策略二:利用原態之組氨酸純化

目標蛋白質可藉由原生暴露在表面之一個以上的組胺酸，利用組胺酸之 histidyl residues 與 His-Trap 管柱之吸附，直接純化[116, 117]。相同的菌株，以 不同的培養條件及培養策略，會使宿主之酸蛋白質、鹼蛋白質及原態即具有組

槽之醱酵液，以陰離子交換管柱(DEAE)以低鹽 0.12 M NaCl 沖提之沖提液，經 濃縮後以SDS-PAGE 分析可觀察到純度皆可超過 90% (圖 3-16 G&J)。此套純化 方法可以明顯觀察到相同之轉形株，經不同之生產策略所誘導生產之醱酵液，

宿主之酸鹼、親疏水性蛋白質分布有明顯不同，並進而使純化後之目標蛋白質 純度有所差異。雖分布不同，但利用陰離子交換管柱以低鹽濃度(0.12 M)所沖提 出之 P 蛋白質，純度卻皆一致的高於 90%，此結果與策略一相似。

圖3-14 台灣分離株 GII.4 型諾羅病毒之在 N 端具有 CNGRC 之原態(P)及嵌有組 胺酸之P 蛋白質(P-6xHis)之組胺酸預測結構圖。白色為預測之蛋白質主體構 形，綠色為組胺酸，藍色為N 端端點。P 及 P-His 之胺基酸序列經 (PS)²: Protein Structure Prediction Server (http://ps2.life.nctu.edu.tw/)做結構預測分析後，

經Rasmol version 2.7.5 模擬。

圖3-15 轉形株 P 之(A)搖瓶(B)醱酵槽之醱酵液以 His-Trap 管柱純化

Lane O 及 OC 為粗萃液及蛋白質通過管柱的流洗液，Lane 10 為含有 10 mM imidazole 之沖提液，P 蛋白質在含有 100 mM imidazole 之沖提液可沖提出。上 層圖為以NoV 抗體做西方墨點法分析；下層圖為 SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠對照；紅色箭頭為 P 蛋白質之位置。

圖3-16 轉形株 P 之(A-G)搖瓶及(H-J)醱酵槽之沖提液以陰離子交換管柱(DEAE) 二次純化

(A、B)經 His-Trap 管柱純化後之搖瓶醱酵液再以陰離子交換管柱純化之線性沖 提圖譜。(C、D)經 His-Trap 管柱純化後之搖瓶醱酵液再以陰離子交換管柱純化 之0.15 與 0.4 M 二段式階梯式沖提圖譜。(E、F)經 His-Trap 管柱純化之搖瓶醱 酵液再以陰離子交換管柱純化之0.12 與 0.4 M 二段式階梯式沖提圖譜。(H、I) 經His-Trap 管柱純化後之醱酵槽醱酵液再以陰離子交換管柱之 0.12 與 0.4 M 二 段式階梯式沖提純化圖譜。(A、C、E、H)沖提圖譜；黑色實線為沖提結果，藍 色實線為流動相B 之拉提圖譜。(B、D、F、I)沖提液之分析結果；“Anti-NoV”

為以NoV 抗體偵測 P 蛋白質；SDS-PAGE 為以 Coomassie Brilliant Blue 染色分 析不同餾分。(G、J)沖提液 0.12 M NaCl 之餾分經濃縮後以 SDS-PAGE 分析；

紅色箭頭為P 蛋白質之位置。

表3-1 諾羅病毒醱酵槽 P 蛋白質之回收與純度表

3.物性分析

為了解 P 顆粒之大小，本研究以破菌後之 P 蛋白質粗萃液與純化後之 P 蛋 白質沖提液，利用膠體層析，分析P 蛋白質之顆粒大小及含量。將經二次純化 後之0.4 M NaCl 沖提出之 P 蛋白質萃取液，以 3 kDa 濃縮管柱做體積濃縮後，

利用蛋白質純化分離柱Superose 6 increase 依蛋白質大小做分離，不同分子量蛋 白質將於不同餾分(每個餾分為 1 mL，第 1 mL 餾分為 0-1 mL，第 2 mL 餾分為

以動態光散射粒徑分析儀（dynamic light scattering, DLS）的分析結果可觀察 到，NoV P 之粒徑大小主要在 14 nm (圖 3-17C)，並且與穿透式電子顯微鏡

（transmission electron microscopy, TEM）所觀察的大小一致，從穿透式電子顯 微鏡結果顯示，15 mL 餾分所沖提出之 P 主要以三角形、四角形及環狀的構形

唾液濃度成正比，當唾液稀釋200 倍下，比稀釋 1000 倍更有較強之吸附能力 (圖 3-18)。

圖3-17 純化之 P 蛋白質物理特性分析

(A)黑色實線為純化分離柱 Superose 6 increase，分析經 His-Trap 及 DEAE 管柱 純化之P 蛋白質沖提結果，藍色虛線為以標準品做管柱校準之沖提結果。(B) SDS-PAGE 為以 Coomassie Brilliant Blue 染色分析不同餾分。(C)動態光散射粒 徑分析儀分析經純化分離柱於第15 mL 之餾分。(D)穿透式電子顯微鏡分析經純 化分離柱於第15 mL 之餾分，右下方比例尺為 20 nm。

圖3-18 HBGA 結合測試

B 型之成人唾液與小型 P 粒子(純化分離柱第 15 mL 之餾分)之結合測試結果。

實心圓圈為不同濃度之B 型唾液，實線為 1:200，虛線 1:1000；空心三角形為 PBS (用為稀釋不同濃度之唾液)，在此為不加唾液下，做為負對照組。

圖3-19 粗萃之 P 蛋白質顆粒性分析

(A)黑色實線為純化分離柱 Superose 6 increase，分析粗萃之 P 蛋白質沖提結 果，藍色虛線為以標準品做管柱校準之結果。(B) “Anti-NoV”為以 NoV 抗體偵 測P 蛋白質，SDS-PAGE 為以 Coomassie Brilliant Blue 染色分析不同餾分。(C) 以LC-MS/MS 分析在(B)圖中，紅色箭頭所指之 35 kDa 條帶。結果顯示有 73%

與P 蛋白質胜肽一致(紅色粗體)。

四、 嵌有綠色螢光之原態P 蛋白質之生產及物性功能性分析 1. P. pastoris 生產

嵌有綠色螢光之 P 酵母菌轉形株(P-GFP)，經 1%甲醇誘導 96 小時，離心以 液態氮做菌體破菌後，取粗萃取液蛋白質進行西方墨點法分析，由蛋白質印跡 結果可觀察到，P-GFP 蛋白質可在約 63 kDa 觀察到。

2.物性與功能性分析

如圖 3-20，嵌有綠色螢光之 P 蛋白質，在藍光視野(450-490 nm)下，可觀 察到明顯的綠色螢光，而負對照組皆無觀察到任何螢光表現。直接將破菌後之 P-GFP (分子量 62.8 kDa)粗萃液以純化分離柱 Superose 6 increase 分析。12 個單 體(小型 P 粒子)所構成之 P-GFP 嵌合顆粒，總分子量預測為 753.6 kDa，從圖 3-21 可觀察到大量的 P-GFP 蛋白質可形成 P-GFP 嵌合顆粒，可在超過 670 kDa 之13 mL 餾分(每個餾分為 1 mL，第 1 mL 餾分為 0-1 mL，第 2 mL 餾分為 1.01-2 mL；後面以此類推)沖提出來(圖 3-21)。綜合上述之實驗結果，嵌有綠色 螢光之P 蛋白質不但能形成嵌合顆粒，還能發出綠色螢光，顯示台灣分離株諾 羅病毒P 蛋白質能做為外來抗原呈現平台。

圖3-20 螢光顯微鏡觀察嵌有綠色螢光諾羅病毒類病毒顆粒(P-GFP)之酵母菌轉 形株

Bright field 為明視野；Blue light field 為波長 450-490 nm 藍光激發，曝光 3 秒下 拍攝。上層圖比例尺為100 μm；中層圖比例尺為 10 μm；下層圖比例尺為 100 μm。Control 為不帶有 P-GFP 之負控制組。

圖3-21 P-GFP 嵌合蛋白質之顆粒性分析

(A)黑色實線為蛋白質純化分離柱 Superose 6 increase，分析 P-GFP 粗萃液蛋白 質之沖提結果，藍色虛線為以標準品做管柱分子量校準之沖提結果。(B)不同餾 分之分析膠圖。上層圖為以NoV 抗體做諾羅病毒蛋白質西方墨點法分析，下層 圖為SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠對照。(C)以 LC-MS/MS 分析在(B)圖 SDS-PAGE 中，紅色箭頭所指之 63 kDa 條帶。結果顯示有 53%與 P-GFP 蛋白質胜肽一致(紅色粗體)。綠色框為綠色螢光蛋白質之胺基酸 序列，藍色框為酵素接合位，其餘皆為P 蛋白質。

五、 組胺酸標籤(6xHis)VP1 蛋白質之生產與純化 1. P. pastoris 生產

嵌有組胺酸之 VP1 酵母菌轉形株(VP1-6xHis)，經 1%甲醇誘導 96 小時，離 心以液態氮做菌體破菌後，取粗萃取液蛋白質進行西方墨點法分析，由蛋白質 印跡結果可觀察到，VP1 蛋白質可在約 58.9 kDa 觀察到。

2.以組胺酸標籤(6xHis)純化

將帶有 VP1-His 之酵母菌轉形株，以搖瓶做培養，經 1%甲醇誘導四天後，

離心取菌塊，以液態氮做菌體破菌後，取粗萃取液利用His-Trap 管柱純化 VP1-His 蛋白質，以含有 50、100 及 300 mM immidazol 之沖提液分別做流洗後，

VP1-His 可在含有 200 mM immidazol 之沖提液沖提出(圖 3-22)。並且從圖 3-22 可觀察到，與文獻一致，目標VP1-His 蛋白質條帶具有二條片段，約在 58 與 55 kDa，而 55 kDa 來自於尚未釋放到培養基之前的末端裂解 VP1 [119]。VP1-His 之 200 mM immidazol 沖提液將用於原態 VP1 定量之標準品。

圖3-22 轉形株 VP1-His 醱酵液以 His-Trap 管柱純化

(A)Lane O 及 OC1、OC2 為粗萃液及蛋白質通過管柱的二次流洗液，Lane 10 到 100 為含有 10、20、50、100 及 200 mM immidazol 之沖提液，VP1-His 蛋白質 在含有200 mM immidazol 之沖提液可純化出。上層圖為以 NoV 抗體做西方墨 點法分析，下層圖為SDS-PAGE 以 Coomassie Brilliant Blue 染色做蛋白質跑膠 對照。

六、 原態VP1 蛋白質之生產、純化及顆粒分析 1. P. pastoris 生產

原態之 VP1 酵母菌轉形株，經 1%甲醇誘導 96 小時，離心以液態氮做菌體 破菌後，取粗萃取液蛋白質進行西方墨點法分析，由蛋白質印跡結果可觀察 到，VP1 蛋白質(pI 5.54)可在約 58.9 kDa 觀察到。利用三段式的醱酵策略(分別 為批次培養(batch phase)、饋料批次培養(fed batch phase)及甲醇誘導培養

(methanol-induction phase))，大量生產諾羅病毒 VP1 蛋白質。利用三明治酵素 免疫法(ELISA)以純化的 VP1-His 蛋白質做為標準品，做蛋白質定量分析，誘導 120 小時之 VP1 蛋白質醱酵槽產量為 15.5 mg/L。

2.利用原態之組氨酸純化

目標蛋白質可藉由原生暴露在表面之一個以上的組胺酸，利用組胺酸之 histidyl residues 與 His-Trap 管柱之吸附，直接純化[116, 117]。本研究利用原態 之VP1 蛋白質本身具有之組胺酸(圖 3-23)，以 His-Trap 管柱直接純化。相比起

以100 kDa 濃縮管柱做體積濃縮後，利用蛋白質純化分離柱 Superose 6 increase 依蛋白質大小做分離，不同分子量蛋白質將於不同餾分(每個餾分為 1 mL，第 1 mL 餾分為 0-1 mL，第 2 mL 餾分為 1.01-2 mL；後面以此類推)沖提出來，沖提 出之不同餾分之蛋白質分子量大小以標準品做管柱校準。每個餾分以 SDS-PAGE 做分析。成功組成顆粒之 VP1，由 90 個 VP1 二聚體所構成，總分子量約

10,800 kDa，從圖 3-24 B&C 結果可觀察到，VP1 蛋白質主要在超過 670 kDa 之 9 mL 沖提出來。而構成顆粒之基礎，二聚體 VP1，分子量約 120 kDa，亦可在 圖譜之17 mL 與宿主之雜蛋白質一起沖提出來。結果顯示台灣分離株諾羅病毒 VP1 蛋白質經二次純化後，能成功組成顆粒之第 9 mL 餾分，回收率為

20.1±1.9%。後續物性與功能性分析皆選用能成功組成顆粒之第 9 mL 餾分所沖 提出之VP1。

3.物性分析

VP1 蛋白質能成功組成顆粒及濃度最高之第 9 mL 餾分所沖提出之 VP1 其 粒徑大小及外觀形態，以動態光散射粒徑分析儀（dynamic light scattering, DLS）的分析結果可觀察到，NoV VP1 之粒徑大小主要在 47 nm (圖 3-25A)，並 且與穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscopy, TEM）所觀察的大小 一致，從穿透式電子顯微鏡結果顯示，9 mL 餾分所沖提出之 VP1 能成功組成 顆粒(圖 3-25B)。綜合上述之實驗結果，台灣本土分離出之諾羅病毒 VP1 以酵 母菌表現並純化後，能成功組成顆粒，粒徑大小在47 nm 間。

4.功能性分析

本試驗以 B 型之成人唾液做諾羅病毒 HBGA 結合測試，從試驗結果可看 到，VP1 蛋白質經二次純化後，能成功組成顆粒之膠體層析第 9 mL 餾分所沖 提出之粒子，能結合HBGA，並且吸附效果隨著蛋白質濃度增加而增加，吸附

本試驗以 B 型之成人唾液做諾羅病毒 HBGA 結合測試，從試驗結果可看 到，VP1 蛋白質經二次純化後，能成功組成顆粒之膠體層析第 9 mL 餾分所沖 提出之粒子，能結合HBGA，並且吸附效果隨著蛋白質濃度增加而增加，吸附