菌株與甲醇表現型

株，並且可分成三種不同的表現型：第一種為Mut⁺(methanol utilization plus)，

此種菌株二種酒精氧化酶(AOX1 及 AOX2)基因皆保留，如野生型 Pichia 菌株 X-33 以及 GS115 (His^-)等，第二種為 Mut^S (methanol utilization slow)，此種菌株 為酒精氧化酶2 (AOX2)基因保留，但 AOX1 去除，如 KM71H 與 KM71 (His^-) 菌株等，第三種為Mut^- (methanol utilization minus)，此種菌株二種酒精氧化酶 (AOX1 及 AOX2)基因皆去除，此類菌株無法生長在以甲醇為單一碳源的環境 [98]。雖 Mut⁺菌株甲醇利用率較高，異源蛋白質產量較佳 [97]，但相較 Mut^S需 氧量較高、產熱快，較不利於大規模醱酵。此外，AOX 會受到其它碳源的抑 制，當培養環境存有葡萄糖、甘油或乙醇時，AOX 啟動子會受到抑制，即使在 含有甲醇的環境下(附表 3)[88]。但是目前已有研究，藉由轉錄因子的再程序

化，改變AOX 啟動子上游轉錄因子的調控，目前已開發出改良菌株，AOX 啟 動子已不再受抑制性碳源的抑制[99]，目前也已發展出 methanol-free

systems[100]。

由於嗜甲醇酵母菌具有微生物的許多優勢，諸如：生長成本低廉、穩定的 基因操作平台、操作簡易、易於工業培養及放大，並且具有真核系統的轉譯後 修飾等優勢。因本身為GRAS(Generally Regarded As Safe)物種，不含內毒素、

致癌物質和病毒DNA，因此常做為藥用蛋白質的生產表現宿主[88]。

之6xHis tag，在先前文獻也指出會直接影響蛋白質原始之構形[81-83]、功能 [84, 85]，並引發非專一的免疫反應[86, 87]。

6.2 研究目標

本研究擬利用不具內毒素之嗜甲醇酵母菌 P. pastoris，表現高抗原和高免疫 原性，可做為抗原呈現平台之台灣分離株諾羅病毒GII.4 之 P 蛋白質。具體策 略和目標包括：(1)提升 P 蛋白質產量。本研究擬利用實驗室已發展之醱酵槽生 產平台，經由三段式培養策略，大量生產P 蛋白質。(2)降低純化過程之勞力與 成本，並保留原始P 蛋白質之構形。本研究擬利用 P 蛋白質本身之電性與原態 暴露之組胺酸(His)，發展無純化標籤之蛋白質純化系統，並且擬套用此套純化 系統，純化外鞘蛋白質VP1。(3)探討台灣分離株 P 與 VP1 蛋白質之顆粒性與生 物功能性。純化出的蛋白質擬利用粒徑分析儀及穿透式電子顯微鏡檢測顆粒之 大小與形態，並以唾液結合測試(Saliva-binding assay)檢測純化出的 P 與 VP1 顆 粒是否具有生物功能。(4)延伸此台灣分離株 P 蛋白質之應用性。本研究擬以綠 色螢光蛋白質模擬另一個抗原，並嵌入P 蛋白質之頂端，觀察嵌合型 P 蛋白質 是否能再次組成顆粒並發出綠色螢光。本研究之架構如圖1-5。

圖1-5 研究架構

第二章 材料與方法

1.培養機與藥品

Low salt LB broth (LSLB)：Lennox L Broth (Alpha Bioscience, Baltimore) 2 g 配置 成100 mL 溶液，121^oC、20 分鐘高溫滅菌後備用。

Luria-Bertani (LB) 培養基：2.5 g LB (Acumedia) 配置成 100 mL 溶液，滅菌後 備用。

LA 平板培養基：於 LB 培養基中添加 1.5% Bacto agar (Acumedia)，滅菌後降溫 至約60^oC 時倒於 9 cm petri dish，待凝固後 4^oC 保存。

10x 葡萄糖 stock solution (20%, w/v)：20 g 葡萄糖 (dextrose, D-Glucose anhydrous, Biotech) 配置成 100 mL 溶液，滅菌後備用。

YPD broth (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)： 1 g yeast extract (YE, Biotech)，及 2 g peptone-A (from meat, Biotech) 加入 90 mL 蒸餾水，滅菌待冷卻 後加入10 mL 10x 葡萄糖，4^oC 保存。

YPD 平板培養基：於 YPD 培養基中添加 1.5% agar，滅菌後降溫至約 60^oC 時倒

於9 cm petri dish，待凝固後 4^oC 保存。

Zeocin stock solution (Invitrogen, R250-01)：100 mg/mL，-20^oC 避光保存。

10x 甘油 (10%, w/v)：10 g 甘油 (Glycerol Anhydrous, J.T.Baker) 加水至 100 mL，

滅菌後備用。

10x 磷酸鉀緩衝液 (potassium phosphate buffer, 1M, pH 6.0) (86.8 mM KH2PO4, 13.2 mM K2HPO4)：11.81 g KH2PO4 (Amresco) 及 2.30 g K2HPO4 (Amresco) 配製 成100 mL 溶液，以 KOH 顆粒調整 pH 6.0±0.1，滅菌後備用。

500x biotin stock solution (0.02%, w/v)：20 mg D-biotin (Sigma) 溶於 100 mL 蒸 餾水中，以0.22 μm 濾膜過濾滅菌備用，4^oC 保存。

10x 硫酸銨溶液 [(NH4)2SO4, 10 %, w/v]：10 g (NH4)2SO4 (Amresco) 配製成 100 mL 溶液，滅菌後備用。

10x YNB (13.4%, w/v)：3.4 g yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate (YNB, Difco 233520) 及 10 g (NH4)2SO4，溶於100 mL 蒸餾水後，以 0.22 μm 濾膜過濾滅菌，4^oC 避光保存。

BMGY 培養基 (1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 100 mM potassium phosphate pH 6.0, 1% glycerol (醱酵槽為 4%))：1 g YE，2 g Peptone，

溶於70 mL 蒸餾水中，滅菌後加入 10 mL 10xYNB、0.2 mL 500x biotin、10 mL 10x 磷酸鉀緩衝液、10 mL 10x 甘油。

mBMMY 培 養 基 (0.1% yeast extract, 1% (NH4)2SO4, 100 mM potassium phosphate pH 6.0, 1.0% methanol)：0.1 g YE 溶於 79 mL 蒸餾水中，滅菌後加入 10 mL 10x 硫酸銨、10 mL 10x 磷酸鉀緩衝液，於使用時添加 100%甲醇使終甲醇 濃度1%。(The modified buffer was prepared as described in Chen et al. [102]) 微量元素 (Pichia trace metal, PTM4)：2 g/L CuSO4 · 5H2O, 0.08 g/L NaI, 3 g/L Escherichia coli DH5α (GIBCO-BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA))

作為建構與保存質體之宿主細胞。以Luria-Bertani (LB; Difco, Detroit, MI, USA) 液態培養基於37^oC、轉速 250 rpm 振盪培養，或以添加 1.5 % 洋菜膠之固態培 養基於 37^oC 培養。

2.2 真菌

本實驗選用購買自 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 嗜甲醇酵母菌 P. pastoris KM71H (Mut^S, his4, AOX1::ARG4, arg4)作為重組蛋白質的表現宿主。以液態培 養基YPD，以 30^oC、轉速 250 rpm 振盪培養或以添加 1.5 % 洋菜膠之固態培

VP1、VP1-6xHis、P、P-6x His、P-GFP 皆以 EcoRI 及 XbaI 截切，並接於 pPICZ B 表現載體中。其中 P 來自 VP1 但去除 S (shell domain)及短鉸鏈 (hinge)，並在 N 端帶有 CNGRC 短胜肽。P-GFP 以 P 為骨架，將綠色

(meGFP)(A206K)螢光蛋白分別在 N 端及 C 端加入 SpeI 及 EcoRV 切位並接入已 在T371 及 D374 加入 SpeI 及 EcoRV 之 P loop 2。(圖 2-1)

將建構完成的載體以熱衝擊法 42^oC, 90s 轉形至大腸桿菌勝任細胞，將適 量菌液塗於含抗生素的培養基，培養16~18 小時，挑取菌落，以專一性引子進 行聚合酶鏈鎖反應，進行洋菜膠體電泳，確認目標片段大小後，將含正確片段 之菌落培養於液態培養基中，再依照Plasmid Miniprep purification Kit 操作手冊 抽取質體，定序確認序列正確 (Genomic, Taiwan)。

表2-1、質體建構所使用之引子

Primer name Sequence (5’3’) RE

VP1&P

F EcoRI NoV ORF2 GAATTCATGAAGATGGCGTCGAAT EcoRI

F EcoRI ATG CNGRC NoV P GAATTCATGTGTAATGGTCGTTGTTCAAGAAC TAAAC

EcoRI

R ORF2 NoV stop XbaI TCTAGATTATAAAGCACGTCTACGCC XbaI

R ORF2 NoV 6x His stop XbaI TCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTAAA GCACGTCTACG

XbaI

P loop2

R P loop2 SpeI (eGFP) ACTAGTATCGGTACTGAATTGAACACTG SpeI

F (eGFP) EcoRV P loop2 ATCGATATCGATTTTGAAACTCACCAA EcoRV

eGFP

F SpeI eGFP ACTAGTGTGAGCAAGGGCGAGGA SpeI

R eGFP EcoRV GATATCGATCTTGTACAGCTCGTCCA EcoRV

圖2-1、載體建構

(A)圖解基因片段。VP1 為諾羅病毒的主要結構蛋白質(如圖 1-1)；P 為突出區片 段(為 P1 及 P2 所組成(如圖 1-1))；P-GFP 為突出區片段在 loop2(如圖 3-1)之位 點以 SpeI 及 EcoRV 嵌入綠色螢光蛋白質 GFP。(B)圖解本研究酵母菌轉形所使 用之五種表現質體。

4. P. pastoris 轉形 分鐘，去除上清液，之後冰上操作，加入50 mL Pre-treat Buffer (100 mM LiOAC, 10 mM DTT, 0.6 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)，重新懸浮菌體，放於 30^oC Manipulator ECM630 Electroporation System (BTX, San Diego, CA, USA)，以 1.5 kV、25 μF、200 Ω 之條件給予電脈衝，完成後加入 1 mL 1 M sorbitol 回溶菌體，

並於30^oC 下靜置培養 1 小時，最後取 250 μL 菌液塗至含有 YPDSZ 篩選培養基 中 (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1M sorbitol, 1.5% agar, 100 μg/mL Zeocin)，於 30^oC 下培養 2~3 天。

5. P. pastoris 轉形株篩選與培養 培養基之桌上型 5 L 醱酵槽中(FS-01-A05, Major Science, Saratoga, CA, USA)，培 養溫度為 30℃，培養過程以 10% 氨水或 2 N 硫酸調整至 pH 6，通氣量為 4 vvm，

攪拌速率為 800 rpm。培養過程分三階段，分為甘油批次培養(Batch culture)、甘

油饋料批次培養(Fed-batch culture)與甲醇誘導。三階段的轉換為藉由(DO)數值做 判定，當碳源用盡，出現DO spike (菌體耗氧速率降低而溶氧數值急速上升)時，

即從批次培養，轉成饋料批次培養，此階段會定速饋入250 mL 之 50% 甘油(含 12 mL/L PTM4)；當甘油再次用盡，出現 DO spike，則進入甲醇誘導階段(100%

Methanol 含 12 mL/L PTM4)。

6.轉形株螢光顯微鏡觀察

將 200 μL 菌液以 200 μL 蒸餾水稀釋後，以螢光顯微鏡 Nikon Eclipse E600 microscope (Nikon, Japan)之 B-2A 濾鏡(EX 450-490, DM 505, BA520)觀察菌體之 綠色螢光表現，以UV-2A 濾鏡(EX 330-380, DM 400, BA420) 觀察菌體之藍色 螢光表現。

7.異源蛋白質產物純化 7.1 蛋白質萃取

取甲醇誘導 1-5 天後 1.5 mL 之醱酵液，離心後將菌塊與 0.5 mL protein extraction buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.4; 1 mM EDTA; 5% glycerol)混 合；或取甲醇誘導3-5 天後之醱酵液，離心後濕重每 1g 之菌塊與 1.5 或 3 mL protein extraction buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.4; 1 mM EDTA; 5%

glycerol)混合；以液態氮研磨成粉破菌，以 13000 g、4^oC 離心 15 分鐘，收集 解)，僅 loading 0.002-0.01 mL 跑膠分析(需染一塊 SDS-PAGE 對照比對，若蛋白

質濃度過高，膠體呈色後會成瀑布狀無法分析)。 imidazole)平衡過之帶有藍綠色 Ni 離子 HisTrap HP, Ni-NTA column (GE

Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)，通完蛋白質萃取液之管柱，帶有 6xHis tag 之 VP1 蛋白質以 10、20、50、100、200、500 imidazole (50 mM NaH2PO4,0.3 M NaCl, pH 8 NaOH or HCl adjust pH)沖提，帶有 6xHis tag 之 P 蛋 AKTA fast-performance liquid chromatography (FPLC) (UPC 900/P-920, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)系統進行分析，所使用之緩衝液如表 2-2，因為親和層析法的緩衝液皆含有 0.3 M NaCl 會影響實驗，因此帶有目標蛋 白質之沖提液，皆先以Buffer A 以 10 倍體積稀釋。如果樣本為 P 蛋白質粗萃 液，並以DEAE 管柱直接以低鹽濃度純化，則管柱通入之蛋白質總量不能太 濃，太濃管柱吸附效果不佳，易沖提出高濃度的雜蛋白質，本研究測試之最高

濃度為不超過5 mg (per 5 mL DEAE column)。蛋白質樣本經 FPLC 之通道吸入 FPLC 內，並流經已去除 20%保存酒精及以 ddH2O 清洗過，並以 10 mL 加 5 倍 管柱體積(5 mL column×5 fold+10 mL=35 mL) Buffer A 平衡後之 DEAE 管柱。通 完蛋白質樣本之管柱，再以Buffer A 流洗至 A280訊號趨近於零(即未結合蛋白質 皆流洗完畢)後，利用 Buffer B 依照不同實驗條件拉梯度。得到之不同蛋白質皆 以Bradford (Bio-Rad)定量法測定濃度。

7.4 疏水性層析純化

以疏水性層析管柱 (GE Healthcare HiTrap^TM Phenyl HS column ×1 mL)，利 用AKTA fast-performance liquid chromatography (FPLC) (UPC 900/P-920,

Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)系統進行分析，所使用之緩衝 液如表2-2，為使目標蛋白質之疏水性區域與膠體結合上，上機前目標樣本皆先 用AKTA fast-performance liquid chromatography (FPLC) (UPC 900/P-920,

Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)系統進行分析。轉形株蛋白質 粗萃液上機前須先以0.22 μm 濾膜過濾；而純化液則以 3 kDa 或 100 kDa 濃縮

管柱做體積濃縮後，上機前再以13,000 g 離心 10 分鐘，確認無沉澱物後，將粗 萃液或純化液打入已去除20%保存酒精及以 ddH2O 清洗過，並以 2 倍管柱體積 之流動相(25 mM NaH2PO4, 0.15 M NaCl, pH 7.5)平衡後之蛋白質膠體純化分離 柱。打入樣品之管柱以流動相(25 mM NaH2PO4, 0.15 M NaCl, pH 7.5)沖提，不 同分子量蛋白質將於不同餾分(每個餾分為 1 mL，第 1 mL 餾分為 0-1 mL，第 2 mL 餾分為 1.01-2 mL；後面以此類推)沖提出來，後利用標準品做管柱校準 (Catalog # 151-1901, Bio-Red)，以便参照對比樣品的分子量。

表2-2 層析所使用之緩衝液

Name Constituent g/L

Ion-exchange chromatography

Buffer A (pH 8.5) 20 mM Tris-HCl 2.42

Buffer B (pH 8.5) 20 mM Tris-HCl 1 M NaCl

2.42 58.44 Hydrophobic interaction

chromatography (HIC)

Buffer A (pH 7) 10 mM Tris-HCl 1 M (NH4)2SO4

1.21 132

Buffer B (pH 7) 10 mM Tris-HCl 1.21

Buffer C (pH 7) 10 mM Tris-HCl 2 M (NH4)2SO4

1.21 264

8.異源蛋白質分析 8.1 西方墨點法

配置上層 5% SDS 聚丙醯胺焦集膠體和下層 10%-12.5%聚丙醯胺分離膠 體，架設於直立式電泳槽 (Hoefer TM Dual Gel Caster; Amersham Biosciences, USA)，內外槽加入適量 Tris-glycine SDS running buffer。取轉形株蛋白質萃取 液與protein loading dye 混和均勻，於 99^oC 作用 10 分鐘，冷卻後注入上層膠 10000-5000 倍之 anti-NoV 一次抗體(張沛鈞教授研究室提供之自製單株抗體或 ab80024, Abcam)或 anti-GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GTX100118, GeneTex, Irvine, CA, USA)或 anti-6xHis (HIT001R, Bioman, Jhonghe, Taipei, Taiwan)或稀釋 9000 倍之 anti-GFP 一次抗體 (ab6556, Abcam) 於室溫振 盪60 分鐘。去除一次抗體，以 PBST 震盪清洗 3 次，每次 10 分鐘。加入 gelatin-NET 稀釋 2000 倍之 goat anti- mouse IgG AP 或 goat anti- mouse IgG HRP 或稀釋 18000 倍之 goat anti-rabbit IgG AP (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)二次抗體於室溫振盪 60 分鐘，再以 PBST buffer 振盪清洗三次，每次 10 分鐘。最後AP 之二抗以 AP buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH9.5) 浸泡十分鐘，加上 NBT/BCIP 基質溶液避光反應，待呈色清楚後，以蒸 餾水清洗PVDF 膜終止反應，並至 60^oC 烘箱乾燥。而 HRP 之二抗以 Western Lighting^TM Plus-ECL 基質呈色，並以 UVP AutoChemi Image System (UVP,

Upland, CA, USA)攝影。上述使用試劑之配方 (表 2-3)。

8.2 LC-MS/MS

委託華安醫學股份有限公司( ENERGENESIS BIOMEDICAL CO., LTD., Taipei, Taiwan)進行蛋白質鑑定及比對分析。蛋白質以 LTQ-Orbitrap mass

spectrometer (Thermo Scientific, Basingstoke, UK)分析，MS/MS 訊號以 MASCOT (www.matrixscience.com)分析，搜索參數：Enzyme, trypsin; Fixed modification, Carbamidomethylation, Pyridylethylation; Variable modifications, Deamidation, Oxidation; Peptide MS tolerance, ± 20 ppm; Fragment MS tolerance, ± 1 Da and allowance of one missed cleavage。

8.3 Indirect ELISA

實驗所有緩衝液皆以ddH2O 配置。以新鮮配置的 Coating buffer 稀釋待測

實驗所有緩衝液皆以ddH2O 配置。以新鮮配置的 Coating buffer 稀釋待測