質形成雙體，任 一側之單體之HBGA 結合位點 I 及 II 會與另一個單體之位點 III 接合，此接合 面能與HBGA 結合，如附圖 7。圖 3-1 之箭頭為 P1 及 P2 之邊界 [107, 108]。

2.結構模擬

台灣分離株 GII.4 型諾羅病毒，其外鞘蛋白質 VP1 序列經交通大學提供之 免費線上(PS)²: Protein Structure Prediction Server (http://ps2.life.nctu.edu.tw/)做結 構預測分析後，經Rasmol version 2.7.5 模擬台灣本土株諾羅病毒 VP1 蛋白質之

根據諾羅病毒爆發與流行之時間，GII.4 型之諾羅病毒藉由 VP1 之高變異 區P domain (突出區)，可再分類成不同的基因亞型(subgenotype)，例如 2006a、

2006b、 2009 及 2012 等[30, 34]。流行於 1987 到 2008 且廣為研究之 16 株 GII.4 型病毒株 [35] (菌株 NCBI GenBank 登錄號：AY038600 (VA387)、

AB220922 (Sakai)、DQ078794 (Hunter 284E)、ADF50100.1 (06Y06BC1)、

ADF50099.1 (06Y06BC2)、GU937455 (00Y96C)、GU937451 (06Yb96C1)、

GU937448 (00Y02C)、GU937449 (03Y02C1)、GU937450 (03Y02C2)、

GU937454 (06Y02C)、GU937456 (02Y02C)、GU937463 (08Y02C)、GU937457 (05Y04C)、GU937458 (06Y06aC1)、GU937459 (06Y06aC2))與本研究之台灣 分離株之P domain (突出區)利用 Clustal Omega 做序列比對

(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，以近鄰相接法(neighbour-joining method)做演化樹(phylogenetic tree)分析，如圖 3-3，台灣分離株最近似於 GII.4 型之2006b。

根據前人研究，圖 3-3 所比較之 16 株 GII.4 型病毒株之 P domain(突出區)，

經大腸桿菌做表現皆能形成由12 個雙體化 P 蛋白質所組成之 P 粒子(P particle) [35]，由 6 個雙體化 P 蛋白質所組成之小型 P 粒子(small P particle)僅發現於 C 端RRR-cluster 突變之 AY038600 (VA387)菌株 [73]。與台灣分離株序列最相近 並同屬2006b 之 ADF50099.1 (06Y06BC2)，胺基酸序列與本研究之菌株僅有四 個差異(residue 84, 119, 136, and 313) (圖 3-4)，並且這四個差異胺基酸也能在 C

圖3-1 台灣分離株 GII.4 型諾羅病毒之 VP1 胺基酸序列

灰色網底為短鉸鏈(hinge)，連接殼區(S domain) (M1-I213)和突出區(P domain) (S222-L540)；藍色實線為跨菌株高度保守區(I48-I52)，黃色星號(I48)為與 VP2 結合之關鍵位點[27]；黑色實線為外來抗原嵌入之三個環狀結構，分別為 Loop 1 (I293-R297)、Loop 2 (T371-D374)及 Loop 3 (D391-T394)；藍色粗體為 HBGA 之結合面，分別為Site I (S343-H347)，Site II (D374)與 Site III (C441-Y444)；藍 色網底為影響HBGA 結合特異性之位點；箭頭所指的為 P1 及 P2 之邊界；方框 為圖3-4 比較出之四個相異胺基酸。

圖3-2 台灣分離株 GII.4 型諾羅病毒之 VP1 蛋白質結構模擬

(A)結構模擬。α-helix 之二級結構由紫紅色表示，β-sheet 之二級結構由黃色表 示，轉折(turns) 為淡藍色，其餘為灰色。(B)各功能性區塊預測。黃色為殼區(S (shell) domain)(含 small N-terminal domain)，青色為短鉸鏈(hinge)，紅色與籃色 各為突出區(P (protruding) domain)之 P1 區(P1 domain)與 P2 區(P2 domain)。P2 區可嵌入外來抗原之三個環狀結構，各以粉紅色呈現，分別為loop1 (最上方)、

loop2 (中間)、 loop3 (最下方)。突出區可與人體 HBGA 接合之位點，各以綠色 呈現分別為Site I (中間)，Site II (最上方)與 Site III (最下方)。

圖3-3 演化樹分析 17 種不同 GII.4 型菌株之 P 胺基酸序列

圖3-4 (A) GII.4 型諾羅病毒之 P domaim 胺基酸序列比較。台灣分離株之原態 P 蛋白質之(B)側視(C、D)俯視四個突變位點之結構模擬

(A)菌株編號：本研究之菌株為 MG049692；同屬 GII.4 2006b 並且胺基酸差異 最少之菌株為ADF50099.1 (06Y06bC2) [35]；能形成小型 P 粒子(small P

particle)之菌株為 AY038600 (VA387)。紅色★為相異之胺基酸，藍色為 P 蛋白質 與HBGA 之三個結合面，箭頭所指的為 P1 及 P2 之邊界。(B)以側視結構模擬 P 蛋白質四個突變位點之位置。(C)以俯視(諾羅病毒以頂部之 P2 區與 HBGA 接 合)結構模擬 P 蛋白質四個突變之胺基酸位置。(D)以俯視模擬雙體之 P 蛋白質 (左邊為一單體，黃色外暈為另一單體)。圖 A 比對出之四個相異胺基酸以紅色 圓球表示，綠色為與HBGA 結合之三個位點。白色為蛋白質之主體構形，藍色 為N 端端點，黃色為 C 端端點。台灣分離株 P 胺基酸序列經 (PS)²: Protein Structure Prediction Server (http://ps2.life.nctu.edu.tw/)做結構預測分析後，經 Rasmol version 2.7.5 模擬呈現。

二、 組胺酸標籤(6xHis)之 P 蛋白質生產、純化及顆粒分析 蛋白質，以含有50、100 及 300 mM immidazol 之沖提液分別做流洗後，P-His 目標蛋白質可在含有300 mM immidazol 之沖提液沖提出(圖 3-5B)。

3.物性分析

將 300 mM immidazol 所沖提出之 P-His 蛋白質萃取液，以 3 kDa 濃縮管柱 做體積濃縮後，利用蛋白質純化分離柱Superose 6 increase 依蛋白質大小做分 離，不同分子量蛋白質將於不同餾分(每個餾分為 1 mL，第 1 mL 餾分為 0-1 mL，第 2 mL 餾分為 1.01-2 mL；後面以此類推)沖提出來，沖提出之不同餾分 之蛋白質分子量大小以標準品做管柱校準。每個餾分皆各取13 μL 以 SDS-PAGE 做分析。從圖 3-6A 結果可觀察到，多聚體 P-His 蛋白質主要在 670 kDa 及158 kDa 間沖提出來。為進一步了解訊號最強之第 15 mL 餾分所沖提出之 P-His 其粒徑大小及外觀形態，以動態光散射粒徑分析儀（dynamic light scattering, DLS）的分析結果可觀察到，NoV P-His 之粒徑大小主要在 15 nm (圖 3-6B)，並 且與穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscopy, TEM）所觀察的大小 一致，從穿透式電子顯微鏡結果顯示，15 mL 餾分所沖提出之 P-His 主要以三

角形、四角形及環狀的構形為主(圖 3-6C)。綜合上述之實驗結果，台灣本土分 離出之諾羅病毒P-His 以酵母菌表現並純化後，主要以 12 個 P 蛋白質單體所構 成之分子量約420 kDa 之小 P 粒子(small P particle)形態為主，粒徑大小約再 15 nm 間。

4.功能性分析

本試驗以 B 型之成人唾液做諾羅病毒 HBGA 結合測試，從試驗結果可看 到，P-His 蛋白質經 His-Trap 管柱純化後經膠體層析之第 15 mL 餾分所沖提出 之小型P 粒子，能結合 HBGA，並且吸附效果隨著蛋白質濃度增加而增加，吸 附能力也與唾液濃度成正比，當唾液稀釋200 倍下，比稀釋 1000 倍更有較強之 吸附能力(圖 3-7)。

圖3-5 轉形株 P-His (A)以搖瓶誘導表現及(B)以 His-Trap 管柱純化 (A)每個樣品為 10 μg 之蛋白質粗萃液以 12.5% SDS-PAGE 做分析。左側

〝Cultivation〞為總培養時間，〝Methanol〞為甲純誘導時間。上層圖為以 His 抗體偵測隨誘導時間增加之胞內P 蛋白質，中層圖為 GAPDH (MW ~36 kDa) 抗體偵測之內控制組 (internal control)，以 Coomassie Brilliant Blue 染色之 SDS-PAGE 膠圖結果，為蛋白質跑膠對照。(B) Lane O 及 OC 為粗萃液及蛋白質通過 管柱之流洗液，Lane 50 到 300 為含有 50、100 及 300 mM immidazol 之沖提 液，約36 kDa 之 P-His 蛋白質在含有 300 mM immidazol 之沖提液可純化出。

上層圖為以NoV 抗體做西方墨點法分析，下層圖為 SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠對照。

圖3-6 純化之 P-His 蛋白質物理特性分析

(A) 黑色實線為蛋白質純化分離柱 Superose 6 increase，分析經 His-Trap 管柱純 化之P-His 蛋白質之沖提結果，藍色虛線為以標準品做管柱校準之沖提結果，

左上方為SDS-PAGE 分析不同餾分(每個餾分為 1 mL)之膠圖。(B)動態光散射粒 徑分析儀(DLS)分析經純化分離柱於第 15 mL 之餾分。(C)穿透式電子顯微鏡 (TEM)分析經純化分離柱於第 15 mL 餾分之 P-His 蛋白質。右下方比例尺為 20 nm。

圖3-7 HBGA 結合測試

B 型之成人唾液與小型 P 粒子(純化分離柱分離之第 15 mL 之餾分)之結合測試 結果。實心圓圈為不同濃度之B 型唾液，實線為 1:200，虛線 1:1000；空心三 角形為PBS (用為稀釋不同濃度之唾液)，在此為不加唾液下，做為負對照組。

三、 原態P 蛋白質之生產、純化及顆粒分析 養(fed batch phase)及甲醇誘導培養(methanol-induction phase))，大量生產諾羅病 毒P 蛋白質。如圖 3-10，在甘油批次培養(glycerol batch phase)階段，培養基一

開始配製的4%甘油，約在 15-16 小時間會被消耗完，為恆定培養環境的 pH，

期間甘油代謝所產生的酸，會以饋入鹼(10%氨水)做 pH 的恆定以及作為額外補 充的氮源來源，當碳源不足菌體代謝趨緩，溶氧值(DO)會急遽跳升。當第一個 Spike 出現後，即進入甘油饋料批式培養(glycerol-fed batch phase)階段，此時菌 體正快速分裂及成長，代謝甘油效率極佳，因此溶氧值變化十分劇烈，為避免 溶氧(DO)過低對菌體造成傷害，根據溶氧的跳升，250 mL 之 50%甘油，設定在 溶氧值(DO)5-50 間緩慢饋入，並在約 7-8 小時間可完全饋完；為了使菌體提前 適應甲醇，使 AOX1 promoter 能加速去抑制[98, 112]，~0.5 mL/L 的甲醇在甘油 饋完前1~2 小時前加入。當甘油再次消耗完畢，第二個 Spike 出現，生菌數可 達到8 × 10⁹ cfu/mL，並且在甲醇誘導培養期(methanol-induction phase)皆無顯著 變化，在菌體尚未完全適應碳源轉換前，大量添加甲醇會對菌體造成生存壓 力，為讓菌體逐步適應甲醇，在碳源切換的第一個小時，甲醇饋料的速度設定 在1 mL/h/L，之後每 30 分鐘以各 1.4、1.8、2.2、2.6 及 3 mL/h/L 梯度方式逐步 拉升甲醇的饋料速度，並以終3 mL/h/L 流速持續誘導 120 小時，期間嗜甲醇酵 母菌以異化路徑代謝甲醇(dissimilatory pathway)，會產生甲酸(formic acid)及二 氧化碳等酸性物質(附圖 9)[113]，本實驗目標 P 蛋白質的生產量與前人結果一致 [114]會與鹼及甲醇的添加量成正比。利用三明治酵素免疫法(ELISA)以純化的 P-His 蛋白質做為標準品，做蛋白質定量分析，誘導 120 小時之 P 蛋白質醱酵槽 產量可達到220 mg/L。

圖3-8 高表現量 P 轉形株塞選

(A)以梯度 Zeocin 抗性濃度塞選轉形株。(B)以小量培養塞選高表現之 P 轉形 株；轉形株經快速破菌後，上層圖為以NoV 抗體(ab80024)做西方墨點法分析，

下層圖為SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠對照。

圖3-9 轉形株 P (A) 23 及 30°C (B) 30°C 之誘導培養

(A) 23 及 30°C 二種不同誘導溫度之比較。1L 之 BMGY 培養液待離心去除菌液 後，菌體以200 mL 之 mBMMY 置換，平分成各 100 mL 以搖瓶做二種不同溫 度之誘導培養。(B)較佳(30°C)誘導溫度之培養。左側〝Cultivation〞為總培養時 間，〝Methanol〞為甲醇誘導時間。〝Anti-NoV〞為以 NoV 抗體偵測隨誘導時間 增加之胞內約35 kDa 之 P 蛋白質。〝GAPDH〞 (MW ~36 kDa) 為以 GAPDH 抗 體偵測之內控制組 (internal control)。下層以 Coomassie Brilliant Blue 染色之 SDS-PAGE 膠圖，為蛋白質跑膠對照。

圖3-10 以醱酵槽大量生產 P 蛋白質

(A)醱酵參數及饋料。酸鹼值變化(黑線)、溶氧值變化(紅線)、溫度變化(紫 線) 、甲醇饋料總累加量(藍線)、鹼(10%氨水)饋料總累加量(綠線)。(B)菌體生 長及菌量變化。生菌數(total viable counts；CFU/mL) (黑色圓圈)、溼重(g/mL) (黃色三角形) 、菌體濁度(optical density；OD600) (紫色方塊)。(C) P 蛋白質在醱 酵槽中之誘導累加。各4 μg 之蛋白質粗萃液以 SDS-PAGE 做分析；左側

〝Cultivation〞為總培養時間，〝Methanol〞為甲醇誘導時間。上層圖為以 NoV 抗體偵測隨誘導時間增加之胞內約35 kDa 之 P 蛋白質，中層圖為 GAPDH (MW

~36 kDa) 抗體偵測之內控制組 (internal control)，以 Coomassie Brilliant Blue 染 色之SDS-PAGE 膠圖結果，為蛋白質跑膠對照。

2.開發無標籤純化策略

3-13E)，從圖 3-13C 之 SDS-PAGE 膠圖及西方墨點分析可觀察到，P 蛋白質可在 0 M (NH4)2SO4沖提出來，將不同管柱之0 M (NH4)2SO4沖提液收集於同一管(圖 3-13F)，並以 LC-MS/MS 做分析，如圖 3-13G 顯示，純化出之 P 蛋白質有 38%

之胺基酸序列符合台灣分離株之P 胜肽片段。從 LC-MS/MS 及西方墨點法分析 之結果顯示，P 蛋白質可藉由離子交換管柱以一次的線性沖提，及二次的階梯

之胺基酸序列符合台灣分離株之P 胜肽片段。從 LC-MS/MS 及西方墨點法分析 之結果顯示，P 蛋白質可藉由離子交換管柱以一次的線性沖提，及二次的階梯